欒鎬彤，李琦

1 南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院（第二臨床醫(yī)學院）耳鼻喉科，廣州 510280；2 廣州市第一人民醫(yī)院耳鼻喉科；3 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院（第一臨床醫(yī)學院）耳鼻咽喉頭頸外科

變應性鼻炎（AR）全球發(fā)病率為10%～40%，臨床表現(xiàn)為清水樣鼻涕、鼻癢及鼻塞等，中重度患者常反復發(fā)作，誘發(fā)哮喘、中耳炎等疾病，嚴重影響生活質(zhì)量［1-2］。微小核糖核酸Let-7e（miR-Let-7e）編碼基因位于19q13.41，無蛋白編碼功能，能夠調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥因子表達，參與機體炎癥反應及腫瘤發(fā)生等過程［3-4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRLet-7e能夠通過靶向抑制Fas配體表達，維持Ⅰ型和Ⅱ型輔助性T淋巴細胞平衡，在AR發(fā)生中發(fā)揮抑制效應，是潛在的AR 生物標志物［5］?？扇苄訡D48（sCD48）是免疫球蛋白樣受體CD2 亞家族成員，是膜結(jié)合型CD48 的可溶性形式，參與淋巴細胞、樹突狀細胞和內(nèi)皮細胞的激活和分化過程［6］。研究發(fā)現(xiàn)，間歇性AR 患者血清sCD48 水平升高，是間歇性AR 早期診斷的血清生物學標志物［7］。本研究觀察了AR 患者血清miR-Let-7e、sCD48 水平變化，并分析二者與患者病情嚴重程度的關系，為AR 的診斷及病情判斷提供依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標準：①AR 診斷標準符合中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編輯委員會鼻科組2015年制定的《中國變應性鼻炎診斷和治療指南》［8］；②既往未進行AR 相關治療。排除標準：①合并鼻中隔偏曲、鼻腔鼻竇占位；②處于鼻炎、鼻竇炎急性加重期及哮喘急性加重期。選取2020 年2 月—2023年2月廣州市第一人民醫(yī)院收治并符合上述標準的AR 患者102 例作為觀察組，其中男54 例、女48 例，年齡（36.58 ± 5.13）歲，發(fā)作時間呈間歇性42例、持續(xù)性60 例，變應原呈季節(jié)性44 例、常年性58 例，變應性鼻炎評分（SFAR 評分）≥7 分64 例、＜7 分38 例，病情嚴重程度［8］為輕度36例、中度34例、重度32例，免疫球蛋白E（IgE）陽性69 例。選取同期體檢健康志愿者60 例作為對照組，其中男33 例、女27 例，年齡（35.97 ± 6.13）歲。兩組性別、年齡均具有可比性（P均＞0.05）。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核（AF/SQ-01-007），患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 血清miR-Let-7e檢測 采用實時熒光定量PCR法。抽取觀察組治療前及對照組入組后的清晨空腹靜脈血5 mL，室溫靜置1 h，3 000 r/min 離心10 min，取上層血清。采用TRIzol法提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR反應。PCR反應體系10 μL：模板1 μL，2×SYBR Green Premix 5 μL，正反向引物各1 μL，無酶水2 μL。PCR反應過程：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，變性退火延伸共40個循環(huán)。miR-Let-7e上游引物：5'-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3'，下游引物：5'-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3'；內(nèi)參U6上游引物：5'-AGTAAGCCCTTGCTGTCAGTG-3'，下游引物：5'-CCTGGGTCTGATAATGCTGGG-3'。采用2-ΔΔCt法計算血清miR-Let-7e相對表達量。

1.3 血清sCD48 檢測 采用ELISA 法。取“1.2”剩余血清，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書進行具體實驗操作，檢測血清sCD48水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS27.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用K-S正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布以表示，結(jié)果比較采用方差分析或t檢驗，重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，結(jié)果比較采用秩和檢驗。兩變量間的相關性檢驗采用Spearman相關分析法。以AR患者病情程度為因變量（中重度 = 1、輕度 = 0），以血清miR-Let-7e、sCD48為自變量，進行影響中重度AR發(fā)生的多因素Logistic回歸分析。繪制血清miR-Let-7e、sCD48單獨及聯(lián)合檢測預測中重度AR的受試者工作特征（ROC）曲線，分析其預測價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-Let-7e、sCD48 水平比較 觀察組血清miR-Let-7e、sCD48 水平分別為2.32 ± 0.57、（4.52 ± 0.68）μg/L，對照組分別為4.69 ± 0.64、（0.42 ± 0.16）μg/L，兩組比較P均＜0.05。

2.2 不同臨床特征的AR 患者血清miR-Let-7e、sCD48水平比較 見表1。

表1 不同臨床特征的AR患者血清miR-Let-7e、sCD48水平比較（）

表1 不同臨床特征的AR患者血清miR-Let-7e、sCD48水平比較（）

注：不同臨床特征比較，*P＜0.05。

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2.3 AR患者血清miR-Let-7e、sCD48與病情嚴重程度、SFAR 評分、IgE 陽性的關系 AR 患者血清miRLet-7e 與病情嚴重程度、SFAR 評分、IgE 陽性均呈負相關關系（r分別為-0.612、-0.589、-0.710，P均＜0.05），血清sCD48 與病情嚴重程度、SFAR 評分、IgE 陽性均呈正相關關系（r分別為0.540、0.657、0.721，P均＜0.05）。

2.4 血清miR-Let-7e、sCD48 與中重度AR 發(fā)生的關系 多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清miRLet-7e 升高是影響中重度AR 發(fā)生的獨立保護因素，血清sCD48 升高是影響中重度AR 發(fā)生的獨立危險因素（β分別為-0.456、0.581，OR值分別為0.634、1.788，95%CI分別為0.469～0.857、1.289～2.480，P均＜0.05）。見表2。

表2 血清miR-Let-7e、sCD48影響中重度AR發(fā)生的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.5 血清miR-Let-7e、sCD48對中重度AR發(fā)生的預測價值 血清miR-Let-7e、sCD48單獨與聯(lián)合預測中重度AR發(fā)生的曲線下面積及95%CI分別為0.798（0.740～0.869）、0.823（0.753～0.879）、0.884（0.813～0.934），敏感度分別為59.3%、62.8%、90.8%，特異度分別為78.3%、80.2%、.75.3%。見表3、OSID碼圖1。

表3 血清miR-Let-7e、sCD48預測中重度AR發(fā)生的ROC曲線分析結(jié)果

3 討論

AR 是一種由空氣中的過敏原引起，并由IgE 介導的鼻腔過敏性炎癥疾病。我國成人AR 發(fā)病率達17.6%，并且呈逐漸上升趨勢［9］。中重度AR 發(fā)生時，可能導致患者睡眠障礙、焦慮抑郁等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量及工作學習效率。AR 早期病理特征主要為過敏原特異性IgE 結(jié)合肥大細胞受體，從而引起組胺釋放，而在AR 晚期以大量炎癥細胞如嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞的活化及大量炎癥因子釋放為主［10］。深入研究AR 的發(fā)病機制，尋找能夠評估AR 病情程度的血清標志物，對于AR 的早期診治具有重要臨床意義。

miRNA 是一類長度較小的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)細胞分化、增殖及先天和后天的適應性免疫。miR-Let-7e 是近年來發(fā)現(xiàn)的微小RNA 之一，參與調(diào)節(jié)CD4+T 淋巴細胞浸潤和Th2 型細胞因子釋放，與哮喘等過敏性疾病密切相關［11］。本研究結(jié)果顯示，AR患者血清miR-Let-7e水平降低，這與既往學者報道的AR患者及AR小鼠鼻黏膜組織中miR-Let-7e降低的結(jié)果一致［12］。本研究結(jié)果顯示，AR患者血清miR-Let-7e與病情嚴重程度、SFAR 評分、IgE 均呈負相關關系，提示miR-Let-7e表達下調(diào)參與了AR的發(fā)生發(fā)展。分析其原因，miR-Let-7e表達下調(diào)導致抗原提呈細胞中信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子3的激活，誘導單核巨噬細胞及淋巴細胞的過度激活，粒單集落刺激因子及白細胞介素4等促炎因子大量釋放，從而參與加重炎癥反應，促進AR的發(fā)生發(fā)展［13］。一項關于AR 動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，AR 發(fā)生時miR-Let-7e表達下調(diào)，其靶基因Janus 激酶1 和細胞因子信號傳導抑制因子4 mRNA穩(wěn)定性增加，二者共同作用促進嗜酸性粒細胞、B淋巴細胞等免疫細胞釋放組胺、IgE和TNF-α，從而加重AR病情，而過表達miR-Let-7e能夠抑制AR 小鼠的炎癥水平，抑制AR 疾病進展［12］。本研究結(jié)果顯示，血清miR-Let-7e升高是影響中重度AR 發(fā)生的獨立保護因素，提示miR-Let-7e 能夠抑制中重度AR 的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，給予miR-Let-7e mimics能夠抑制過敏性氣道炎癥動物模型氣道黏膜上皮細胞中白細胞介素13的產(chǎn)生，減少過敏原誘導的氣道黏液產(chǎn)生，抑制氣道的過敏性炎癥［14］。因此，miR-Let-7e 表達下調(diào)參與了AR 的發(fā)生發(fā)展，是評估AR病情嚴重程度的血清學標志物。

CD48是一種糖基磷脂酰肌醇蛋白，包括膜受體及分泌型sCD48兩種形式，不僅存在于造血細胞、單核細胞、中性粒細胞表面，還能夠作為黏附分子結(jié)合中性粒細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞等，發(fā)揮共刺激效應［15］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，過敏性哮喘、鼻炎患者血清sCD48 水平升高，提示sCD48 可能是疾病早期診斷的新型血清生物標志物［16-17］。本研究結(jié)果顯示，AR 患者血清sCD48 升高，并與病情嚴重程度、SFAR評分、IgE陽性呈正相關關系，提示sCD48參與了AR的發(fā)生發(fā)展。AR患者血清sCD48水平上調(diào)可能與嗜酸性粒細胞激活有關。也有研究證實，特應性皮炎患者皮膚病損組織中sCD48 表達升高，并且體外細胞實驗顯示應用金黃色葡萄球菌外毒素激活嗜酸性粒細胞后，嗜酸性粒細胞分泌sCD48 水平也升高［18］。sCD48 作為一種共刺激分子，參與促進免疫細胞激活。研究表明，sCD48能夠與肥大細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞表面的CD244 受體結(jié)合，促進TNF-α、白細胞介素1 及白細胞介素4 等促炎細胞因子的釋放，加重鼻黏膜炎癥反應［19］。此外，血清sCD48 水平能夠反映AR 患者CD48 的表達水平，而CD48 作為肥大細胞和嗜堿性粒細胞的表面活化受體，能夠激活磷脂酰肌醇3-激酶通路，促進白三烯、血管內(nèi)皮生長因子表達和分泌，從而加重AR患者噴嚏和鼻塞癥狀［20］。本研究結(jié)果顯示，血清miR-Let-7e、sCD48 聯(lián)合預測中重度AR 的曲線下面積及敏感度均高于單獨預測，提示二者聯(lián)合對于AR患者的病情預測具有重要價值。

綜上所述，AR 患者血清miR-Let-7e 水平降低、sCD48水平升高，二者與患者病情嚴重程度有關，聯(lián)合檢測有助于判斷患者病情。但本研究未對miRLet-7e、sCD48 在AR 發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制進行研究，有待今后設計細胞實驗和動物實驗進一步驗證，以期為AR的臨床治療提供新的靶點。