羅正東,劉喚明,雷曉凌,顏琿璘

(1.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心 廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湛江 524088;2.中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 支撐平臺(tái)處高等級(jí)生物實(shí)驗(yàn)室管理辦,深圳 518055)

海洋共附生微生物分離于海洋生物體,包括海洋脊椎動(dòng)物、海洋無脊椎動(dòng)物和海洋植物,生長于惡劣且復(fù)雜多變的海洋生態(tài)環(huán)境,具有生長能力強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣等特點(diǎn)[1-2]。海洋產(chǎn)油真菌增殖快,能提供足夠的胞內(nèi)空間積累油脂以抵御低溫,也能為浮游生物和附生動(dòng)物提供脂類營養(yǎng)物質(zhì)[3-4]。因其獨(dú)特的油脂合成代謝機(jī)制,能夠生產(chǎn)中長鏈脂肪酸,有潛力開發(fā)為保健品、食品、醫(yī)藥和燃料[5-6]。前期研究發(fā)現(xiàn)海鞘共附生真菌桔青霉Asc2-4具有產(chǎn)油菌的共同特點(diǎn)[7-8]。

發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)油真菌的菌絲體生長和油脂形成起到不同的效果。趙晨等[9]發(fā)現(xiàn)解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)在低溫條件下有利于合成不飽和脂肪酸,高溫有利于合成飽和脂肪酸。pH能改變生物膜通透性保證足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣輸入胞內(nèi)促進(jìn)菌體生長,也能影響脂肪酸的組成。Mironov等[10]研究高山被孢霉(Mortierellaalpina)NRRL-A-10995表明,pH值為3時(shí)能完全抑制花生四烯酸(AA)的合成,當(dāng)pH值為6時(shí),AA的百分含量和生物量皆達(dá)到最高,分別為19.9%和22.0 g/L。接種量對(duì)產(chǎn)油真菌的生長曲線趨勢有較大影響,適宜的接種量既能使菌絲體快速增殖從而縮短發(fā)酵周期,也能讓對(duì)數(shù)生長末期的菌絲球表面積增大,吸收充足的氧氣及養(yǎng)分,從而提高菌體的油脂積累量[11-12]。溶氧量是微生物高產(chǎn)油脂的關(guān)鍵因素,可通過轉(zhuǎn)速和裝液量優(yōu)化溶氧,Magdouli等[13]發(fā)現(xiàn)解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)SM7在溶解氧含量30%時(shí)油脂含量能夠達(dá)到44.81%。肖玉娟等[14]在紅樹林海水腐木中分離出一株高產(chǎn)油脂的破囊壺菌(Aurantiochytriumsp.)HX2019010,發(fā)酵油經(jīng)GC-2010 PLUS氣相色譜鑒定,測算出該菌產(chǎn)9.17 g/L的DHA。因此,研究發(fā)酵條件的優(yōu)化對(duì)提高生物量和油脂質(zhì)量濃度十分必要,通過測定發(fā)酵油的脂肪酸組分和含量可判斷油脂功能性。

在前期研究的基礎(chǔ)上,通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件,進(jìn)一步提高桔青霉Asc2-4的生長和產(chǎn)油能力,根據(jù)氣相色譜測定的脂肪酸組分及含量評(píng)價(jià)菌油的功能性,為海鞘共附生微生物桔青霉Asc2-4開發(fā)成工業(yè)產(chǎn)油菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

桔青霉PenicilliumcitrinumAsc2-4為課題組前期分離和鑒定的優(yōu)良產(chǎn)油真菌,篩選自廣東省雷州市流沙蝦塘的海鞘[15]。保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(保藏號(hào):GDMCC 60059)。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:馬鈴薯浸出粉8 g/L,葡萄糖20 g/L,海精鹽15 g/L,硫酸銨10 g/L,pH(5.8)自然,飽和蒸汽121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:新鮮馬鈴薯200 g/L,葡萄糖100 g/L,蛋白胨0.5 g/L,酵母膏0.5 g/L,海精鹽15 g/L,檸檬酸鈉0.1 g/L,KH2PO44 g/L,MgSO4150 mg/L,FeCl32.0 μg/L,pH值5.8,飽和蒸汽121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器

HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱;BMJ-25型霉菌培養(yǎng)箱;LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌鍋;UGC-24C圓形水浴氮吹儀;GC-2010 PLUS氣相色譜儀。

1.2 方法

1.2.1 種子液培養(yǎng)

接種適量桔青霉Asc2-4孢子于含有200 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中,在28 ℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h。

1.2.2 發(fā)酵液培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)后的菌絲體接種于含有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐型瓶,在搖床中發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.3 菌體生物量測定

參照文獻(xiàn)[16]菌體生物量測定方法,略有改變。抽濾菌絲體于培養(yǎng)皿,在109 ℃的烘箱中烘干,恒重后稱重。

1.2.4 菌體油脂提取

參考文獻(xiàn)[17]酸熱提油法,略有改進(jìn)。將每1.00 g的干菌體添加6.00 mL濃度為4.00 mol/L的鹽酸,在溫度100 ℃的沸水浴和-20 ℃冷凍環(huán)境中分別處理10 min,重復(fù)2至3次,按2∶1(體積比)的氯仿和甲醇溶液萃取,在2 000 r/min、5 ℃條件下離心,取上層有機(jī)相氮吹即得菌油。

1.2.5 菌油脂肪酸組成測定

菌油樣品甲酯化[18],使用氣相色譜儀進(jìn)行脂肪酸組分及含量分析,氣相色譜儀配置SP-2560氣相毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)和氫火焰離子檢測器(FID)。設(shè)置進(jìn)樣口溫度為225 ℃,檢測器溫度為250 ℃,分流比10∶1;設(shè)置程序升溫條件:柱溫100 ℃(13 min),以10 ℃/min升至180 ℃(6 min),再以1 ℃/min升至200 ℃(20 min),最后以4 ℃/min升至235 ℃ (20 min)。

1.3 單因素優(yōu)化

以28 ℃、pH值5.8、接種量5%、裝液量100 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速140 r/min和培養(yǎng)時(shí)間7 d作為初始發(fā)酵條件,分別設(shè)置溫度25、27、29、31和33 ℃,pH(4.5、5.5、6.5、7.5和8.5)、接種量(1%、3%、5%、7%和9%)、250 mL三角瓶裝液量(50、75、100、125和150 mL)和轉(zhuǎn)速(100、140、180、220和260 r/min),每組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),綜合生物量和油脂含量篩選出適宜桔青霉Asc2-4的發(fā)酵條件。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化

選取單因素中3個(gè)顯著影響油脂積累的因子并設(shè)計(jì)三水平響應(yīng)面試驗(yàn),以油脂濃度作為響應(yīng)值,共設(shè)置15組試驗(yàn),進(jìn)行3次中心重復(fù)試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平和編碼

1.5 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,使用One-way ANOVA程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,Duncan多重分析比較驗(yàn)證數(shù)據(jù),P<0.05為差異顯著,響應(yīng)面試驗(yàn)使用軟件Design-Expect 10.1擬合模型和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海鞘桔青霉Asc2-4產(chǎn)油發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化

2.1.1 最佳發(fā)酵溫度

由圖1(a)可知,桔青霉Asc2-4的生物量在25～29 ℃范圍內(nèi)隨溫度升高而增大,超過29 ℃則出現(xiàn)下降。不同溫度對(duì)該菌的生物量影響程度存在差異,27、29和31 ℃的生物量較高而三者的差異不顯著,但與溫度25和33 ℃的生物量差異顯著(P<0.05)。其中,29 ℃的生物量最高,達(dá)到16.73 g/L。29 ℃的油脂質(zhì)量濃度為2.74 g/L,顯著高于其他4種溫度的油脂質(zhì)量濃度。因此,確定29 ℃作為最佳發(fā)酵溫度。

同一指標(biāo)含一個(gè)相同字母則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.1.2 最佳pH值

由圖1(b)可知,桔青霉Asc2-4的生物量隨pH值的增大呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢,這種變化與pH影響菌體細(xì)胞通透性和參與調(diào)控生長的酶蛋白活性,導(dǎo)致菌體受增殖促進(jìn)或抑制的情況有關(guān)[19-20]。當(dāng)pH值為5.5時(shí)生物量達(dá)14.36 g/L,說明該pH值有利于菌絲體的生長。當(dāng)pH值為4.5～5.5時(shí),油脂質(zhì)量濃度呈現(xiàn)上升,而pH值5.5～8.5時(shí)出現(xiàn)下降,適宜產(chǎn)油的pH值為5.5,油脂質(zhì)量濃度為2.87 g/L。因此,確定5.5為最佳pH值。

2.1.3 最佳接種量

由圖1(c)可知,桔青霉Asc2-4在5種接種量條件下的生物量和油脂質(zhì)量濃度皆有不同程度提高。但是,適宜菌體增殖的最佳接種量與適宜油脂積累的有所不同,其中,接種量5%對(duì)生物量提高顯著(P>0.05)達(dá)到最高的14.68 g/L。但最佳產(chǎn)油的接種量則為3%,油脂質(zhì)量濃度為3.01 g/L,這說明生物量適宜能為積累油脂吸收更多營養(yǎng)成分或是溶氧量,生物量過高反而不利于微生物產(chǎn)油[21]。本研究為提高產(chǎn)油,所以將3%作為最佳接種量。

2.1.4 最佳裝液量

由圖1(d)可知,桔青霉Asc2-4在125 mL/250 mL時(shí)生物量和油脂質(zhì)量濃度皆為最高,分別達(dá)到14.69和4.22 g/L。有報(bào)道稱[6,22],裝液量能為產(chǎn)油菌提供活性氧,刺激油脂合成途徑的碳鏈去不飽和及碳鏈合成。然而,過高的裝液量易造成種間競爭影響菌體生長和油脂生產(chǎn),當(dāng)裝液量為150 mL/250 mL時(shí),其生物量(12.53 g/L)和油脂質(zhì)量濃度(2.31 g/L)相較裝液量125 mL/250 mL皆出現(xiàn)降低。綜合考慮,確定125 mL/250 mL作為最佳裝液量。

2.1.5 最佳轉(zhuǎn)速

由圖1(e)可知,轉(zhuǎn)速從100 r/min到220 r/min,該菌的油脂質(zhì)量濃度從3.22 g/L大幅提升至8.26 g/L,可知,適宜產(chǎn)油的轉(zhuǎn)速為220 r/min。結(jié)合圖1(d)可知,裝液量及轉(zhuǎn)速不僅能大幅提高油脂質(zhì)量濃度,其生物量變化趨勢也相似,這與該兩種發(fā)酵條件皆通過改變液態(tài)剪切力影響菌絲體的增殖有關(guān)[23-24]。轉(zhuǎn)速220 r/min的生物量為最高的18.73 g/L,刺激高產(chǎn)油的轉(zhuǎn)速也為220 r/min,其油脂質(zhì)量濃度為8.26 g/L。因此,確定220 r/min為最佳轉(zhuǎn)速。

綜上可知,桔青霉Asc2-4發(fā)酵條件單因素優(yōu)化的結(jié)果:29 ℃、pH值5.5、接種量3%、裝液量125 mL/250 mL和轉(zhuǎn)速220 r/min,該發(fā)酵條件下適宜該菌生長與產(chǎn)油。為進(jìn)一步提高該菌的產(chǎn)油能力,選取明顯提高油脂質(zhì)量濃度的因子(接種量、裝液量和轉(zhuǎn)速),作為響應(yīng)面優(yōu)化的研究對(duì)象。

2.2 海鞘桔青霉Asc2-4產(chǎn)油發(fā)酵條件的響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化

表2 發(fā)酵條件響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

表3 回歸方程方差結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)的等高線與響應(yīng)曲面

圖2為響應(yīng)面試驗(yàn)的等高線與響應(yīng)曲面。不同交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可由等高線圖形進(jìn)行判斷,圓形代表兩因素間的交互顯著,橢圓形則代表交互不顯著,可知,接種量與轉(zhuǎn)速的交互顯著。結(jié)合Design-Expert軟件分析數(shù)學(xué)模型得桔青霉Asc2-4在發(fā)酵條件為接種量3.26%,裝液量118.42 mL/250 mL,轉(zhuǎn)速226.20 r/min,油脂質(zhì)量濃度最大。結(jié)合方差分析和實(shí)際情況,確定接種量3.3%、裝液量120 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速220 r/min為最佳產(chǎn)油發(fā)酵條件。

2.2.3 驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化

表4為驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化的比較試驗(yàn)。經(jīng)驗(yàn)證,得到3次試驗(yàn)的油脂質(zhì)量濃度平均值為8.80 g/L,與理論響應(yīng)值(8.78 g/L)相差0.02 g/L,表明該響應(yīng)面結(jié)果真實(shí)可靠。最終結(jié)果,生物量和油脂質(zhì)量濃度分別提高了65.57%和224.73%,而油脂含量從22.39%提升了109.30%,達(dá)到45.88%。

2.3 海鞘桔青霉Asc2-4菌油脂肪酸組分與含量的測定

表5為氣相色譜測定的菌油脂肪酸組分與含量。該菌能夠生產(chǎn)高級(jí)脂肪酸(C15～C24),其中C16和C18脂肪酸相對(duì)含量達(dá)96.26%。主要脂肪酸為棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)和亞油酸(C18:2)。發(fā)酵油的飽和脂肪酸共7種,占35.60%,不飽和脂肪酸6種,占64.40%;最高含量的脂肪酸為41.46%的C18:1,其余3種含量較高的脂肪酸為21.68%亞油酸(C18:2)、16.64%棕櫚酸(C16:0)和15.58%硬脂酸(C18:0)。

表5 發(fā)酵油的脂肪酸組分及含量

3 結(jié)論

研究表明,適宜桔青霉Asc2-4生長與產(chǎn)油的發(fā)酵條件為溫度29 ℃、pH值5.5、接種量3.3%、裝液量120 mL/250 mL和轉(zhuǎn)速220 r/min,生物量和油脂質(zhì)量濃度分別達(dá)到19.19和8.80 g/L,其主要脂肪酸為C16和C18脂肪酸,占總脂肪酸96.26%,各脂肪酸含量與組分分別為41.46%油酸(C18:1)、21.68%亞油酸(C18:2)、16.64%棕櫚酸(C16:0)和15.58%硬脂酸(C18:0)。

優(yōu)化發(fā)酵條件能提高代謝效率和充分吸收營養(yǎng)物質(zhì)使生物量和油脂濃度得到提升[25]。本研究進(jìn)行溫度單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),溫度對(duì)生物量的影響大于油脂濃度,這與溫度更能影響真菌增殖有關(guān)[26],而低溫條件(25～27 ℃)的油脂濃度皆低于29 ℃的油脂濃度(P<0.05),則與普遍認(rèn)為低溫(<27 ℃)利于微生物積累油脂的理論不同[27-28]。pH通過改變細(xì)胞膜電荷影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收率而提高油脂積累量,如龔佳等[29]發(fā)現(xiàn)圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)在pH值為4～8時(shí)油脂產(chǎn)量變化為77.06～9.16 g/L,而本研究發(fā)現(xiàn)pH(4.5～8.5)時(shí)油脂質(zhì)量濃度的變化范圍在1.73～2.74 g/L,說明此pH值范圍對(duì)桔青霉Asc2-4油脂積累影響不明顯。有研究發(fā)現(xiàn)[30],產(chǎn)油真菌帚枝霉(Sarocladiumkiliense)ADH17在優(yōu)化接種量(5%～10%),其油脂質(zhì)量濃度最高僅為1.17 g/L,而本試驗(yàn)接種量3%時(shí)油脂質(zhì)量濃度高達(dá)3.01 g/L,可見低接種量更適宜桔青霉Asc2-4合成油脂。本試驗(yàn)菌種在較高裝液量(125 mL/250 mL)條件培養(yǎng),生物量和油脂質(zhì)量濃度分別為14.69 g/L和4.22 g/L,相比馬素梅等[31]研究的粘紅酵母(Rhodotorulamucilaginous)在30 mL/250 mL培養(yǎng)生物量和油脂質(zhì)量濃度分別為3.10和4.25 g/L,可知該菌具有高密度培養(yǎng)的潛能。高轉(zhuǎn)速易使自溶酶釋放導(dǎo)致菌體破裂內(nèi)容物流出[32]。本試驗(yàn)菌種在轉(zhuǎn)速220 r/min的高液體剪切力下菌體增殖和積累油脂皆得到提高,該轉(zhuǎn)速使生物量高達(dá)18.73 g/L,油脂質(zhì)量濃度為8.26 g/L。本研究根據(jù)響應(yīng)面模型設(shè)計(jì)和驗(yàn)證結(jié)果,可知桔青霉Asc2-4優(yōu)化后的最高生物量和油脂含量比優(yōu)化前分別提高65.57%和224.72%,實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測的響應(yīng)值吻合良好。經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化后的桔青霉Asc2-4油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到45.88%,高于16.7%～30.0%的斯達(dá)氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、12.38%～30.87%的卷枝毛霉菌(Mucorcircinelloides)、22.1%的小球藻(Chlorellavulgaris)、23.9%的珊瑚色諾卡氏菌(Nocardiacoralline)等產(chǎn)油微生物[33]。

微生物油脂不僅為人類提供營養(yǎng)膳食和疾病預(yù)防所需物質(zhì),還在化石能源緊缺的當(dāng)下有望成為替代能源[34-35]。目前,研究得較為成熟的產(chǎn)油真菌高山被孢霉(Mortierellaalpina)被認(rèn)定是長鏈多不飽和脂肪酸生產(chǎn)的重要工業(yè)化菌株[36],與其所產(chǎn)的長鏈不飽和脂肪酸ARA相比,桔青霉Asc2-4的中鏈脂肪酸C16與C18脂肪酸含量較高,占總脂肪的96.26%。Papapolymerou等[37]研究微生物油脂發(fā)現(xiàn),C16和C18脂肪酸含量占比高,能降低碘值,使油脂具有更好的點(diǎn)火質(zhì)量,且作為生物柴油有較好的脂肪甲酯性能。因此,桔青霉Asc2-4發(fā)酵油具有開發(fā)為生物質(zhì)能源的潛力。本研究為海鞘共附生微生物桔青霉Asc2-4開發(fā)成工業(yè)產(chǎn)油菌株提供了理論依據(jù)。