褚凌龍,婁嘉雯,劉文波,靳鵬飛,繆衛(wèi)國

(海南大學(xué) 植物保護學(xué)院 熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點實驗室,?？?570228)

巴西橡膠樹Heveabrasiliensis是一種較為典型的熱帶雨林植物,它所分泌的膠乳是重要的工業(yè)原料[1]。由炭疽菌引起的橡膠樹炭疽病是我國橡膠樹生產(chǎn)上最為嚴重的病害之一[2]。橡膠樹炭疽病主要由炭疽菌屬Colletotrichum的膠孢炭疽菌復(fù)合菌群C.gloeosporioidesspecies complex引起,是我國常見的炭疽菌總?cè)?寄主范圍廣泛,主要通過角質(zhì)層下內(nèi)部侵染和細胞內(nèi)半活體營養(yǎng)性侵染兩種方式對寄主的葉片、葉柄和嫩梢進行侵染[3]。隨著氣候的變化,病原菌對環(huán)境的適應(yīng)性逐漸增強,并且橡膠樹的抗病能力有所下降,導(dǎo)致橡膠樹炭疽病頻繁發(fā)生,對膠乳的生產(chǎn)行業(yè)產(chǎn)生了許多不利的影響[4]。

到目前為止,區(qū)分炭疽菌屬的真菌,是以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)為主體,對炭疽的種類進行初步鑒定,并結(jié)合純培養(yǎng)學(xué)、寄主專一性等來明確菌株的確切的種[5]。在形態(tài)學(xué)鑒定方面,主要通過對菌株的菌落形態(tài)、分生孢子的形態(tài)和大小、附著胞,以及菌核的有無等方面進行觀察,對菌株進行鑒定,而炭疽屬的真菌,絕大多數(shù)的菌株都具有廣泛的寄主,沒有嚴格的轉(zhuǎn)移寄生性[6]。在分子生物學(xué)鑒定方面[7],目前使用ITS、ACT、CHS-1、GAPDH、GS等基因,通過單個基因或者多個基因聯(lián)合建立系統(tǒng)發(fā)育樹,根據(jù)親緣關(guān)系遠近來確定菌株的分類地位。國際上將炭疽菌主要劃分為幾個類群:尖孢炭疽復(fù)合種TheC.acutatumspecies complex、白蠟樹炭疽復(fù)合種TheC.spaethianumspecies complex、毀滅炭疽復(fù)合種TheC.dstructivumspecies complex、束狀炭疽復(fù)合種TheC.demaliumspecies complex、膠孢炭疽復(fù)合種TheC.gloeosporioidesspecies complex、博寧炭疽復(fù)合種TheC.boninesespecies complex、禾生炭疽復(fù)合種TheC.graminicolaspecies complex、平頭炭疽復(fù)合種TheC.truncatumspecies complex和圓孢炭疽復(fù)合種TheC.orbiscularespecies complex等9個復(fù)合種和部分獨立的種[8]。

目前,田間對橡膠樹炭疽病的防治主要從3個方面進行:農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治。其中,化學(xué)防治是橡膠樹炭疽病的主要防治方法,但是多年來防治方法較為單一、藥劑少,導(dǎo)致病原菌已出現(xiàn)耐藥性[9-12]。我國目前登記用于炭疽病防治的藥劑中,根據(jù)殺菌劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)可大致分為11類,主要為咪唑類、三唑類、甲氧基丙烯酸酯類、二硫代氨基甲酸鹽類等。其中,以苯醚甲環(huán)唑為代表的三唑類殺菌劑和以多菌靈為代表的苯并咪唑類殺菌劑是防治橡膠樹炭疽病的主要藥劑[13]。三唑類和咪唑類殺菌劑都屬于脫甲基化酶抑制劑(DMI)類殺菌劑,通稱為唑類,如咪鮮胺。這一類的化合物可以通過對CYP51酶的活性進行抑制,從而導(dǎo)致炭疽菌合成麥角甾醇的前體物質(zhì)在菌體細胞中不斷累積,對細胞膜的結(jié)構(gòu)進行破壞,產(chǎn)生一定的毒害作用,最終導(dǎo)致菌體細胞死亡[14-16]。研究表明DMI類殺菌劑對炭疽病的防效差異較大[13],C.gloeosporioides復(fù)合種對所有被測DMI藥劑均敏感;但在2個親緣關(guān)系極為相近的同屬C.acutatum復(fù)合種中,C.fioriniae也對所有被測DMI藥劑敏感,C.nymphaeae卻對粉唑醇和腈苯唑表現(xiàn)為抗性;此外,C.truncatum對大多數(shù)DMI類藥劑表現(xiàn)為抗性或者不敏感[11]。炭疽病菌對DMI類藥劑存在天然抗性,頻繁使用藥劑也會導(dǎo)致病菌敏感性下降。采自浙江省葡萄上的膠孢炭疽菌菌株對戊唑醇已產(chǎn)生了中等抗性[17]。

生物防治因具有高效、低毒、環(huán)保的特點而備受矚目,已報道的可防治炭疽病的生防菌種類較多,其中,以芽孢桿菌和放線菌被研究得最為廣泛。樊蘭艷[18]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌Czk1所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)以及脂肽類物質(zhì)能夠有效抑制橡膠炭疽菌;枯草芽孢桿菌BD0310能夠很好地控制茶葉炭疽菌[19];從文心蘭葉片中分離出的菌株EB75經(jīng)鑒定為一株解淀粉芽孢桿菌,通過平板對峙實驗發(fā)現(xiàn),該菌株對膠孢炭疽菌的抑制率為58.79%,其發(fā)酵原液對膠孢炭疽菌的抑制率達到了77.69%,即使高溫處理后仍具有41.26%的抑制率[20];竺利紅等[21]研究表明,不同稀釋倍數(shù)的貝萊斯芽孢桿菌SM905發(fā)酵上清液對膠孢炭疽菌具有一定的抑制作用,其5倍稀釋液對菌絲生長的抑制率達到97.89%,經(jīng)處理后的氣生菌絲表現(xiàn)為空洞、畸形、色素積累,菌絲生長稀疏、膨大。

本研究通過形態(tài)學(xué)和ITS單基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的方式對一株從海南省儋州市橡膠園采集的橡膠樹葉片上分離得到的橡膠炭疽菌HD-1進行初步鑒定,并且對該菌株的生物學(xué)特性進行了研究,測定并比較了4種傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥和生防菌B.velezensisHN-2發(fā)酵上清液正丁醇提取物對該菌株的EC50,本研究為田間橡膠樹炭疽病的防控提供了理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

橡膠炭疽菌HD-1和貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)HN-2由海南大學(xué)植物保護學(xué)院分子植物病理實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

實驗所用培養(yǎng)基具體見表1。

表1 實驗所用培養(yǎng)基

1.2 方法

1.2.1 菌株HD-1形態(tài)學(xué)觀察

(1)菌落、菌絲觀察。將菌株HD-1接種于PDA平板上,培養(yǎng)3 d后,在菌落邊緣取6 mm菌餅,接種至新的PDA平板中央,28 ℃下恒溫培養(yǎng)5 d,觀察菌落形態(tài),利用生長速率法計算平均生長速率。從菌落邊緣挑取菌絲,放在滴加了適量水的載玻片上,在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)及特征。

(2)孢子、附著胞觀察。取新鮮的菌落邊緣菌餅,于100 mL的PDB培養(yǎng)基中,180 r/min,28 ℃振蕩培養(yǎng)5 d后,將密封的錐形瓶放于光照下靜置3 d,期間對菌液進行鏡檢,觀察孢子是否生成,待有大量孢子生成后,過濾菌絲,6 000 r/min離心5 min,棄上清液,計算孢子濃度,調(diào)整濃度為106mL-1。使用光學(xué)顯微鏡觀察孢子的形態(tài)特征并測量孢子大小,進行生物學(xué)統(tǒng)計。吸取30 μL的孢子懸浮液(106mL-1)滴加在無菌的單凹載玻片上,置于鋪有潮濕的無菌濾紙的培養(yǎng)皿中,28 ℃保濕培養(yǎng),每隔0.5 h取出載玻片蓋上蓋玻片后在顯微鏡下觀察附著胞的形狀并記錄。

1.2.2 菌株HD-1分子生物學(xué)鑒定

(1)菌株HD-1的基因組DNA提取。將菌株HD-1接種至PDA培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)5 d,刮取菌絲,使用植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進行基因組DNA的提取。

(2)序列擴增。使用菌株HD-1的基因組DNA為模板,引物ITS1和ITS4(表2)對基因ITS進行擴增。

表2 ITS引物

PCR(25 μL)體系:2×TaqPCR MasterMix Ⅱ[天根生化科技(北京)有限公司)]12.5 μL;HD-1 DNA 1 μL;引物ITS1/4 1 μL;ddH2O 9.5 μL。

PCR擴增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)數(shù)為30次;72 ℃再延伸10 min。

(3)測序及分析。取5 μL PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定條帶正確后將PCR產(chǎn)物送華大基因科技股份有限公司測序;將測序所得序列以及GenBank上下載的各菌株序列用MEGA 7.0軟件進行處理,序列對準后切齊,然后用最大似然估計法(Maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以自舉法(bootstrap method)進行檢測,共循環(huán)500次。

1.2.3 菌株HD-1生物學(xué)特性

(1)不同培養(yǎng)基對菌株生長的影響。將6 mm菌餅接種于上述含有不同瓊脂培養(yǎng)基的平板中央,每個處理重復(fù)3次,28 ℃培養(yǎng)5 d,使用十字交叉法測量菌落直徑。

(2)不同pH對菌株生長的影響。用1 mol/L的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值至4、5、6、7、8、9、10共7組處理,將6 mm菌餅接種于上述含有不同pH的PDA的平板中央,每個處理重復(fù)3次,28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d,使用十字交叉法測量菌落直徑。

(3)不同碳源、氮源對菌株生長的影響。用果糖、葡萄糖、山梨醇、半乳糖、麥芽糖和甘露醇對察氏瓊脂培養(yǎng)基中的蔗糖進行等碳量替換,用硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀、牛肉浸膏、蛋白胨、脯氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸對察氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉進行等氮量替換,制成含有不同碳源、氮源的培養(yǎng)基平板,將6 mm菌餅接種于上述平板中央,每個處理重復(fù)3次,28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d,使用十字交叉法測量菌落直徑。

(4)致病性測定。取淡綠期的橡膠樹葉片,使用75%乙醇進行葉片表面消毒。使用滅菌牙簽將葉片刺出大小約為3 mm×3 mm的傷口,取6 mm新鮮的菌餅接種于傷口上,使用等大的PDA培養(yǎng)基瓊脂塊作為對照,于28 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng),定期觀察。

1.2.4 室內(nèi)毒力測定

(1)藥劑。25%咪鮮胺水乳劑,山東禾益生物科技有限公司;10%苯醚甲環(huán)唑水乳劑,陜西湯普森生物科技有限公司;40%錳鋅·三唑酮可濕性粉劑,四川國光農(nóng)化股份有限公司;75%三環(huán)唑可濕性粉劑,上海滬聯(lián)生物藥業(yè)(夏邑)股份有限公司;HN-2正丁醇提取物由本實驗室提取。將各藥劑配制成不同濃度的母液,并使用0.22 μm的細菌過濾器進行過濾。

(2)室內(nèi)毒力測定。使用生長速率法,測定5種藥劑對菌株HD-1的室內(nèi)毒力。在PDA培養(yǎng)基中加入不同體積的藥劑母液,充分混勻,制成含有不同藥劑的平板。每種藥劑設(shè)置5個不同的含量,取6 mm的菌餅接種于各個平板中央,28 ℃培養(yǎng)5 d,使用十字交叉法測量菌落直徑。按照公式計算抑菌率。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel計算方差與平均值,通過SPSS 21計算不同藥劑的EC50值,采用Duncan新復(fù)極差法進行差異顯著性分析(P<0.05),使用GraphPad Prism 8.0進行科研繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株HD-1在PDA上28 ℃培養(yǎng)5 d后菌落直徑為(74.44±1.66) mm。菌落在1～4 d內(nèi)呈白色,5 d后中央由白色變?yōu)榛抑梁谏玔圖1(a)],背面產(chǎn)生黑色沉淀[圖1(b)];菌落邊緣整齊,呈圓形,顏色較淺,白色至淺灰色;菌落正面著生氣生菌絲,淺灰色。菌絲茂密,直徑為(4.98±0.75) μm[圖1(c)]。分生孢子無色、無彎曲、光滑、橢圓形、基部鈍圓或稍尖,大小約(0.93±0.10) μm×(0.38±0.06) μm[圖1(d)]。附著胞圓至橢圓形,邊緣光滑、規(guī)則,偶爾有不規(guī)則狀[圖1(e)]。

(a)菌落正面(5 d);(b)菌落反面(5 d);(c)菌絲;(d)分生孢子;(e)附著胞。

2.2 菌株HD-1致病性檢測

結(jié)果顯示,刺傷4 d后發(fā)病,發(fā)病部位呈現(xiàn)黑色輪紋狀,邊緣有黃色暈圈產(chǎn)生,與田間癥狀一致,見圖2。對發(fā)病部位進行分離仍能得到所接種的菌株,通過柯赫氏法則確定該菌株為橡膠炭疽病的病原菌。

2.3 菌株HD-1分子生物學(xué)鑒定

通過測序得到菌株HD-1的ITS基因的部分片段大小為573 bp。將測序所得序列在NCBI-nucleotide數(shù)據(jù)庫中進行比對,使用MEGA 7.0對HD-1-ITS及下載的各菌株的ITS序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。如圖3所示,該菌株與膠孢炭疽菌復(fù)合菌群中的C.fructicola聚為一個分支,綜上結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察,將菌株HD-1鑒定為果生刺盤孢菌C.fructicola。

圖3 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 菌株HD-1生物學(xué)特性

2.4.1 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

在測定的10種培養(yǎng)基中(圖4),最適HD-1生長的培養(yǎng)基是PDA,在第5天時菌落平均直徑為(74.44±1.66) mm,平均生長速率為14.89 mm/d;在LB上菌落直徑為(73.94±1.04) mm,平均生長速率為14.79 mm/d,但菌絲生長稀疏;在MBM、CD、NYG和YEPD上菌落直徑分別為(71.57±1.45)、(69.14±0.75)、(61.56±2.80)和(59.38±4.31) mm,平均生長速率分別為14.31、13.83、13.31和11.88 mm/d;HD-1在CM、SDA和SDAY上生長相對較差,菌落直徑分別為(57.71±1.49)、(52.45±0.77)和(50.73±3.45) mm,生長速率分別為11.54、10.49和10.15 mm/d;HD-1在PSA上生長最不好,菌落平均直徑為(43.73±0.64) mm,平均生長速率8.75 mm/d。

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準誤,不同小寫字母表示經(jīng)Duncan檢驗法檢驗差異顯著(P<0.05)。

2.4.2 pH對菌絲生長影響

菌株HD-1在pH 4.0～10.0的范圍內(nèi)均能生長(圖5),pH值在7.0～10.0時,菌落大小相近,且菌絲生長都較為密集,最適pH值為8.0,其菌落直徑為(70.37±1.44) mm,平均生長速率為14.07 mm/d,這一結(jié)果說明該菌株對pH的適應(yīng)范圍較廣。

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準誤,不同小寫字母表示經(jīng)Duncan檢驗法檢驗差異顯著(P<0.05)。

2.4.3 碳源對菌絲生長的影響

如圖6,菌落生長5 d后,在山梨醇和甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上菌落直徑顯著大于其他碳源,分別為(59.41±1.19) mm和(58.53±1.69) mm,平均生長速率分別為11.88和11.71 mm/d;在含有麥芽糖、果糖和蔗糖培養(yǎng)基上分別為(49.39±1.32)、(48.77±2.77)和(48.53±1.22) mm,平均生長速率分別為9.88、9.75、9.71 mm/d,無顯著差異;HD-1對葡萄糖的利用相對較差,菌落直徑為(46.64±1.69) mm,平均生長速率為9.33 mm/d;以半乳糖為碳源的菌落直徑僅(28.66±1.12) mm,平均生長速率為5.73 mm/d。

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準誤,不同小寫字母表示經(jīng)Duncan檢驗法檢驗差異顯著(P<0.05)。

2.4.4 氮源對菌絲生長的影響

如圖7,菌落生長5 d后,在以牛肉浸膏為氮源的培養(yǎng)基上菌落直徑為(68.60±0.53) mm,平均生長速率達到13.72 mm/d,明顯高于其他氮源;以硝酸鉀、脯氨酸和甘氨酸作為氮源則生長較差,分別為(52.58±2.25)、(51.64±1.38)和(52.68±1.92) mm,平均生長速率為10.52、10.33和10.54 mm/d;以胰蛋白胨作為氮源的菌落生長較差,為(48.38±1.01) mm,平均生長速率為9.68 mm/d;以硫酸銨、氯化銨和谷氨酰胺為氮源不利于HD-1生長,菌落直徑分別為(41.79±2.25)、(42.95±2.36)、(41.67±2.66) mm,平均生長速率分別為8.36、8.59、8.33 mm/d。

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準誤,不同小寫字母表示經(jīng)Duncan檢驗法檢驗差異顯著(P<0.05)。

2.4.5 室內(nèi)毒力測定

5種不同藥劑對菌株HD-1毒力測定結(jié)果(表3)顯示,咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、三環(huán)唑、錳鋅·三唑酮和HN-2正丁醇提取物的EC50值分別為0.12、19.31、102.50、415.76和56.77 μg/mL。如圖8所示,在含有HN-2正丁醇提取物的培養(yǎng)基上生長的菌株HD-1,菌落背面出現(xiàn)了明顯的黑化現(xiàn)象,同時對菌絲進行顯微觀察,可以明顯觀察到菌絲膨大成球狀,而在含有三環(huán)唑的培養(yǎng)基上生長的菌株HD-1,菌落背面呈現(xiàn)深紅色。

圖8 不同藥劑處理的菌落圖片及菌絲觀察

表3 藥劑對菌株HD-1的室內(nèi)毒力

3 討論

由橡膠炭疽菌引起的橡膠樹炭疽病是一種常見的病害,會影響橡膠樹的產(chǎn)膠量,嚴重時會導(dǎo)致橡膠樹死亡,造成經(jīng)濟損失。經(jīng)過形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定和形態(tài)學(xué)觀察,初步鑒定菌株HD-1為果生刺盤孢菌C.fructicola。林春花等[22]對在云南、海南、廣東和廣西等4處墾區(qū)的橡膠樹病葉上分離得到的病原菌進行鑒定,有22株膠孢炭疽菌和15株尖孢炭疽菌;有研究表明,果生刺盤孢菌不僅可以侵染橡膠樹,還可以在多個寄主植物上分離得到,例如油茶、臭椿、楓香和草莓等[23]。

使用生長速率法,測定不同培養(yǎng)基、pH、碳源和氮源對該菌生長的影響。在測定的培養(yǎng)基中,該菌在PDA培養(yǎng)基上生長情況最好;在測定的pH范圍內(nèi),最適生長的pH值為8;在測定的碳源、氮源中,菌株HD-1對山梨醇和牛肉浸膏的利用最好。不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響與菌種有關(guān),姚英等[24]認為馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基最有利于膠孢炭疽菌CB-2的生長,而在PDA培養(yǎng)基上的菌落直徑顯著降低。雷嬌嬌等[25]的實驗中,菌落的直徑大小由SNA培養(yǎng)基、OA培養(yǎng)基到PDA培養(yǎng)基依次遞減;這些結(jié)果與本實驗結(jié)果不同之處可能是由菌株差異、生理差異、培養(yǎng)基中其他成分的含量不同所造成的。在pH方面,本實驗的研究結(jié)果與陳貴華[26]的研究結(jié)果相符,他認為酸堿度對菌絲生長的影響不大,pH值在4～10的范圍內(nèi)菌絲均能較好生長。不同菌株對pH的適應(yīng)能力也有所不同:舒娟[27]對果生刺盤孢菌HN47-2和GZ15-1的研究發(fā)現(xiàn),這兩種菌株生長最適pH值為5;對油茶上分離出的代表性果生刺盤孢菌DHYC14研究發(fā)現(xiàn),該菌株喜弱酸性環(huán)境,生長最適pH值為5～7[28]。在碳源和氮源方面,對閩楠上分離的膠孢炭疽菌的研究發(fā)現(xiàn),分別以麥芽糖和酵母浸膏為碳源和氮源時菌落直徑最大[24];李戌清等[29]研究的三葉青株系則在以山梨醇為碳源,牛肉浸膏為氮源的培養(yǎng)基上生長最好,而氯化銨對菌絲生長有一定的抑制作用。

同一藥劑對同一復(fù)合種內(nèi)的不同菌株也有不同的毒力,于秀敏等[30]使用6種不同的殺菌劑對一株膠孢炭疽菌進行了毒力測定,結(jié)果顯示25%咪鮮胺的抑菌效果最好,其EC50僅有0.117 5 μg/mL。有研究表明[31]在9種殺菌劑對柱花草炭疽病的毒力測定中,咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的抑菌效果最好,其EC50在0.032 3～0.735 2 μg/mL,三唑酮的抑菌效果最差,EC50為285.219 8 μg/mL。在周子騫等[32]對膠孢炭疽菌的毒力測定實驗中,苯醚甲環(huán)唑的EC50為0.84 μg/mL,代森錳鋅的毒力則較差,EC50為4 830.14 μg/mL,這可能是由于菌株產(chǎn)生了抗藥性,而本實驗中由代森錳鋅和三唑酮復(fù)配的藥劑錳鋅·三唑酮的EC50卻達到415.76 μg/mL,這可能與菌株的寄主、分離部位不同有關(guān)。咪鮮胺作為咪唑類殺菌劑,通過抑制麥角甾醇生物合成起到抑菌效果,對病原菌的抑制作用最強,EC50為0.12 μg/mL;苯醚甲環(huán)唑、HN-2正丁醇提取物、三環(huán)唑和錳鋅·三唑酮的抑菌效果依次下降,錳鋅·三唑酮的EC50達到415.76 μg/mL;生物防治由于其自身的優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于植物病害的防治中,高宇等[33]對B.malacitensisZ-5菌株的抑菌物質(zhì)進行鑒定,其主要成分為脂肽抗生素C14Surfactin B,C14～C17Iturin A,C14、C15、C17Iturin B等;竺利紅等[21]針對貝萊斯芽孢桿菌SM905對膠孢炭疽菌的抑菌活性進行了研究,發(fā)現(xiàn)其5倍稀釋的發(fā)酵上清液對膠孢炭疽菌的抑制活性達到了97.89%,且經(jīng)過處理的氣生菌絲會表現(xiàn)為畸形、空洞、色素積累,且萌發(fā)后的菌絲稀疏、膨大,這些研究都與本實驗結(jié)果相符。趙雅等[34]對貝萊斯芽孢桿菌HN-Q-8的發(fā)酵液活性成分分析后,鑒定其活性物質(zhì)成分為豐源素(Fengycin)和表面活性素(Surfactin)。通過MALDI-TOF-MS對HN-2正丁醇提取物進行分析,發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)可能有伊枯草菌素A(C14、C15、C18Iturin A)、伊枯草菌素B(C13-14Iturin B)、桿菌霉素F(C14、C17Bacillomycin F)、桿菌霉素D(C14-15Bacillomycin D)、抗霉枯草菌素(C15Mycosubtilin)、表面活性素A(C13-14Surfactin A)、表面活性素B(C13-15Surfactin B)、表面活性素C(C13-14Surfactin C)和豐源素A(C14-16Fengycin A),這表明B.velezensisHN-2不僅可以產(chǎn)生表面活性素和伊枯草菌素,還可以產(chǎn)生桿菌抗霉素(Bacillomycin)和抗霉枯草菌素(Mycosubtilin),HN-2的抑菌粗提物在低濃度下就可以起到較好的抑菌效果,EC50僅為56.77 μg/mL。

值得注意的是,在含有HN-2正丁醇提取物的培養(yǎng)基上生長的HD-1的菌絲,通過顯微觀察可以發(fā)現(xiàn)其菌絲明顯膨大,這與以往研究所證明的貝萊斯芽孢桿菌通過使病原菌菌絲畸形起到抑菌作用相符合,并且在本實驗中所使用的三環(huán)唑?qū)儆诩毎谏厣锖铣梢种苿?所以經(jīng)過三環(huán)唑處理后的該菌菌落反面并非呈現(xiàn)灰色而是深紅色,然而通過平板實驗觀察發(fā)現(xiàn)生防菌HN-2處理后的菌落呈深黑色。

4 結(jié)論與展望

研究對菌株HD-1進行了鑒定,確定了其種類,研究了其生物學(xué)特性,并測定了5種藥劑對其的室內(nèi)毒力,為防治橡膠樹炭疽病提供一定的理論數(shù)據(jù)支持。同時發(fā)現(xiàn)在含有HN-2正丁醇提取物的PDA培養(yǎng)基上生長的HD-1菌株出現(xiàn)了黑色素過量積累的現(xiàn)象,我們推測HN-2正丁醇提取物可能對菌株HD-1是一種可以誘導(dǎo)黑色素合成的逆境物質(zhì),并且可能會通過影響菌體中的某個通路或者某個基因來影響黑色素的合成,并且發(fā)生在菌絲上的膨大現(xiàn)象也可能與貝萊斯芽孢桿菌抑菌機理相關(guān),我們將對這其中的作用機理進行探究。生防菌HN-2對菌株HD-1有良好的活性,說明該菌株可以作為一種生防菌劑,具有良好的開發(fā)利用前景。