楊順文,楊濯羽,蘇子郡,焦文龍,卡 偉,史小寧

(1.甘肅省水產(chǎn)研究所,甘肅 蘭州 730000;2.甘肅省黃河上游漁業(yè)資源環(huán)境野外科學(xué)觀測研究站,甘肅 蘭州 730030)

生物的遺傳多樣性是生物長期進化的產(chǎn)物,研究生物的遺傳多樣性具有重要意義[1]。對野生魚類遺傳多樣性的研究不僅可以揭示物種的起源與進化歷史,也能為遺傳資源的保存、育種和遺傳改良等工作提供理論依據(jù)[2]。國內(nèi)外學(xué)者對魚類養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析有不少研究報道,包括鯉(Cyprinuscarpio)[3]、羅非魚(Oreochromisniloticus)[4]和大口黑鱸(Micropterussalmoides)[5]等。虹鱒等鱒魚自1959年引入我國,經(jīng)過多年的發(fā)展,已具有一定的規(guī)模,開展虹鱒養(yǎng)殖群體遺傳研究也有較為重要的理論和應(yīng)用價值。

自20世紀80年代以來,簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeats,SSR)即微衛(wèi)星(Microsatellites DNA)技術(shù)逐漸成為使用最多、最重要的分子標記方法之一。微衛(wèi)星具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、呈共顯性遺傳且在基因組內(nèi)分布廣泛等特點[6],被應(yīng)用于種群生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、生態(tài)學(xué)、系統(tǒng)學(xué)、生物多樣性及保護研究、連鎖作圖、性狀關(guān)聯(lián)研究和比較基因組當(dāng)中[7-9]。

虹鱒原產(chǎn)于美國加利福尼亞,1874年經(jīng)人工馴化后在世界各地進行養(yǎng)殖[10],是經(jīng)濟價值較高的冷水性養(yǎng)殖魚類之一。目前,中國已有20多個省市開展了虹鱒養(yǎng)殖,主要產(chǎn)區(qū)在西北的青海、甘肅、新疆以及西南地區(qū)的四川、云南等地。虹鱒肉質(zhì)鮮嫩,營養(yǎng)豐富,適應(yīng)性較強,適合高密度集約化養(yǎng)殖,已成為中國重要的淡水養(yǎng)殖魚類品種之一[11]。目前主要養(yǎng)殖道氏虹鱒、甘肅金鱒和挪威虹鱒等品種,豐富了我國冷水性經(jīng)濟魚類的種質(zhì)資源庫。國內(nèi)外許多學(xué)者針對虹鱒多樣性開展了大量研究[12-14],但主要以道氏虹鱒與金鱒的比較研究為主,針對多個虹鱒品系開展遺傳多樣性的研究不多。本文對道氏虹鱒、挪威虹鱒、波蘭虹鱒、甘肅金鱒和丹麥金鱒5個群體的遺傳結(jié)構(gòu)進行微衛(wèi)星標記分析,以期為我國目前主要養(yǎng)殖的虹鱒和金鱒種質(zhì)提供遺傳評估信息,為其遺傳育種研究和實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所使用的5個虹鱒養(yǎng)殖群體樣本于2019年采集于甘肅臨夏鮭鱒魚良種場。試驗中剪取每條魚的尾鰭約0.4～0.5 g,儲存在無水乙醇中(若儲存時間過長需更換乙醇),保存?zhèn)溆?。采用?氯仿法提取每條魚的基因組DNA[15]。分析使用的虹鱒和金鱒群體以及每個群體所分析的個體數(shù)量信息見表1。

表1 群體個體數(shù)量

1.2 引物選取及PCR擴增

依據(jù)趙瑩瑩等[10-12]的報道選取30對引物,由生物公司合成后檢測其多態(tài)性,再從中篩選出多態(tài)性最高的8對引物,在每對微衛(wèi)星的正向引物5′端,采用FAM或HEX熒光染料進行標記,引物信息見表2。

表2 微衛(wèi)星位點的序列及引物信息

1.3 PCR反應(yīng)體系及產(chǎn)物檢測

PCR反應(yīng)體系的總體積為15 μL,參考龐美霞等[11]實驗方法,配置體系。PCR反應(yīng)程序如下:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性35 s,48℃～60℃退火35 s,72℃延伸40 s,共32個循環(huán);72℃終延伸10 min。采用DNA測序儀對PCR產(chǎn)物進行測定[10]。

1.4 統(tǒng)計與分析

使用Gene Marker 2.2軟件對片段大小進行統(tǒng)計。采用軟件Pop Gene 32計算觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)以及Nei’s遺傳距離等參數(shù)。運用Microsoft-toolkit插件獲得多態(tài)信息含量(PIC)。使用MEGA 5.0軟件對5個虹鱒群體的遺傳距離進行聚類分析。使用Arle-quin 3.1軟件計算群體間的分化系數(shù)(Fst)[11-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 各個微衛(wèi)星位點多態(tài)性及群體遺傳多樣性分析

研究結(jié)果顯示,8個微衛(wèi)星標記在所有個體中一共獲得111個等位基因。8個位點的等位基因數(shù)分布在8～18個之間,8個位點的平均等位基因數(shù)為13.875個,位點RT14與RT25的等位基因數(shù)最多,均為18個;位點RT16的等位基因數(shù)最少,為8個,見表3。有效等位基因數(shù)Ne在6.740～15.834之間,觀測雜合度Ho與期望雜合度He分別在0.451～0.901和0.853～0.938之間。PIC是分析群體遺傳多樣性的重要研究內(nèi)容,而本研究所選位點的PIC在0.838～0.933之間,說明它們均為高度多態(tài)性位點(PIC>0.5)。

表3 8個微衛(wèi)星位點遺傳參數(shù)

由表4可知,在所有鱒魚群體中,DR的平均Na最高(13.88),DGR的平均Na最低(5)。各群體的平均He在0.599～0.832之間,平均Ho在0.605～0.788之間,平均PIC在0.532～0.808之間。其中,He和PIC最高的群體為DR,最低的群體為DGR;Ho最高的群體為DR,最低的群體為GR。在所有群體中,DR的Na、Ne、He、Ho和PIC值均較大,這表明DR的群體遺傳多樣性較高;而GR和DGR 2個群體各自的平均多樣性參數(shù)都相對較小,表明相對于其他虹鱒群體,這2個金鱒群體的群體遺傳多樣性較低。

表4 5個鱒魚群體的遺傳多樣性參數(shù)

2.2 群體間遺傳分化分析

8個微衛(wèi)星標記在5個鱒魚群體的遺傳分化分析結(jié)果如表5所示。5個鱒魚群體的Fst值在0.118～0.313之間,群體兩兩間的Fst均差異顯著(P<0.05),表明各群體間皆存在中等及以上程度的遺傳分化。其中,GR和DGR之間Fst差異最大,為0.313;DR和PR之間Fst差異最小,為0.118。通過分析顯示,群體內(nèi)部的遺傳變異為80.13%。這個結(jié)果說明群體間遺傳分化明顯,與所有群體均是人工選育這一事實相符。

表5 5個鱒魚群體的遺傳分化

2.3 群體間遺傳距離及聚類關(guān)系

各個虹鱒群體間的遺傳距離和相似系數(shù)如表6所示,遺傳相似系數(shù)在0.197～0.405之間,遺傳距離為0.905～1.627,可以看出道氏虹鱒和丹麥金鱒的遺傳距離最大,其余各個群體間的遺傳距離在0.905～1.627之間。以遺傳距離為依據(jù),對5個養(yǎng)殖虹鱒群體進行聚類分析,結(jié)果如圖1所示,鄰接樹中共有3大分支,其中NR和PR聚為一支,DR和GR聚為一支,DGR單獨為一支。

圖1 5個鱒魚群體的聚類分析

表6 虹鱒群體間的遺傳距離(下)和遺傳相似性(上)

3 討論

養(yǎng)殖魚類群體的遺傳多樣性問題一直都倍受關(guān)注。我國自1959年引進虹鱒以來,已開展人工養(yǎng)殖多年,由于引進的品種有限,加之存在大量近交繁殖的現(xiàn)象,已經(jīng)嚴重影響了種群的遺傳多樣性,出現(xiàn)了種質(zhì)退化的現(xiàn)象[16-18],該問題會阻礙虹鱒養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展?；螂s合度反應(yīng)各群體在各個位點上的遺傳變異,被認為是一個適合度量群體遺傳變異的參數(shù)[19]。徐浩等[20]對渤海站的4個虹鱒養(yǎng)殖群體的研究表明,2011年挪威虹鱒和美國金鱒的樣本等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)和多態(tài)性信息含量顯著低于2005年樣本(P<0.01)。張艷萍等[21]于2010年的研究顯示,甘肅金鱒的平均期望雜合度為0.498,平均觀測雜合度為0.430,低于本研究中甘肅金鱒的0.668和0.605;道氏虹鱒的平均期望雜合度為0.665,平均觀測雜合度為0.601;楊濯羽等[22]的研究顯示,22個道氏虹鱒平均觀測雜合度和平均期望雜合度分別為0.780和0.771,均低于本研究中道氏虹鱒的0.832和0.788。這可能是由3種原因?qū)е?一是等位基因位點的統(tǒng)計方式不同。與傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染顯色相比,使用熒光標記STR分型技術(shù)檢測到的等位基因數(shù)要比前者多。有研究顯示,利用相同的8對微衛(wèi)星標記對同一物種進行遺傳多樣性研究,使用測序儀分型檢測技術(shù)[23]檢測出的等位基因數(shù)為7～12,而使用傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)[25]檢測出的等位基因數(shù)為2～6。二是微衛(wèi)星標記的種類和具體位點不同可能會影響群體遺傳多樣性各指標的大小。三是為避免近親繁殖而采取的人為干預(yù)措施可能使養(yǎng)殖的虹鱒群體的遺傳多樣性有所提高。

PIC是衡量微衛(wèi)星位點變異程度高低的重要指標。一般認為,在某一群體中,當(dāng)PIC>0.5時該位點表現(xiàn)為高度多態(tài);當(dāng)0.25

基因分化系數(shù)是表征群體間遺傳分化的重要指標。Paaver[25]等采用10個高度多態(tài)性的微衛(wèi)星標記分析了歐洲的12個虹鱒養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性,研究結(jié)果表明呈中度分化。梁俊等[26]研究分析了歐洲鰻鱺和日本鰻鱺的遺傳分化系數(shù),研究結(jié)果大于0.25,認為群體間分化極大。本研究中5個鱒魚群體間的Fst均大于0.05,這表明它們之間存在中等程度以上的遺傳分化。

根據(jù)Nei氏遺傳距離所繪制的5個養(yǎng)殖虹鱒群體的鄰接樹顯示,NR和PR之間的遺傳距離最小,而與DGR的遺傳距離最大。整體上3種虹鱒之間較為接近,2種金鱒之間也較為接近,這個結(jié)果與徐浩等[20]的結(jié)果一致。聚類分析的結(jié)果可以反映親緣關(guān)系的遠近,本研究較好地反映了5個鱒魚群體的親緣關(guān)系。從聚類結(jié)果中發(fā)現(xiàn),2種金鱒的遺傳結(jié)構(gòu)在幾個群體中最近。金鱒為虹鱒的白化群體,丹麥金鱒與甘肅金鱒在最初開展選育時也是在虹鱒群體中選擇其白化群體,最終成為金鱒品種[22]。在虹鱒的選育過程中,主要以速生、抗逆為選育指標,在育種過程中主要以生長性狀為選育標準。而金鱒體色為黃色或金黃色,較虹鱒具有更好的觀賞價值,所以在金鱒的選育過程中,體色成為了一個重要指標。因此,經(jīng)過長期選育的金鱒雖然是由不同國家所培育的品種,遺傳上交流的可能性極小,但較之其他虹鱒品系,2個金鱒品系遺傳結(jié)構(gòu)更為接近。

4 結(jié)論

通過對5個虹鱒群體進行微衛(wèi)星遺傳分析,發(fā)現(xiàn)甘肅臨夏鮭鱒魚良種場保存的鱒魚養(yǎng)殖群體整體上仍具有較高的遺傳多樣性,各個群體間遺傳結(jié)構(gòu)與其他群體分化明顯,具備進一步本地化選育的潛力。然而,2個金鱒群體遺傳多樣性明顯低于其他虹鱒群體,在進行本地化選育或人工繁育時仍應(yīng)注意避免繁殖親本群體過小等問題,以保護金鱒群體的遺傳多樣性不再降低。