楊宗政,孫 煒,張?zhí)煊?孫 靜,孟 珠,吳志國,3

(1.天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院,天津 300457; 2.天津科技大學(xué) 海洋與環(huán)境學(xué)院,天津 300457;3.天津市鹵水化工與資源生態(tài)化利用重點(diǎn)實驗室,天津 300457;4.遠(yuǎn)大健康科技(天津)有限公司,天津 301699)

甲醛作為重要的化工材料和有機(jī)溶劑,廣泛用于生產(chǎn)化纖地毯、塑料地磚、油漆、涂料等各種建筑材料[1]。但甲醛已被各類環(huán)保機(jī)構(gòu)列為一類致癌物質(zhì),能與人體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合,使其凝固,嚴(yán)重危害人體健康[2-3]。目前針對甲醛污染,已有一些典型的治理方法,例如催化法[4]、吸附法[5]和生物法[6]等。其中,生物法主要以環(huán)境中的具有相應(yīng)耐受功能或降解能力的細(xì)菌或真菌為處理材料,能夠保證較低的成本,在實際甲醛廢水的處理中相比催化、吸附等物理化學(xué)方法,更能達(dá)到理想的效果,而且處理后不會產(chǎn)生額外的有毒有害污染物。因此,甲醛的生物降解已成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

近年來,國內(nèi)外研究者就如何利用微生物降解甲醛進(jìn)行大量的研究,篩選出多種菌株,有甲基桿菌(Methylobacteriumsp.)[7]、假單胞菌(Pseudomonassp.)[8]和芽孢桿菌(Bacillussp.)[9]等,但降解能力強(qiáng)弱不一,主要是由于在高質(zhì)量濃度甲醛(≥200 mg/L)環(huán)境下,微生物活性將受到抑制,降解能力下降。韓茜等[10]通過馴化培養(yǎng)(甲醛質(zhì)量濃度由2.5 mg/L逐步升高至20 mg/L)分離出1株BacillusamyloliquefaciensXF-1,完全降解100 mg/L的甲醛需34 h。張弘馳等[11]以黃芪作為菌源,馴化并篩選出降解甲醛的內(nèi)生真菌溜曲霉AL06(甲醛馴化質(zhì)量濃度由50 mg/L逐步提高至100 mg/L),該菌140 h對200 mg/L甲醛的降解率為85.3%。張明等[12]固定培養(yǎng)基甲醛質(zhì)量濃度,反復(fù)轉(zhuǎn)接馴化,最終分離出1株甲基營養(yǎng)菌,44 h可將300 mg/L甲醛完全降解。現(xiàn)有報道多為馴化培養(yǎng)甲醛降解微生物,且物種種類較少,降解甲醛能力有限,鮮有研究對菌株的降解動力學(xué)進(jìn)行分析,因此,優(yōu)化馴化條件,篩選具有優(yōu)良安全性及降解能力的新種屬菌株對甲醛降解微生物多樣性具有重要的推動作用。

本文取天津某污水處理廠的好氧池活性污泥,在實驗室逐步馴化甲醛降解菌,篩選出一株具有優(yōu)良甲醛耐受性及降解能力的菌株A.marplatensisWY0,研究其在不同培養(yǎng)條件(接種量、溫度、pH值、鹽度、初始甲醛質(zhì)量濃度、碳源、氮源)下的生長及甲醛降解效果,并通過three-half-order方程動力學(xué)模型與WY0的降解數(shù)據(jù)相擬合以探究菌株生長和初始甲醛質(zhì)量濃度之間的關(guān)系,研究結(jié)果可推進(jìn)無色桿菌的降解多樣性并為甲醛污染的原位修復(fù)提供重要種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

本研究所用活性污泥取自天津某污水處理廠好氧池,該污泥顆粒結(jié)構(gòu)緊湊,經(jīng)測定污泥質(zhì)量濃度(MLSS)為3 000～4 000 mg/L,污泥SV30為30%～35%。

1.1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/mL):NaCl 0.001 g,NH4Cl 0.001 34 g,K2HPO40.001 g,KH2PO40.000 5 g,MgSO4·7H2O 0.000 2 g,調(diào)節(jié)適合的pH,定容至一定體積,121 ℃ 20 min滅菌后備用。

LB培養(yǎng)基(g/mL):牛肉膏0.005 g,蛋白胨0.010 g,NaCl 0.005 g,定容至一定體積,121 ℃ 20 min滅菌后備用。

固體培養(yǎng)基:液體培養(yǎng)基中加入適量的瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 菌種富集與馴化

將適量活性污泥加入到100 mL無菌水中連續(xù)培養(yǎng)(搖床溫度調(diào)整為30 ℃,轉(zhuǎn)速調(diào)整為180 r/min),培養(yǎng)2 h后從菌懸液中取10 mL接種于LB培養(yǎng)基中,相同條件下培養(yǎng)24 h,取10 mL富集菌液(用無機(jī)鹽溶液置換LB溶液)接種到90 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(含10 mg/L甲醛)中,待培養(yǎng)液明顯渾濁后,取培養(yǎng)液10 mL轉(zhuǎn)接于含有20 mg/L甲醛的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中。在同樣的培養(yǎng)條件下按梯度不斷提高甲醛質(zhì)量濃度反復(fù)富集馴化,直至甲醛質(zhì)量濃度提升至100 mg/L,將最后一次具有明顯渾濁現(xiàn)象的富集液涂布于含有一定量甲醛的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基,選擇菌落形態(tài)良好的菌株保種后進(jìn)行下一步實驗。

1.2.2 菌株生長曲線和甲醛降解率測定

(1)菌株生長曲線測定。取適量菌株種子活化液于LB培養(yǎng)基(使初始OD600≈0.01)中連續(xù)培養(yǎng)(搖床溫度調(diào)整為30 ℃,轉(zhuǎn)速調(diào)整為180 r/min)。取樣時間為2 h,測定菌液樣品的OD600,繪制WY0的生長曲線,并采用SGompertz模型[13-14]擬合生長過程。通過公式(1)與公式(2)計算菌株的最大比生長速率U,并通過R2評價模型擬合度。

ln(Nt)/N0)=a×exp{-exp[-kx(x-xc)]}

(1)

由此可以得到U的計算公式:

U=a×k/e

(2)

式中,t為時間,h;Nt和N0分別表示在時間t時和初始時間時的微生物數(shù)量,CFU/g;xc為達(dá)到最大生長速率的時間,h;a為最大菌數(shù)Nt和初始菌數(shù)N0的差值;k為xc時的相對生長速率;e=2.718 2。

(2)甲醛質(zhì)量濃度測定。采用乙酰丙酮法測定甲醛質(zhì)量濃度[15]。根據(jù)該方法將制備好的樣品在60 ℃中水浴15 min,測量樣品的OD414(需將樣品冷卻至室溫),設(shè)置去離子水樣品作為CK對照,得到樣品的OD414值后,利用公式(3)計算甲醛降解率[16]。

(3)

式中,OD0為未接菌樣品在414 nm處的吸光度,OD1為接種WY0樣品在414 nm處的吸光度。

1.2.3 菌株鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

(1)形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定。將菌株接種于固體LB培養(yǎng)基中觀察其菌落形態(tài),采用掃描電鏡(JSM-IT300LV)在10 000×下觀察菌株WY0的形態(tài)特征。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定學(xué)手冊》測定菌株部分生理生化指標(biāo)。

(2)16S rDNA序列鑒定。取在LB培養(yǎng)基中生長至對數(shù)生長期的菌液,用試劑盒法對該菌的基因組DNA進(jìn)行提取,以提取的基因組DNA為模板,采用細(xì)菌通用引物(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘇州安升達(dá)生物科技有限公司測序,將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對,并采用鄰接法構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹,獲得菌株WY0的生物學(xué)地位。

1.2.4 菌株生長及降解甲醛特性

以100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基(含甲醛200 mg/L)為基礎(chǔ),設(shè)置不同體積比的接種量(4%、6%、8%、10%、12%和14%)、不同培養(yǎng)溫度(15、20、25、30、35、40和45 ℃)、不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10)、不同NaCl質(zhì)量濃度(10、20、30、40、50和60 g/L)、不同外加碳氮源(葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉、蛋白胨、尿素、硫酸銨)進(jìn)行單因素實驗,設(shè)置培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速為180 r/min進(jìn)行菌液培養(yǎng),間隔2 h取一次樣,測定各個樣品的OD414與OD600,并計算甲醛降解率,最終確定其最適宜的甲醛降解條件。

菌株在不同初始甲醛質(zhì)量濃度下的降解,根據(jù)以上實驗確定的最佳接種量、溫度、pH值以及NaCl質(zhì)量濃度接種于不同初始甲醛質(zhì)量濃度(200～1 000 mg/L)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,在180 r/min的培養(yǎng)箱中間隔2 h取一次樣,測定培養(yǎng)基中的生物量和甲醛含量,以上實驗均重復(fù)3次。

1.2.5 甲醛降解動力學(xué)分析

在微生物降解甲醛的過程中,降解底物甲醛既作為微生物的唯一碳源,又因為其毒性會對微生物生長產(chǎn)生抑制作用,因此本研究采用three-half-order動力學(xué)方程[17]來描述不同初始甲醛質(zhì)量濃度的降解動力學(xué),如公式(4)所示:

(4)

式中:t為時間,h;St為t時的甲醛質(zhì)量濃度,mg/L;S0為初始甲醛質(zhì)量濃度,mg/L;k1為一階速率常數(shù);k2為二階速率常數(shù)。

用Origin軟件將實驗數(shù)據(jù)與動力學(xué)方程擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醛降解菌的篩選與鑒定

通過甲醛培養(yǎng)基培養(yǎng)、篩選分離得到其中對甲醛降解能力最強(qiáng)的菌株,將其命名為WY0。WY0為革蘭氏陰性菌,菌落表面平整,不透明,菌體為桿狀,大小在1.8～2.0 μm,菌株WY0的掃描電鏡照片及具體的菌落形態(tài)如圖1所示,菌株的生理生化結(jié)果如表1所示。

表1 菌株的生理生化實驗結(jié)果

圖1 菌株WY0在LB培養(yǎng)基及掃描電鏡下的形態(tài)(10 000×)

菌株WY0的16Sr DNA序列進(jìn)化樹如圖2所示。菌株WY0與馬氏無色桿菌(A.marplatensisEU150134)相似性為99.85%,根據(jù)同源性結(jié)果分析該菌株為馬氏無色桿菌(A.marplatensis)。該菌株的基因序列已提交至NCBI,其注冊號為ON872520。

圖2 菌株WY0的16S rDNA序列進(jìn)化樹

2.2 菌株的生長曲線及模型擬合

菌株WY0的生長曲線如圖3所示。菌株整個生長過程中存在4 h的遲緩期,隨后生長速率快速提高,在4～8 h達(dá)到最大,隨之進(jìn)入對數(shù)生長期,直至第24小時達(dá)到對數(shù)生長期末期,此階段培養(yǎng)基中WY0的菌密度在2.0上下波動。經(jīng)過SGompertz模型擬合,R2=0.98,通過公式(1)、公式(2)計算得到菌株的xc為3.44 h;最大比增長速率U=a×k/e=0.603。

圖3 SGompertz模型擬合的Achromobacter sp.WY0的生長曲線

2.3 接種量對菌株WY0降解甲醛的影響

從圖4可以看出,當(dāng)接種量體積分?jǐn)?shù)為4%時,18 h內(nèi)對200 mg/L甲醛的降解率為69.4%,并且前6 h存在明顯的降解遲緩期,當(dāng)接種量體積分?jǐn)?shù)逐步增加至6%～8%時,菌株的甲醛降解效率顯著提升,對應(yīng)的遲緩期也逐步縮短;當(dāng)接種量體積分?jǐn)?shù)為10%～12%時,18 h內(nèi)WY0可將培養(yǎng)基中200 mg/L的甲醛完全降解,而當(dāng)接種量體積分?jǐn)?shù)為14%時,甲醛降解效率有所降低,僅有92.35%。顯然,適當(dāng)提升接種量有助于提高微生物的甲醛降解效率,但過高的接種量對會加劇微生物之間的競爭關(guān)系,導(dǎo)致降解效率下降。綜合考慮選擇體積分?jǐn)?shù)10%作為實驗中菌株WY0的最佳接種量。

圖4 不同接種量對菌株WY0生長及降解甲醛的影響

2.4 溫度對菌株WY0降解甲醛的影響

從圖5可以看出,菌株最適生長和降解甲醛的溫度為30 ℃(甲醛降解率為99.75%、OD600為0.9),并且在25～35 ℃對200 mg/L的甲醛降解率都在85%以上,同時菌株也呈現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)。同時由圖5也可知,該菌株在15 ℃降解率為15.3%,在45 ℃降解率為20.1%且生物量也很低,這可能是因為溫度過高和過低都會使與甲醛降解的酶活性降低甚至失活,使菌株代謝速率變慢,從而影響菌株對甲醛的降解。

圖5 溫度對菌株WY0生長及降解甲醛的影響

2.5 pH對菌株WY0降解甲醛的影響

pH對WY0甲醛降解效果、菌密度的影響如圖6所示。當(dāng)pH 3～6時,pH與甲醛降解率、WY0菌密度呈現(xiàn)正向相關(guān)性,在pH 6時,WY0在18 h的OD600值達(dá)到最高,為0.9,甲醛的降解率也達(dá)到最大;當(dāng)pH 6～10時,pH與甲醛降解率、WY0菌密度呈現(xiàn)負(fù)向相關(guān)性,堿性條件嚴(yán)重抑制WY0對甲醛的降解。因此WY0的最適甲醛降解pH為6。

圖6 pH對菌株WY0生長及降解甲醛的影響

2.6 NaCl質(zhì)量濃度對菌株WY0降解甲醛的影響

由圖7可知,當(dāng)培養(yǎng)基的NaCl為10 g/L時,菌株WY0對甲醛的降解率最高,為99.25%。隨著鹽度的增加,菌株WY0的生長情況及對甲醛的降解率也隨之降低。當(dāng)鹽分為20～30 g/L時,鹽度的提高對菌株的生長抑制作用相對較小,甲醛去除率的下降幅度不大,該菌可適合此含鹽廢水環(huán)境。當(dāng)鹽分增加至40～60 g/L時,菌株對甲醛的去除率影響較大,尤其是在鹽度為60 g/L時,甲醛去除率下降至20%以下?？赡茉蚴浅啕}度破壞菌株細(xì)胞滲透壓平衡,再加上甲醛本身對菌株的毒害作用,使菌株在不良環(huán)境下難以生存,代謝緩慢,對WY0去除甲醛產(chǎn)生明顯的抑制作用。

圖7 NaCl對菌株WY0生長及降解甲醛的影響

2.7 外加碳氮源對菌株WY0降解甲醛的影響

不同碳氮源對WY0降解甲醛的影響如圖8所示。添加碳氮源對菌株WY0降解甲醛具有顯著影響,含有外加碳氮源的實驗組相同時間對甲醛的降解率均高于對照組。顯然,WY0更容易利用葡萄糖,葡萄糖實驗組菌株的甲醛速率最快,12 h即可完全降解200 mg/L的甲醛。外加碳氮源為菌株WY0提供了更豐富的營養(yǎng)環(huán)境,進(jìn)而促進(jìn)其對甲醛的降解。

圖8 外加碳氮源對菌株WY0降解甲醛的影響

2.8 菌株WY0生長與甲醛降解

WY0降解200 mg/L甲醛過程中其生長狀態(tài)與甲醛質(zhì)量濃度隨時間的變化曲線(最優(yōu)降解條件下)見圖9。由圖9可知,WY0經(jīng)歷了近4 h的遲緩期,在此期間甲醛質(zhì)量濃度下降緩慢,4 h后進(jìn)入快速降解階段,甲醛質(zhì)量濃度快速下降,并在18 h后達(dá)到穩(wěn)定期,此時培養(yǎng)基中WY0的菌密度達(dá)到0.93,甲醛的降解率也達(dá)到99.2%,整個降解過程中甲醛降解速率保持穩(wěn)定。

圖9 最佳條件下菌株WY0的生長及甲醛降解曲線

2.9 甲醛降解率動力學(xué)

菌株在不同初始甲醛質(zhì)量濃度下隨時間的變化如圖10所示。當(dāng)初始甲醛質(zhì)量濃度為200 mg/L時,WY0完成降解過程需18 h。隨著初始甲醛質(zhì)量濃度的不斷提高,菌株的遲緩期也相應(yīng)增加。當(dāng)甲醛質(zhì)量濃度為500 mg/L時,WY0的降解過程受到一定程度抑制,50 h才達(dá)到98.71%的降解率。而初始甲醛質(zhì)量濃度為900 mg/L時,菌株降解甲醛的時間進(jìn)一步增加。隨著甲醛質(zhì)量濃度進(jìn)一步提升至1 000 mg/L,菌株WY0無法正常降解甲醛。實驗結(jié)果表明,甲醛質(zhì)量濃度高于900 mg/L時,菌株WY0的生長和降解過程受到明顯抑制,遲緩期大大延長。

為了模擬WY0降解甲醛的動力學(xué)行為,采用Three-Half-Order對WY0在不同初始甲醛質(zhì)量濃度下的降解過程進(jìn)行擬合,不同初始甲醛質(zhì)量濃度下three-half-order模型方程擬合結(jié)果如圖11所示,模型回歸參數(shù)統(tǒng)計結(jié)果如表2所示。相關(guān)系數(shù)(R2)值均大于0.96,表明WY0的甲醛降解過程與three-half-order模型良好吻合。

(a)～(i)分別為甲醛質(zhì)量濃度200～1 000 mg/L。

3 討論與結(jié)論

探究了不同環(huán)境因子對WY0菌株降解甲醛的影響及其降解動力學(xué),分別從接種量、溫度、pH、NaCl質(zhì)量濃度、碳氮源種類及不同初始甲醛質(zhì)量濃度下菌株WY0的降解過程等方面展開討論。

接種量大小會對菌株降解底物的過程產(chǎn)生直接的影響,接種量過小會使菌株生長緩慢;接種量大時,會增加反應(yīng)體系的負(fù)荷[18]。WY0接種量體積分?jǐn)?shù)為4%、6%、8%時,甲醛降解效率明顯偏低,難以抵抗甲醛的毒害作用,而接種量體積分?jǐn)?shù)為12%、14%時,相對于10%接種量WY0的降解效率并沒有顯著提升,這很好地印證了上述結(jié)論。

溫度是影響微生物生長繁殖的重要因素,溫度不適合可能導(dǎo)致酶功能受損,最終減緩生物代謝,導(dǎo)致甲醛降解緩慢且效率低下[19]。WY0具有典型的嗜中溫的特點(diǎn),在30 ℃的條件下有著極為高效的甲醛降解能力,與Li等[20]由土壤中篩選的甲醛降解菌相一致。

pH影響菌株對碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及生理生化酶的活性[21],pH對菌株降解甲醛的影響研究結(jié)果也表明,pH對甲醛降解菌WY0的生長情況和降解性能具有較為顯著的影響,且菌株WY0對甲醛的降解率與其生長情況呈正相關(guān),這與孔芳等[22]的研究相似。

NaCl質(zhì)量濃度過高容易使微生物發(fā)生鹽析作用,對其胞內(nèi)生理生化酶與代謝活性造成破壞,抑制其生長[23]。一旦微生物生長環(huán)境中鹽質(zhì)量濃度超標(biāo),極易降低微生物對甲醛的處理效率。本研究中菌株WY0的最佳NaCl質(zhì)量濃度為10 g/L,說明相比低鹽或無鹽條件,菌株在一定鹽濃度條件下更容易生長,這與顏培等[24]的研究結(jié)果相似。此外,菌株WY0雖然能耐受一定的鹽質(zhì)量濃度(30 g/L),但超過其耐受范圍時,超高濃度的鹽離子會抑制微生物的呼吸系統(tǒng)及酶系統(tǒng),對菌株代謝活動產(chǎn)生不利影響[25],使其甲醛降解效率嚴(yán)重降低。

不同甲醛質(zhì)量濃度下的降解過程均可分為兩個階段:初始遲緩期和快速降解期[26],兩階段的降解程度又取決于初始甲醛質(zhì)量濃度。菌株WY0在最佳降解條件下對200 mg/L甲醛的降解過程中,存在4 h的短期遲緩期,而后保持穩(wěn)定的降解速率直至降解完成,而周雪媚等[27]篩選的甲醛降解菌Pseudomonasputida在降解400 mg/L甲醛的過程中前8 h反應(yīng)迅速,無遲緩期,但在8 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,降解速率大幅降低,相比之下菌株WY0表現(xiàn)出良好的降解穩(wěn)定性。

動力學(xué)過程分析顯示,菌株WY0對不同含量甲醛的降解過程與Three-Half-Order模型良好吻合,k1隨著甲醛質(zhì)量濃度的增大呈現(xiàn)減小的趨勢,說明在甲醛質(zhì)量濃度增大的過程中一階降解速率隨之減少,但并未對不同質(zhì)量濃度下快速降解期的降解速率產(chǎn)生明顯影響。

基于上述特性,A.marplatensis(WY0)在甲醛污染修復(fù)領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價值,但不能忽視其生物安全性。參考《人間傳染的病原微生物名錄》的分類原則,WY0為微生態(tài)活菌中除芽孢桿菌與條件致病菌以外的范疇,屬于第四類病原微生物,是通常不會引起人或動物發(fā)生疾病的微生物[28],且對植物具有良好的健康促進(jìn)作用[29-30],具有較高的生物安全性及研究價值。

本研究從活性污泥中分離出一株甲醛降解菌,經(jīng)鑒定分析為無色桿菌屬(Achromobactersp.),命名為WY0,其最大生長速率所需時間xc為3.44 h(SGompertz模型),相關(guān)性系數(shù)R2為0.989。WY0能夠在18 h完全降解200 mg/L的甲醛,在接種量10%,生長溫度30 ℃,pH 6的條件下甲醛降解效果最佳。其降解不同初始質(zhì)量濃度甲醛動力學(xué)與Three-Half-Order動力學(xué)模型擬合良好,相關(guān)性系數(shù)(R2)均大于0.96,一階速率常數(shù)k1與甲醛質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)。WY0在耐鹽性、甲醛降解效率、安全性等特性方面均具有較大的優(yōu)勢,可作為良好的甲醛污染治理材料。