田 野,崔明仙,顏 焰,簡瑩娜,王光華,王戈平,李秀萍,胡 勇,廖 敏*,馬利青*

(1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310058;2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海省動物疫病病原診斷與綠色防控技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016)

2005年5月,我國首次報道了野生鳥類感染禽流感病毒,造成大批鳥類死亡[1,2]。此次疫情發(fā)生在青海省剛察縣泉吉鄉(xiāng)年乃索麻村的青海湖國家級自然保護(hù)區(qū),該區(qū)的斑頭雁最先出現(xiàn)死亡病例,之后多種遷徙鳥類相繼死亡,死亡數(shù)達(dá)6 000余只,后經(jīng)國家相關(guān)部門確診為H5N1亞型禽流感病毒感染造成的疫情[2],這是世界流感流行史上首次發(fā)生的野鳥H5N1高致病性禽流感疫情,此后至2006年5月,H5N1高致病性禽流感遍布亞洲、歐洲、北美30多個國家,幾十種野鳥和家禽被感染[3,4]。青海湖野鳥感染禽流感疫情爆發(fā)的時間和地點(diǎn)基本與候鳥的遷徙路線一致,可見候鳥在禽流感病毒傳播中起非常關(guān)鍵的作用。

青海湖是我國最大的內(nèi)陸咸水湖,每年棲息的水鳥數(shù)以萬計,被稱為“鳥的天堂”,但不同來源背景的鳥類聚集,也使禽流感病毒得以交匯,容易引發(fā)禽流感疫情,造成野生鳥類發(fā)病或死亡,同時還可能將禽流感病毒傳染給家禽。因此,對青海湖野鳥進(jìn)行禽流感檢測仍然非常必要。

本研究于2022年8月收到青海省剛察縣林草站送檢的死亡野鳥尸體,經(jīng)核酸檢測發(fā)現(xiàn)含有H5亞型AIV核酸片段,通過深度測序獲得一株H5N1 AIV的全基因組序列。研究該毒株主要基因片段的序列特征,可為了解鳥類攜帶H5N1亞型禽流感病毒的演化規(guī)律提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品來自青海省剛察縣林草站送檢的野鴨尸體。H5N1病毒陽性核酸模板由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,實(shí)驗(yàn)操作也在該實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 主要試劑

Trizol、PCR Mix、高保真酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自南京諾維贊公司。

1.3 RNA抽提及RT-PCR擴(kuò)增

取死禽病變組織加入適當(dāng)?shù)腜BS充分混勻后,反復(fù)凍融3次,10 000 rpm離心5 min,取上清,按常規(guī)方法(Trizol法)進(jìn)行RNA抽提。抽提的RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。

1.4 禽流感病毒核酸檢測

用實(shí)驗(yàn)室針對禽流感病毒M基因設(shè)計的各亞型通用引物(表1),以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,確定樣品中是否含有AIV核酸。對M基因PCR陽性的樣品進(jìn)一步用H5、H7和H9 3種亞型的基因型鑒定引物(表1)鑒定該流感病毒為何種亞型。擴(kuò)增體系總體積為20 μL,包括2×Taq Plus Master Mix 10 μL、10 mM的上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min,30～35個循壞,每個循環(huán)包括:95℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30～60 s,最后72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

表1 引物信息表

1.5 基因組測序及分析

取部分上述抽提的RNA送上海晶能生物公司進(jìn)行深度二代測序。測序獲得的序列用SPAdes軟件進(jìn)行序列拼接獲得流感病毒的8個基因片段序列,序列的基本信息見表2。在GISAID流感數(shù)據(jù)庫中對獲得的流感病毒的8個基因片段進(jìn)行檢索和比對分析。下載GISAID流感數(shù)據(jù)庫中收錄的青海野鳥H5亞型毒株的各基因序列及代表性毒株的HA和NA序列,采用MEGA 7.0軟件對基因組測序獲得的HA和NA基因片段進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,同時對HA氨基酸糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析(https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetOGlyc-4.0/)。

表2 A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1) 8個基因片段信息

2 結(jié)果

2.1 死禽外觀及肉眼剖檢病變

送檢野鴨身體僵硬,羽毛雜亂。經(jīng)剖檢可見肺部、氣管和支氣管出血嚴(yán)重,腸道出血,肝臟質(zhì)脆易碎。

2.2 核酸檢測及分型鑒定結(jié)果

從采集的氣管、肺抽提的核酸成功擴(kuò)增到AIV特異性的M基因片段(詳見圖1),進(jìn)一步用實(shí)驗(yàn)室設(shè)計的AIV H5、H7、H9分型引物對AIV陽性的核酸進(jìn)行分型鑒定,結(jié)果只有野鳥組織樣品和陽性對照樣品中檢測到H5亞型AIV陽性,H7和H9亞型AIV為陰性(詳見圖2)。

圖1 組織樣品中的檢測結(jié)果

圖2 AIV亞型檢測結(jié)果

2.3 AIV基因組二代測序結(jié)果

從組織中抽提的RNA經(jīng)二代測序拼接后,獲得了AIV的8個基因序列,其核苷酸長度及其編碼氨基酸序列長度如表2所示。經(jīng)序列比對分析,除了NS基因的氨基酸序列與H6N2、H5N3亞型AIV有較高相似性外,各基因片段的氨基酸與H5N1亞型AIV相應(yīng)片段的同源性最高(詳見表2)。結(jié)合核酸檢測和分型鑒定結(jié)果,認(rèn)為樣品中含有H5N1亞型禽流感病毒基因組,死亡的野鴨感染了H5N1亞型禽流感病毒。本研究所鑒定的H5N1亞型AIV命名為A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)。

2.4 HA基因分析

HA基因的同源性分析顯示,A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)的HA基因與國內(nèi)最先發(fā)現(xiàn)的H5N1亞型毒株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)的同源性為91.03%,與2005年引起青海湖野鳥爆發(fā)禽流感疫情的毒株A/bar-headed goose/Qinghai/0510/05(H5N1) HA同源性為91.55%,與近年來在野鴨中流行的毒株A/wild duck/Hebei/SD012/2021(H5N1)同源性則達(dá)99.12%。

A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)HA的裂解位點(diǎn)為“PLREKRRKRGLF”,與多株高致病性H5Nx毒株一致,具有5個連續(xù)的堿性氨基酸“KRRKR”[5,6],且含有27NST29、39NVT41、140NHT142、180NNT182、208NPT210、301NSS303、498NGT500、557NGS559糖基化位點(diǎn),符合高致病性禽流感病毒的分子特征。根據(jù)世界衛(wèi)生組織對高致病性禽流感病毒的分類規(guī)則[7],在基于HA基因的遺傳進(jìn)化分析中發(fā)現(xiàn),A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)歸屬于高致病性禽流感病毒2.3.4.4b分支(詳見圖3),與2020年以來在青海湖地區(qū)流行的野鳥和野鴨的H5N1在同一小分支中,而與2015年以前青海湖地區(qū)流行的毒株遺傳距離較遠(yuǎn)。

圖3 HA基因的遺傳進(jìn)化分析

2.5 NA基因分析

NA基因的同源性分析顯示,A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)的NA基因與國內(nèi)最先發(fā)現(xiàn)的H5N1亞型毒株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)的同源性為93.22%,與2005年引起青海湖地區(qū)野鳥爆發(fā)禽流感的毒株A/bar-headed goose/Qinghai/0510/05H5N1 HA同源性為88.35%,與近年來在野鴨中流行的毒株A/wild duck/Hebei/SD012/2021(H5N1)同源性為97.03%。在基于NA基因的遺傳進(jìn)化分析中發(fā)現(xiàn),A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)與所有用于分析的青海地區(qū)流行的H5N1毒株和在廣東最先分離到的H5N1毒株歸屬于同一個分支,而N5和N6亞型的毒株則歸屬于不同的分支中(詳見圖4)。

圖4 NA基因的遺傳進(jìn)化分析

3 討論

自2005年大量野生候鳥感染高致病性禽流感(HPAI)病毒(H5N1)的疫情發(fā)生以來,有關(guān)青海湖地區(qū)野鳥攜帶H5亞型AIV的報道一直沒有間斷。2022年青海湖地區(qū)又出現(xiàn)了野禽非正常死亡的現(xiàn)象。本研究從一只死亡的野鴨組織中檢測到H5亞型AIV,將測序獲得的A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1) 8個基因序列進(jìn)行比對分析,除了NS蛋白與H6N2、H5N3具有最高的同源性外,其余基因片段與野禽或家禽來源的H5N1亞型AIV遺傳距離最近,進(jìn)一步全基因組測序分析表明野鴨感染的毒株為H5N1亞型AIV,將其命名為A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)。

為進(jìn)一步了解2022年在青海湖地區(qū)流行的H5N1毒株的分子特性,我們下載了青海湖地區(qū)不同時期流行的毒株序列,與最先在禽類中流行的H5N1亞型毒株以及最近幾年在野鳥中流行的參考毒株進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1) HA氨基酸序列與國內(nèi)最先發(fā)現(xiàn)的H5N1亞型毒株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)的同源性為91.03%,與2005年引起青海湖野鳥爆發(fā)禽流感疫情的毒株A/bar-headed goose/Qinghai/0510/05 (H5N1)HA同源性為91.55%,與近年來在野鴨中流行的毒株A/wild duck/Hebei/SD012/2021(H5N1)同源性則達(dá)99.12%;NA蛋白與上述3個序列的同源性則分別為93.22%、88.35%和97.03%。同源性分析結(jié)果表明,2022年的毒株A/wigeon/Qinghai/2022(H5N1)與1996年出現(xiàn)的H5N1以及2005年青海湖地區(qū)流行的毒株HA基因的同源性均較低,為91%左右,與這兩個基因的遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果一致。

A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)HA的裂解位點(diǎn)為“PLREKRRKRGLF”,含有5個連續(xù)的堿性氨基酸“KRRKR”,具有高致病性禽流感的特征?！癙LREKRRKRGLF”裂解位點(diǎn)在H5N1、H5N2、H5N5、H5N8亞型中有過報道,感染的宿主有家禽、野鳥和人[8]。此外,糖基化分析表明,A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)HA基因含有8個潛在的糖基化位點(diǎn)27NST29、39NVT41、140NHT142、180NNT182、208NPT210、301NSS303、498NGT500、557NGS559,其中NST、NVT、NNT、NSS、NGT、NGS為大多數(shù)致病性H5亞型毒株所共有[9,10]。HA裂解位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)分析結(jié)果表明A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)具有高致病性禽流感的特征。

在以HA基因構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹中,A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)被歸入2.3.4.4b的分支,與2016年后在青海地區(qū)鑒定到的毒株歸屬于同一分支[11]。自2020年底以來,2.3.4.4b分支的HPAI H5N1已成為在野生和家養(yǎng)禽類中流行的主要亞型[5]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織對H5亞型AIV的分型標(biāo)準(zhǔn)[7],依據(jù)HA基因的遺傳進(jìn)化樹進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),2005年在青海流行的毒株被歸類至2.2分支。隨后,在鳥類遷徙路線途經(jīng)的國家和地區(qū)先后發(fā)現(xiàn)了該基因型毒株。2006—2009年,在中國、蒙古、俄羅斯、德國、埃及和尼日利亞的野禽中都分離到了2.2分支的病毒[3,4],但很少有2.2分支的病毒感染家禽的報道。2009-2015年,青海湖地區(qū)流行的AIV又進(jìn)一步演化,出現(xiàn)了2.3.2分支的病毒[12]。從野鳥中分離到的2.3.2分支病毒均是在候鳥遷徙路線上分離到的,表明遷徙候鳥在傳播AIV中發(fā)揮了重要作用。2015年至今,在青海湖地區(qū)分離到的毒株進(jìn)化為2.3.4.4分支,而且這一分支病毒除了感染野禽,還引起世界范圍內(nèi)的家禽感染死亡[8]。本研究HA進(jìn)化分析的結(jié)果顯示,2006年以前青海湖地區(qū)流行的毒株主要?dú)w屬于2.2分支,2007年進(jìn)化到2.3.2分支,2015年再進(jìn)化到2.3.4分支,表明病毒是不斷進(jìn)化的。因此,持續(xù)開展對青海湖地區(qū)野鳥中攜帶的AIV的監(jiān)測,對了解AIV的流行、進(jìn)化以及防控措施的制定具有重要意義。

致謝在樣品采集過程中得到剛察縣、海晏縣林草站的大力支持,在此一并致謝。