段聯(lián)勃，柯順川，符海霞，楊麗蓉，曹士先，徐杰

1.武夷星茶業(yè)有限公司，福建 武夷山 354300；2.福建省企業(yè)技術(shù)中心，福建 武夷山 354300

茶樹是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)栽種地域跨度大，分布廣泛。茶園內(nèi)草類龐雜，有名錄的達(dá)到241種。這些雜草在茶園瘋長(zhǎng)，會(huì)搶奪茶樹的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)成為孕育茶園病蟲害的溫床，最終影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，茶園雜草防控是茶園管理中一項(xiàng)重要的工作，隨著人工成本的不斷提高，使用化學(xué)除草劑已經(jīng)成為茶園雜草控制的重要手段。但大量使用化學(xué)除草劑會(huì)導(dǎo)致水土流失，給茶園帶來污染[1-3]。

滅草松（Bentazone，CAS 號(hào)：25057-89-0），是由巴斯夫公司研制的一種廣譜、高效、低毒的苯并噻二唑類除草劑，兼具觸殺性與內(nèi)吸性，其在植物體內(nèi)經(jīng)過還原代謝后會(huì)生成對(duì)人體具有危害的6-羥基滅草松和8-羥基滅草松兩種代謝產(chǎn)物。最新實(shí)施的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中2,4-滴丁酸鈉鹽等112 種農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763.1—2022）中明確規(guī)定，滅草松的殘留物（滅草松與兩種代謝產(chǎn)物之和）在茶葉中不得超過0.1 mg/kg，但未指明所使用的檢測(cè)方法。

對(duì)滅草松分析檢測(cè)方法當(dāng)前已有較多研究，如劉軍[4]采用氣相色譜法測(cè)定飲用水中的滅草松含量，周繼恩等[5]和程曼曼[6]用氣相色譜質(zhì)譜法（GC/MS）測(cè)定水中滅草松含量，陳杰等[7]用三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS/MS）檢測(cè)水中的滅草松殘留，段星春等[8]利用離子色譜法對(duì)水源中的2,4-D和滅草松進(jìn)行了分析檢測(cè)，還有許多研究者用三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用法（HPLC-MS/MS） 對(duì)飲用水、玉米、小麥、水稻和大豆等基質(zhì)中的滅草松進(jìn)行檢測(cè)[9-22]。然而對(duì)茶葉中的滅草松殘留物檢測(cè)的研究卻鮮有報(bào)道，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是使用氣相色譜-質(zhì)譜法[23]，但其前處理過程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)且成本較高。本研究前處理階段采用0.1%冰乙酸-甲醇溶液提取，石墨化碳黑（GCB）和N-丙基乙二胺（PSA）組成的混合填料凈化。使用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析檢測(cè)，建立了茶葉基質(zhì)樣品中滅草松及其代謝物殘留量的提取分析方法。方法前處理提取凈化具有操作簡(jiǎn)單、速度快的特點(diǎn)，檢測(cè)具有靈敏度高、精密度好的優(yōu)點(diǎn)，適合用于不同品類茶葉基質(zhì)樣品中滅草松及其代謝物的分析測(cè)量。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

FZ102型微型茶葉粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司），AL104型雙量程電子天平〔梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司〕，KQ-400DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），H1850型臺(tái)式高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司），UPT-Ⅱ-20T 型超純水機(jī)（成都超純科技有限公司），TRIPLE QUAD 4500 型超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）。

1.2 主要材料與試劑

甲醇、甲酸、醋酸銨（色譜純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純），瑞典歐普森公司；冰乙酸（優(yōu)級(jí)純），天津市永大化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鎂（分析純），天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；無水乙酸鈉（分析純），天津市永大化學(xué)試劑有限公司；GCB（粒度38～124μm），博納艾杰爾公司；PSA（40～60μm），博納艾杰爾公司；尼龍濾頭（有機(jī)系0.22 μm），江蘇綠盟科學(xué)儀器有限公司；滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（含量＞99.0%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

烏龍茶樣品武夷巖茶、紅茶樣品武夷紅茶、白茶樣品福鼎白茶由武夷星茶業(yè)有限公司提供；綠茶樣品浙江獅峰龍井、黑茶樣品湖南安化黑茶、黃茶樣品安徽霍山黃大茶通過電商平臺(tái)采購。

1.3 色譜分析條件

液相色譜柱使用菲羅門的Kinetex@2.6 μm Biphenyl 100 A，型號(hào)為L(zhǎng)C Column 100 mm×3.0 mm色譜柱；添加10 mmoL 醋酸銨0.1%甲酸水溶液為A 相，100%乙腈為B 相；流動(dòng)相流速設(shè)定：0.5 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；色譜柱溫度控制：40 ℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4 質(zhì)譜分析條件

采用電噴霧電離離子源（ESI）；選用負(fù)離子掃描模式， 掃描方式選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），持續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間7 min；氣簾氣：35 PSI；離子源溫度550 ℃，離子化電壓-4.5 kV；噴霧氣GS1：50 PSI；輔助加熱氣GS2：50 PSI；定性離子（q）、定量離子（Q）、去簇電位（DP）、碰撞能量（CE）見表2。

表2 質(zhì)譜條件參數(shù)

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存溶液：準(zhǔn)確稱取適量滅草松及兩種代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別用甲醇進(jìn)行溶解并定容配制成500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液。

中間儲(chǔ)存溶液：準(zhǔn)確移取3種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存溶液各2.5 mL 于25 mL 的容量瓶中，分別用甲醇定容至25 mL，配制成50 mg/L的中間儲(chǔ)存溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存溶液（依據(jù)3種藥物響應(yīng)強(qiáng)度不同，滅草松0.5 mg/L、6-羥基滅草松和8-羥基滅草松為0.1 mg/L）：分別移取滅草松中間液0.25 mL、6-羥基滅草松和8-羥基滅草松中間液各0.05 mL 于25 mL的容量瓶中，并用甲醇定容至25 mL。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取滅草松及代謝物為陰性的茶葉樣品，依照下文樣品前處理的方法進(jìn)行處理，獲得茶葉基質(zhì)空白提取液。再依據(jù)實(shí)際需要，用此基質(zhì)空白提取液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，該溶液應(yīng)臨配現(xiàn)用。

1.6 樣品前處理方法

本試驗(yàn)前處理過程參照茶葉QuEChERS 方法進(jìn)行提取凈化[24-25]。具體處理過程如下：將各茶類樣品用茶葉微型粉碎機(jī)磨成粉末，并過70 目篩后作為分析樣品冷凍保存?zhèn)溆谩７Q取1 g（精確到0.01 g）分析樣品于5 mL的離心管中，再先后加入0.1 g CH3COONa、0.1 g MgSO4、5 mL 0.1%冰乙酸-甲醇溶液，搖勻后超聲提取5 min，5 000 r/min離心5 min，移取上清液2 mL至凈化管中（向5 mL離心管中加入0.05 g PSA、0.05 g GCB、0.15 g Mg-SO4混合制得），渦旋震蕩，5 000 r/min離心5 min，移取上清液0.5 mL 加0.5 mL 0.1%甲酸水溶液，渦旋混勻過0.22 μm有機(jī)濾膜，以待超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.7 方法驗(yàn)證

依據(jù)《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》（GB/T 27417—2017），通過討論線性、檢出限、定量限、基質(zhì)效應(yīng)、回收率和精密度等6個(gè)方面對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

GB 2763.1—2022 規(guī)定，茶葉中滅草松的限量要求為不得大于0.1 mg/kg，對(duì)應(yīng)方法進(jìn)樣含量為0.01 mg/L。在日常監(jiān)控中很少有超過這一限值的殘留，這一限量作為線性的關(guān)注限量在實(shí)際中并不合適，因此本方法將關(guān)注限量定為2 倍定量限。先選取滅草松及代謝產(chǎn)物為陰性的不同茶類茶葉作為參試樣品，按照前述前處理步驟進(jìn)行處理，獲得不同茶類茶葉基質(zhì)空白提取液，分別配制成滅草松0.001、0.002、0.004、0.006、0.010 mg/L；6-羥基滅草松和8-羥基滅草松0.000 2、0.000 4、0.000 8、0.001 2、0.002 0 mg/L 系列基質(zhì)匹配線性工作溶液，經(jīng)超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定獲得不同茶類茶葉基質(zhì)對(duì)應(yīng)線性方程。數(shù)據(jù)顯示，六大茶類3 種藥物的線性方程的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.995，線性相關(guān)性良好（表3）。

表3 六大茶類中滅草松及其代謝物的線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 滅草松及其代謝物的檢出限與定量限

本方法下滅草松、6-羥基滅草松和8-羥基滅草松的保留時(shí)間分別為2.89、2.84、2.72 min，其空白茶樣基質(zhì)，滅草松0.005 mg/kg及6-羥基滅草松、8-羥基滅草松0.001 mg/kg，滅草松0.010 mg/kg 及6-羥基滅草松、8-羥基滅草松0.002 mg/kg添加量下的MRM 色譜圖見圖1。滅草松在0.005 mg/kg 及6-羥基滅草松、8-羥基滅草松在0.001 mg/kg 的添加量下，其離子豐度強(qiáng)度與噪音信號(hào)的比值已滿足檢出限S/N=3 的要求；滅草松在0.010 mg/kg 及6-羥基滅草松、8-羥基滅草松0.002 mg/kg 的添加量下，其離子豐度強(qiáng)度與噪音信號(hào)的比值已滿足定量限S/N=10的要求；在不同添加量下，3種農(nóng)藥出峰時(shí)間穩(wěn)定，空白茶樣基質(zhì)色譜圖在保留時(shí)間未出現(xiàn)干擾峰，進(jìn)一步說明了該方法穩(wěn)定可靠，滅草松檢出限為0.005 mg/kg，定量限為0.010 mg/kg；6-羥基滅草松、8-羥基滅草松檢出限為0.001 mg/kg，定量限為0.002 mg/kg。定量限遠(yuǎn)低于《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中2,4-滴丁酸鈉鹽等112種農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763.1—2022）中0.1 mg/kg 的限量要求。

圖1 不同添加量下滅草松及其代謝物的MRM色譜圖

2.3 不同茶類的基質(zhì)效應(yīng)

茶葉中含有豐富的有機(jī)質(zhì)和色素成分，這些復(fù)雜基質(zhì)成分對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)分析有一定的干擾，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，一般表現(xiàn)為對(duì)分析物檢測(cè)信號(hào)起到增強(qiáng)或抑制的作用，這些作用被稱為基質(zhì)效應(yīng)。斜率對(duì)比法是基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估常用的方法，即用不同茶類茶葉的基質(zhì)空白液配制線性曲線獲得的曲線斜率與空白溶劑所配制線性曲線獲得的斜率的比值進(jìn)行評(píng)估。比值大于1說明有基質(zhì)增強(qiáng)作用，值越大增強(qiáng)效果越顯著；比值小于1有基質(zhì)抑制作用，值越小抑制效果越顯著。試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，六大茶類中除了綠茶對(duì)6-羥基滅草松有一定的抑制作用外，其他都是基質(zhì)增強(qiáng)作用；3種農(nóng)藥中8-羥基滅草松的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)最明顯，其次是滅草松，6-羥基滅草松相對(duì)最弱。當(dāng)基質(zhì)起抑制作用時(shí)，農(nóng)藥響應(yīng)受到削弱，檢測(cè)結(jié)果會(huì)偏?。划?dāng)基質(zhì)起增強(qiáng)作用時(shí)，農(nóng)藥響應(yīng)受到增強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果則會(huì)偏大。為了抵消基質(zhì)效應(yīng)的影響，本研究采用不同茶類基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液來進(jìn)行測(cè)量。

2.4 回收率與精密度

選用不含滅草松及其代謝物的六大茶類茶葉樣品為試驗(yàn)樣本，滅草松及其代謝物分別添加3個(gè)含量水平（定量限、2 倍定量限和10 倍定量限），每個(gè)水平平行添加6個(gè)參試樣品，按前述步驟進(jìn)行前處理操作測(cè)試，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，獲得相應(yīng)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）數(shù)據(jù)（表4）。數(shù)據(jù)顯示，滅草松、6-羥基滅草松和8-羥基滅草松在相應(yīng)加標(biāo)水平下的平均回收率為65.3%～110.5%，RSD（n=6）在1.3%～13.2%之間?；厥章屎蚏SD 均符合《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》（GB/T 27417—2017）標(biāo)準(zhǔn)要求。

表4 不同茶類不同添加濃度下滅草松及其代謝物的回收率和精密度 %

3 小結(jié)與討論

首次建立了利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)茶葉中滅草松及其代謝物殘留量的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)條件下，在0.001 ～0.010 mg/L含量范圍內(nèi)滅草松具有較好的線性關(guān)系，其代謝物在0.000 2～0.002 0 mg/L含量范圍內(nèi)同樣具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.995；滅草松及其代謝物的定量限分別為0.010 mg/kg 和0.002 0 mg/kg；在對(duì)應(yīng)加標(biāo)水平下的平均回收率65.3%～110.5%，RSD（n=6）1.3%～13.2%。該方法提取凈化步驟簡(jiǎn)單、快捷、成本低，方法靈敏度和精密度能夠滿足茶葉中滅草松及其代謝物的檢測(cè)需求。