趙金玉,吳育滔,龍見坤,陳祥盛,常志敏,3

(1.貴州大學(xué)昆蟲研究所,貴陽 550025; 2.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州省動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 動物科學(xué)學(xué)院,貴陽 550025; 3.貴州大學(xué)昆蟲資源開發(fā)利用省級特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽 550025)

種群遺傳分化現(xiàn)狀是種質(zhì)資源保護(hù)及開發(fā)利用的基礎(chǔ),形態(tài)遺傳標(biāo)記法及mtDNA標(biāo)記法是研究蜜蜂遺傳分化的主流方法。形態(tài)遺傳標(biāo)記法因具有形象直觀、節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn),常結(jié)合主成分分析、聚類分析、關(guān)聯(lián)分析等方法,廣泛應(yīng)用于蜜蜂種群形態(tài)分化及分化機(jī)制研究[1-4]。mtDNA標(biāo)記法基于蜜蜂線粒體DNA母系遺傳的特點(diǎn),即蜂群中所有工蜂與蜂王具有相同的線粒體DNA,一只工蜂mtDNA便可代表整個蜂群,具有采樣量少、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[5],并結(jié)合mtDNA堿基組成、遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育等分析方法,亦被廣泛應(yīng)用于蜜蜂種間遺傳分化研究[6-8];尤其mtDNA COⅠ～COⅡ片段或其間部分序列作為有效片段被諸多學(xué)者用于蜜蜂遺傳分化研究[9-11]。

中華蜜蜂(ApisceranaceranaFabricius)是我國本土獨(dú)有的蜜蜂品種,除新疆外,在全國絕大多數(shù)地區(qū)廣泛分布,因其善于利用零星蜜源植物、采集力強(qiáng)且利用率高,特別適合我國南方丘陵及山區(qū)飼養(yǎng)[12]。各地中華蜜蜂在進(jìn)化過程中與當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境相適應(yīng),形成了不同的地理生態(tài)型。貴州省分布有高原、山地、丘陵等多種地貌類型,森林資源豐富,生境復(fù)雜,為飼養(yǎng)中華蜜蜂的優(yōu)良選地,目前貴州省中華蜜蜂保有量84.35萬群,占全國中華蜜蜂總量的12.57%以上,占全省蜂群92.73%,本土中華蜜蜂蜂種與貴州氣候環(huán)境相適應(yīng),主要為華中型和云貴高原型[13]。近年來,貴州省大力發(fā)展蜂產(chǎn)業(yè),人工育王普遍,流動放蜂頻繁,加之從廣東、福建等外地大量引種,造成貴州省本土中華蜜蜂的蜂種資源流失及雜交混亂等問題愈加嚴(yán)重,增加了貴州本土中華蜜蜂蜂種保護(hù)難度。自然保護(hù)區(qū)是保護(hù)物種資源的重要分布地,貴州省涵蓋國家級、省級及地縣各級自然保護(hù)區(qū)89個,但貴州自然保護(hù)區(qū)內(nèi)中華蜜蜂蜂種保護(hù)情況關(guān)注較少。駱群等[14]和于瀛龍等[15]分別利用形態(tài)標(biāo)記法和微衛(wèi)星標(biāo)記法對貴州省中華蜜蜂種群分化情況進(jìn)行研究,均未發(fā)現(xiàn)其存在種群分化,但其樣本有限且并未涉及保護(hù)區(qū)中華蜜蜂蜂群;僅于瀛龍等[16]利用15個微衛(wèi)星分子標(biāo)記對梵凈山自然保護(hù)區(qū)的中華蜜蜂遺傳分化情況進(jìn)行了研究,指出該保護(hù)區(qū)的中華蜜蜂并未產(chǎn)生種群分化,但并未與其他保護(hù)區(qū)情況進(jìn)行比較。

本研究通過對貴州省不同自然保護(hù)區(qū)的中華蜜蜂進(jìn)行調(diào)查,分別選用31個形態(tài)特征和mtDNA COⅠ～COⅡ序列為標(biāo)記對貴州省中華蜜蜂種群分化開展研究以期了解其種群分化現(xiàn)狀,為貴州省本土中華蜜蜂種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

為減少試驗(yàn)誤差,采樣在蜜源植物豐富、種群群勢較強(qiáng)的季節(jié)進(jìn)行,共采集11個野生自然保護(hù)區(qū)樣點(diǎn)蜜蜂,每個樣點(diǎn)采集工蜂≥15只,樣本采集后無水乙醇保存于-20 ℃冰箱待用,采樣點(diǎn)具體分布:草海為威寧縣草海國家級自然保護(hù)區(qū);佛頂山為石阡縣佛頂山自然保護(hù)區(qū);雷公山為雷山縣雷公山國家級自然保護(hù)區(qū);野鐘為水城區(qū)野鐘黑葉猴自然保護(hù)區(qū);百里杜鵑為畢節(jié)百里杜鵑特色森林資源自然保護(hù)區(qū);青巖為花溪青巖油杉自然保護(hù)區(qū);寬闊水為綏陽縣寬闊水國家級自然保護(hù)區(qū);清水河為興仁市清水河自然保護(hù)區(qū);赤水為赤水市桫欏國家級自然保護(hù)區(qū);習(xí)水為習(xí)水市中亞熱帶常綠闊葉林國家級自然保護(hù)區(qū);茂蘭為荔波縣茂蘭國家級自然保護(hù)區(qū)。具體見圖1及表1。

表1 貴州省11個自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂樣本采集信息

圖1 貴州省11個自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂采樣點(diǎn)分布

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)特征測定

每個樣點(diǎn)隨機(jī)抽取10只體重相當(dāng)?shù)墓し?參照Ruttner[17]提出的形態(tài)學(xué)方法,選取喙長(Length of proboscis,LP),右前翅長(Length of forewing,LW),右前翅寬(Width of forewing,WW),右前翅肘脈a(Cubial veina,CA),肘脈b(Cubial veinb,CB),肘脈指數(shù)(Cubital index,CI;肘脈a長/肘脈b長),右前翅翅脈角(A4、B4、D7、K19、G18、J10、L13、J16、N23、O26、E9),右后翅鉤數(shù)(Number of hind wing hook,NH),右后足股節(jié)長(Length of femur,LF),右后足脛節(jié)長(Length of tibia,LT),右后足跗節(jié)長(Length of metatarsus,LM),右后足跗節(jié)寬(Width of metatarsus,WM),第3背板長(Length of tergite 3,LT3)及第4背板長(Length of tergite 4,LT4),第4腹板長(Length of sternite 4,LS4),第4腹板斜長(Transverse length of wax plate on sternite 4,TWS4),第4腹板蠟鏡長(Length of wax plate on sternite 4,LWS4),第5背板黑帶長(Length of tergite black belt 5,LT5),第6背板黑帶長(Length of tergite black belt 6,LT6),第7腹板長(Length of sternite 7,LS7)和第7腹板寬(Width of sternite 7,WS7) 等31個形態(tài)特征為遺傳標(biāo)記。使用Nikon SMZ25數(shù)碼成像系統(tǒng)采集圖片及測定指標(biāo),其中,翅脈角聯(lián)合使用tpsUtil32和tpsDig232軟件進(jìn)行測定。

1.2.2 總DNA提取

每群中將形態(tài)學(xué)測量后工蜂樣本隨機(jī)抽取1只[5,7-11],取其胸部,盡量除去外表幾丁質(zhì),采用動物組織DNA快速提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取總DNA。

1.2.3 序列擴(kuò)增與測序

基于PCR引物R:5′-CTATACCTCGACGATACTCAG-3′及F:5′-TCAGGGTATTCATAGGATC-3′對mtDNA COⅠ～COⅡ序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL,其中,2×TaqMasterMix 10 μL,引物F及R各1 μL,DNA模板2 μL,dd H2O 6 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,64 ℃延伸30 s,34個循環(huán);72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)經(jīng)緯度采用Arcgis10.8繪制樣點(diǎn)分布圖,使用R4.0.2對形態(tài)數(shù)據(jù)平均值進(jìn)行直接聚類分析及主成分分析[18],使用SPSS 23.0進(jìn)行方差分析[19]。分子數(shù)據(jù)使用Mafft 7.205對序列進(jìn)行比對;運(yùn)用DNAsp 5.0檢測并統(tǒng)計(jì)突變位點(diǎn)、單倍型數(shù)目及分布[20];使用Mega 6.05計(jì)算堿基組成、Kinura 2-Parameter(K2P)平均遺傳距離、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等[21];利用Arcgis 10.8 根據(jù)各樣點(diǎn)的經(jīng)緯度計(jì)算地理距離,并使用SPSS 23.0和Origin 2022b對遺傳距離和地理距離進(jìn)行相關(guān)性分析;采用Network 4.61構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)分化

形態(tài)聚類分析表明:11個樣點(diǎn)主要聚為2個類群,第一類群包括百里杜鵑特色森林資源自然保護(hù)區(qū)、草海國家級自然保護(hù)區(qū)及寬闊水國家級自然保護(hù)區(qū)3個樣點(diǎn);剩余8個樣點(diǎn)聚為第二類群,見圖2。

形態(tài)特征主成分分析結(jié)果表明,PC1特征根為4.263,形態(tài)特征前翅長、前翅寬、第七腹板長、第七腹板寬、第四腹板長、股節(jié)長、喙長等對其貢獻(xiàn)率較大,解釋總體變異的42.7%。PC2特征根為2.148,形態(tài)特征跗節(jié)長、跗節(jié)寬、第六背板黑帶長、后翅鉤數(shù)、翅脈角D7、翅脈角J16等對其貢獻(xiàn)率較大,解釋總體變異的28.4%。前2個主成分解釋了總體變異的71.1%。利用前2個主成分進(jìn)行作圖,結(jié)果見圖3。

圖3 貴州省11個自然保護(hù)區(qū)不同群體間中華蜜蜂31項(xiàng)形態(tài)特征主成分分析

方差分析結(jié)果表明,各樣點(diǎn)間中華蜜蜂在第三背板長、第四背板長、第七腹板長等大多數(shù)形態(tài)指標(biāo)上均存在差異顯著,僅翅脈角D7和G18未達(dá)顯著差異水平,未發(fā)現(xiàn)與樣點(diǎn)分布相關(guān),見表2。

表2 貴州省11個自然保護(hù)區(qū)不同群體間中華蜜蜂31項(xiàng)形態(tài)特征方差分析

2.2 MtDNA遺傳多樣性

通過mtDNA堿基組成及變異情況分析,COⅠ～COⅡ序列總長度為733 bp,A+T平均含量為82%,C+G平均含量18%,A+T偏倚性明顯。該片段共檢測到變異位點(diǎn)32個,其中,單突變位點(diǎn)15個,分別在第33、70、71、145、146、167、168、200、275、294、295、350、385、630和674堿基上;簡約信息位點(diǎn)17個,分別在第 15、16、17、18、19、20、21、27、28、29、30、31、197、290、730、735、736。在該序列中,共檢測到11個單倍型,見表3,命名為H1-H11,所有單倍型均為獨(dú)有單倍型,且將11條序列上傳NCBI數(shù)據(jù)庫,登錄號分別為ON667711～ON667721。貴州省自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂平均核苷酸多樣度為0.016,核苷酸平均差異數(shù)為11.636,平均單倍型多樣度1.000。Tajima’s D中性檢驗(yàn)和Fu’s Fs中性檢驗(yàn)值分別為-1.060和-3.702,見表4。

表3 貴州省11個自然保護(hù)區(qū)不同群體間中華蜜蜂單倍型分布情況

表4 貴州省11個自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂mtDNA多樣性指數(shù)

通過對貴州省11個自然保護(hù)區(qū)樣點(diǎn)mtDNA遺傳距離分析表明,11個樣點(diǎn)間平均遺傳距離介于0.007 0～0.027 0;其中,寬闊水保護(hù)區(qū)與青巖保護(hù)區(qū)間遺傳距離最大,為0.027 0,赤水保護(hù)區(qū)與佛頂山保護(hù)區(qū)間遺傳距離最小,為0.007 0,見表5。11個樣點(diǎn)間的地理距離在88.56～492.26 km,其中,茂蘭保護(hù)區(qū)和草海保護(hù)區(qū)地理距離最遠(yuǎn),為492.26 km,赤水保護(hù)區(qū)和習(xí)水保護(hù)區(qū)地理距離最近,為88.56 km,見表6。利用SPSS 23.0和Origin 2022b對地理距離和遺傳距離進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示其P值分別為0.299和3.00;上述11個樣點(diǎn)間中華蜜蜂的地理距離和遺傳距離未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性,見圖4。

表5 貴州省11個自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂不同群體間K2P平均遺傳距離

表6 貴州省11個自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂不同群體間采樣點(diǎn)的地理距離(km)

圖4 貴州省11個自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂不同群體間地理距離和遺傳距離相關(guān)性分析

以分布于云南省保山市中華蜜蜂單倍型為外群(登錄號為DQ388609,簡寫YN),基于ML法和NJ法構(gòu)建的單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果基本一致,均顯示11個單倍型大致可聚為3個類群,其中,H2、H5、H9和H10聚為第一個類群,H7和H8聚為第二個類群,H1、H3、H4和H11聚為第三個類群,僅H6存在差異,見圖5。同樣以YN單倍型為外群構(gòu)建11個單倍型的網(wǎng)絡(luò)中介圖,結(jié)果顯示11個單倍型聚為3個類群,與基于ML法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致,見圖6。

(a)ML法;(b)NJ法。

圖6 貴州省中華蜜蜂不同群體間11個單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖

3 討論與結(jié)論

由貴州省11個自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂不同群體形態(tài)特征聚類分析和主成分分析可知,貴州省自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂存在一定形態(tài)分化,大致分為2個類群,其中,百里杜鵑、草海和寬闊水自然保護(hù)區(qū)為第一個類群,其余為第二個類群。徐祖蔭[23]研究表明:貴州省中華蜜蜂東、西部存在形態(tài)遺傳分化,西部類群為以威寧(草海)為中心的西北部地區(qū),其類型為云貴高原型;織金—鎮(zhèn)寧—冊亨一線以東的地區(qū)為東部類群,其類型為貴州山地生態(tài)型,即華中型;在兩者之間的地區(qū)為過渡型。匡邦郁等[24]也認(rèn)為貴州省中華蜜蜂東部和西部種群存在形態(tài)分化,類型分別是云貴高原型和華中型。本研究結(jié)果與上述學(xué)者研究基本相符,但第一類群中寬闊水樣點(diǎn)本應(yīng)與東部類群聚在一起,卻與百里杜鵑、草海樣點(diǎn)聚在一起,另外位于過渡帶地區(qū)的水城野鐘自然保護(hù)區(qū)、花溪青巖油杉自然保護(hù)區(qū)與東部類群聚為一支,說明上述自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂已受到外界影響,形態(tài)發(fā)生一定程度的分化。

對貴州省11個自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂不同群體mtDNA進(jìn)行分析,單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹表明,11個自然保護(hù)區(qū)樣點(diǎn)中華蜜蜂聚為3個類群。其中,百里杜鵑保護(hù)區(qū)(H2)、草海保護(hù)區(qū)(H5)、茂蘭保護(hù)區(qū)(H9)和寬闊水保護(hù)區(qū)(H10)聚為第一個類群,習(xí)水保護(hù)區(qū)(H7)和清水河保護(hù)區(qū)(H8)聚為第二個類群,雷公山保護(hù)區(qū)(H1)、赤水保護(hù)區(qū)(H3)、佛頂山保護(hù)區(qū)(H4)和青巖保護(hù)區(qū)(H11)聚為第三個類群。此前,于瀛龍等[16]、王俊杰[25]的研究表明貴州省中華蜜蜂mtDNA均未發(fā)生種群分化。這可能與樣本選取、基因片段選擇及近年頻繁的放蜂引種等因素有關(guān)。

貴州省自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂在形態(tài)和mtDNA均存在種群分化。以草海和百里杜鵑保護(hù)區(qū)為代表的西北部地區(qū)分化較明顯,其形態(tài)及mtDNA均存在明顯分化;其次,寬闊水自然保護(hù)區(qū)、野鐘自然保護(hù)區(qū)、花溪青巖油杉自然保護(hù)區(qū)受外界影響也發(fā)生一定程度的種群分化。造成分化的原因可能與人工引種、放蜂或環(huán)境氣候變化有關(guān)[26]。因此,在未來貴州省自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂的保護(hù)和開發(fā)利用中,寬闊水自然保護(hù)區(qū)、野鐘自然保護(hù)區(qū)、花溪青巖油杉自然保護(hù)區(qū)種群需給予重視。

不同生境條件會影響蜜蜂種群間的遺傳分化[27-28],有研究表明海拔和氣候?qū)ζ溆绊懨黠@[10-11,29]。草海和百里杜鵑保護(hù)區(qū)在形態(tài)和分子上均聚為一支,同樣體現(xiàn)了海拔和氣候?qū)γ鄯浞N群分化的重要性。草海和百里杜鵑保護(hù)區(qū)位于云貴高原向湘桂丘陵過渡的斜坡上,其海拔和氣候與省內(nèi)其他地區(qū)差距較大。如草海地區(qū)平均海拔在2 200 m以上,年均氣溫僅13～14 ℃。而省內(nèi)其他地區(qū)海拔多在800 m以下,年均氣溫多在20 ℃以上[23]。另外,在徐祖蔭[23]對貴州省中華蜜蜂3個生態(tài)群的劃分中,每個類群的海拔和氣候均有明顯的區(qū)別。因此,海拔和氣候可能是貴州省自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂發(fā)生種群分化的主要原因。

綜上,貴州省自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂已發(fā)生一定程度的種群分化,保護(hù)貴州省自然保護(hù)區(qū)中華蜜蜂的自然繁衍已迫在眉睫。因此,要嚴(yán)格執(zhí)行自然保護(hù)區(qū)管理?xiàng)l例或法規(guī),按照劃定的核心區(qū)、緩沖區(qū)、試驗(yàn)區(qū)實(shí)行分級管理[30],確保核心區(qū)為中華蜜蜂野生自然狀態(tài)區(qū),禁止人為干擾,以滿足中華蜜蜂自然繁衍;緩沖區(qū)為野生向半野生過渡區(qū),可以適當(dāng)取蜜生產(chǎn),但不得進(jìn)行蜂病治療、人工育王、蜂群引入等;試驗(yàn)區(qū)內(nèi)可對中華蜜蜂進(jìn)行必要的飼養(yǎng)措施,但需詳細(xì)記錄,在注重保護(hù)地方中華蜜蜂資源遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的條件下充分利用和發(fā)展中華蜜蜂[31]。