張曉月，王 濤，左志晗，孫家塍，劉洪瑞，張晶晶，孫金生

（1.天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

水產養(yǎng)殖業(yè)中，益生菌由于能夠在一定程度上促進動物生長，因此應用廣泛[1-2]，尤其是利用益生菌發(fā)酵生產的飼料產品越來越受到養(yǎng)殖業(yè)的青睞[3].目前在水產養(yǎng)殖行業(yè)中應用的菌種比較匱乏且單一，可應用于水產養(yǎng)殖的菌種篩選也沒有新的突破.擺脫菌種結構的單一性、提高應用效果是急需解決的重要問題[4].益生菌制劑主要分為單一菌劑和復合菌劑，單一菌劑是指有效活菌是單一微生物的制劑，如芽孢桿菌制劑、酵母菌制劑等，單一菌劑雖然針對性較強、發(fā)酵工藝簡單，但作用效果比較單一，很難應對養(yǎng)殖環(huán)境復雜和水生生物疾病多樣的情況.復合菌劑是指由2 種以上微生物構成的制劑，如芽孢桿菌與乳酸菌組成的復合微生物添加劑[5]，復合菌劑不僅具有多種功效，且相較于單一菌劑使用效果更加顯著，但大多質量無法保證且無法滿足養(yǎng)殖行業(yè)的需求.如有些復合益生菌的搭配不夠科學，針對性不強，無法適用于不同的養(yǎng)殖環(huán)境和水體，常常不能夠發(fā)揮其應有效果.

益生菌制劑在飼料加工、運輸、貯存過程中容易失去活性[6]，也存在定植于動物腸道時間較短或僅少數能定植在腸壁發(fā)揮作用[7]等問題，因此益生菌制劑的保存和制備方法尤為重要.菌種保存和發(fā)酵劑的制備是保證益生菌制劑能夠正常發(fā)揮原有效果的保障，可以保證菌種活性，減少益生菌制劑在保存及運輸過程中的活性損失[8].現用于益生菌保存和制備的方法主要有真空干燥、冷凍干燥以及噴霧干燥法[9].其中真空冷凍干燥技術具有適用范圍廣、存活率高、保藏時間長、菌種穩(wěn)定性高的特點，同時在儲存和運輸方面成本低且方便快捷[10-12]，是益生菌發(fā)酵劑制備較為理想的方法.可用于微生物凍干保護劑的物質有很多，按照保護劑的性質可分為多元醇類、糖類、蛋白質類、氨基酸和肽類[13-14]，要根據微生物的不同使用適合的保護劑種類和濃度才能夠獲得較好的保護作用.

本課題組前期從健康水產動物腸道中分離篩選出了4 株益生效果較好的動物內源性益生菌，即枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、格式乳球菌（Lactococcus garvieae）、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）和酵母菌（Yeast），本研究以4 株菌為實驗菌株，進行發(fā)酵共培養(yǎng)，通過無機鹽去除實驗優(yōu)化初始培養(yǎng)基，通過凍干保護劑篩選實驗選出適合的保藏保護劑.研究可為開發(fā)適合水產養(yǎng)殖用復合益生菌制劑提供實驗指導.

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

枯草芽孢桿菌（YA）、格式乳球菌（M4ⅡY）、施氏假單胞菌（JM）、酵母菌（Y），均由本實驗室前期從水產動物半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）腸道中分離鑒定，-80 ℃冰箱中保存.

1.2 實驗試劑

試劑：乙酸鈉、蛋白胨、磷酸氫二鉀，上海邁瑞爾化學技術有限公司；酵母粉、檸檬酸氫二銨，上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司；吐溫80，天津歆毅翎科技有限公司；牛肉浸粉，天津市寶坻區(qū)軍揚生物試劑銷售中心；葡萄糖，天津市沃凱生物科技有限公司；硫酸鎂、硫酸錳，天津凱瑪特化工科技有限公司；TSB 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（HB4114-19）、YPD 液體培養(yǎng)基（HB5193-1）、MRS 肉湯培養(yǎng)基（海博#HB0384-1），青島海博生物技術有限公司.

凍干保護劑：可溶性淀粉、甘油，上海邁瑞爾化學技術有限公司；脫脂奶粉，蒙牛乳業(yè)集團有限公司.

初始培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉浸粉5 g，酵母粉5 g，MgSO40.1 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二銨2 g，K2HPO42 g，MnSO40.05 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 值為7.4.

1.3 菌種活化及擴大培養(yǎng)

將4 株益生菌由保藏狀態(tài)恢復到室溫狀態(tài)，使用一次性接種環(huán)分別將枯草芽孢桿菌與施氏假單胞菌菌液涂布于固體TSB 平板上，格氏乳球菌菌液涂布于MRS 平板，酵母菌菌液涂布于YPD 平板上.涂布后將平板置于培養(yǎng)箱中，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，待長出單菌落后，重復上述步驟，再次活化.

1.4 培養(yǎng)基優(yōu)化（去除無機鹽）

以培養(yǎng)基中不去除任何無機鹽為對照組，逐一去除初始培養(yǎng)基中的各種無機鹽（硫酸鎂、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、硫酸錳），其余成分保持不變，配制成液體培養(yǎng)基，調pH 值到7.4，121 ℃條件下滅菌20 min. 待培養(yǎng)基冷卻后，將活化好的4 株菌（1×108mL-1），以2%的接種量同時接入到液體培養(yǎng)基中，各液體培養(yǎng)設置3 個平行. 置于搖床上，220 r/min、28 ℃培養(yǎng)15 h（時間依據每株菌的生長曲線比對后確定）.將菌株的共培養(yǎng)液梯度稀釋后分別涂布于MRS、TSB、YPD 固體平板上，分別對4 株菌進行平板計數.其中，枯草芽孢桿菌與施氏假單胞菌均涂布于TSB 培養(yǎng)基上.依據菌落形態(tài)區(qū)分計數：枯草芽孢桿菌菌落為多邊形，邊緣毛糙不整齊；施氏假單胞菌菌落為白色圓形，表面光滑濕潤，邊緣整齊.

1.5 固定化吸附劑的選擇

1.5.1 吸附劑吸水性的比較

以稻殼粉、玉米芯粉、牡蠣殼粉和玉米粉4 種粉末作為吸附劑，分別稱取5 g，放入50 mL 燒杯中，每種吸附劑設置3 組平行，燒杯中加蒸餾水至吸附劑完全被水浸沒，靜置2 h 后過濾去除多余水分.稱量吸水飽和后吸附劑的質量，并計算出各種吸水材料的吸水率.計算公式如下：

式中：m2為吸水飽和后吸附劑的質量；m1為吸水前吸附劑的質量.

1.5.2 吸附劑對于4 株菌吸附效果的比較

對4 株菌進行菌種活化，同時接種于共發(fā)酵培養(yǎng)基中進行混菌發(fā)酵.稱取4 種吸附劑各2 g 于三角瓶中，向每個三角瓶中加入混菌發(fā)酵液20 mL，將其混勻.靜置吸附30 min 后取上清液，梯度稀釋后涂平板菌落計數，分析4 種吸附劑的吸附效果.

1.6 益生菌制劑的干燥

采用低溫真空冷凍干燥法對益生菌制劑進行干燥處理.將活化好的混菌轉移到凍存管中，加入不同的保護劑混合均勻（設置3 個平行），先在4℃條件下預冷12 h，然后轉入-80 ℃冰箱中冷凍24 h，最后轉入低溫真空冷凍干燥機中處理26 h，得到凍干菌粉.

1.7 真空凍干保護劑的篩選

將活化好的混菌轉移到凍存管中，每個凍存管中加入不同含量不同種類的凍干保護劑：甘油，體積分數分別為1%、2%、3%、4%、5%；脫脂奶粉，質量分數分別為4%、8%、12%、16%、20%；可溶性淀粉，質量分數分別為4%、8%、12%、16%、20%.每種保護劑的每個含量設置3 個平行，進行低溫冷凍干燥.干燥后將凍干菌粉進行復水并稀釋平板計數，對4 株菌的存活率進行統(tǒng)計并計算，計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化（去除無機鹽）

為實現4 株水產養(yǎng)殖用益生菌的共發(fā)酵培養(yǎng)并且保證每株菌的數量，需要找出能夠使它們共同生長的培養(yǎng)基.根據4 株益生菌單獨培養(yǎng)時分別使用的培養(yǎng)基成分得出初始培養(yǎng)基成分，在利用該初始培養(yǎng)基進行混菌發(fā)酵時，發(fā)現枯草芽孢桿菌始終不生長.由于4 株菌所使用的有機營養(yǎng)成分均相似，只有無機鹽差別較大，推測可能是某種無機鹽對枯草芽孢桿菌的生長有一定的影響，因此設計去除無機鹽實驗，分別統(tǒng)計去除某一種無機鹽后4 株益生菌的數量，結果如圖1 所示.

圖1 去除無機鹽后4 株益生菌的數量Fig.1 Quantity of four probiotic strains after removing of inorganic salts

由圖1（a）可以看出，當培養(yǎng)基中分別去除檸檬酸氫二銨和硫酸鎂時，酵母菌的數量下降，顯著低于對照組的數量，說明這2 種無機鹽是酵母菌生長不可缺少的成分；當分別去除乙酸鈉和磷酸氫二鉀時酵母菌的數量也有所下降，但與對照組之間的差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；去除硫酸錳對酵母菌沒有顯著影響.由圖1（b）可以看出，當分別去除檸檬酸氫二銨和硫酸錳時，施氏假單胞菌的數量顯著下降，生長受到限制，去除磷酸氫二鉀和乙酸鈉對施氏假單胞菌的數量沒有顯著影響，去除硫酸鎂時酵母菌的數量增加.由圖1（c）可以看出，培養(yǎng)基中分別去除檸檬酸氫二銨和硫酸錳時，格氏乳球菌的生長受到顯著影響，而去除其他3 種無機鹽對其沒有顯著限制作用.由圖1（d）可以看出，培養(yǎng)基中只有去除了乙酸鈉枯草芽孢桿菌才能正常生長，因此乙酸鈉是限制枯草芽孢桿菌生長的最主要因素.

2.2 固定化吸附劑的選擇

2.2.1 吸附劑的吸水性

選取4 種常見吸附劑進行吸水性的比較，分別計算每種材料的吸水量和吸水率，結果如圖2 所示.由圖2 可以看出，玉米芯粉的吸水率最高，為5.30%；其次是稻殼粉，吸水率為1.69%，每5 g 的平均吸水量為8.44 g；再次為玉米粉，吸水率為1.26%，每5 g 的平均吸水量為6.29 g；牡蠣殼粉的吸水效果最差，吸水率為0.70%，每5 g 的平均吸水量為3.48 g.

圖2 不同吸附劑的吸水性Fig.2 Water absorption of different adsorbents

2.2.2 吸附劑對4 株菌的吸附效果

比較4 種吸附劑對益生菌的吸附效果，結果如圖3 所示.由圖3 可以看出，4 種吸附材料對不同菌株表現出不同的吸附能力.綜合來看，牡蠣殼粉對酵母菌和格氏乳球菌的吸附效果最好，上清液中剩余的菌株濃度分別為3.95×107mL-1和14.0×107mL-1；對施氏假單胞菌和枯草芽孢桿菌吸附效果較差，上清液中剩余的菌株濃度分別為7.77×107mL-1和8.73×106mL-1.稻殼粉與牡蠣殼粉的吸附效果相似，對酵母菌和格氏乳球菌表現出較好的吸附效果，上清液中剩余菌株濃度分別為2.25×108mL-1和1.71×108mL-1；對枯草芽孢桿菌和施氏假單胞菌的吸附效果較差.比較4 種吸附劑，玉米粉對4 株菌都有較強的吸附性，上清液中菌體濃度總體上低于其他3 種吸附劑，尤其對枯草芽孢桿菌和施氏假單胞菌有顯著吸附效果，上清液中菌體剩余濃度分別為4.53×106mL-1和1.73×107mL-1.而玉米芯粉只對枯草芽孢桿菌表現出顯著吸附效果，上清液中剩余菌株濃度為0.46×106mL-1，對施氏假單胞菌、格氏乳球菌、酵母菌都表現出較差的吸附效果.因此最終將玉米粉確定為4 株菌混合發(fā)酵制劑的固定化吸附劑.

圖3 不同吸附劑對益生菌的吸附效果Fig.3 Adsorption effect of different adsorbents on four probiotic strains

2.3 真空凍干保護劑的篩選

為了使益生菌制劑便于施用和保存，采用真空冷凍干燥技術，將混菌菌液干燥制成粉末制劑.在此過程中凍干保護劑的選擇對最終制劑中菌種的活性至關重要，因此本研究對可溶性淀粉、甘油和脫脂奶粉這3 種凍干保護劑的作用效果進行了比較，結果如圖4 所示.

圖4 凍干保護劑對益生菌的保護效果Fig.4 Protective effect of freeze-drying protective agents on four probiotec strains

由圖4（a）可以看出，可溶性淀粉質量分數為8%時，枯草芽孢桿菌的存活率可達42.3%，當質量分數升高到12%時菌株存活率為42.6%，達到最高，當質量分數升高到16%及以上時枯草芽孢桿菌的存活率均無明顯變化；可溶性淀粉質量分數為4%～12%時，隨著質量分數的增加，格氏乳球菌和酵母菌的存活率逐漸升高，當質量分數達到12%時，二者的存活率均達到最高，分別為52.3%和71.3%，可溶性淀粉質量分數再升高到16%及20%時，二者的存活率無明顯變化；而施氏假單胞菌在質量分數為16%的可溶性淀粉中存活率最高，為70.3%，質量分數升高到20%對其存活率幾乎沒有影響.由圖4（b）可以看出，甘油作為保護劑時，枯草芽孢桿菌、格氏乳球菌和酵母菌在18%的甘油保護下存活率最高，分別達到55.3%、69.9%和67.3%，甘油體積分數升高到22%及以上對枯草芽孢桿菌、格氏乳球菌的活性無明顯影響，但酵母菌的活性開始降低；而施氏假單胞菌在14%的甘油中存活率最高，達63.3%，甘油體積分數升高到22%及以上時其活性開始降低.由圖4（c）可以看出，脫脂奶粉作為保護劑時，枯草芽孢桿菌和施氏假單胞菌在20%的脫脂奶粉中存活率最高，分別為72.3%和64.0%，格氏乳球菌在16%的脫脂奶粉中存活率最高，可達76.7%，酵母菌在8%和16%的脫脂奶粉中存活率相近并達到最高，分別為65.0%和65.1%，脫脂奶粉質量分數的進一步升高對4 個菌株的存活率均無顯著影響. 綜合來看，3 種凍干保護劑中脫脂奶粉對4 株菌的保護效果最好.

3 討論與結論

本研究對枯草芽孢桿菌、格式乳球菌、施氏假單胞菌和酵母菌進行發(fā)酵共培養(yǎng)，制成復合益生菌制劑，探究培養(yǎng)基中無機鹽、吸附劑和凍干保護劑對復合制劑的影響.合適的共發(fā)酵培養(yǎng)基可以實現復合益生菌制劑中菌株的共培養(yǎng)[15].培養(yǎng)基是實現共發(fā)酵培養(yǎng)的關鍵，不同組分對不同微生物產生的影響也不相同，組分間也會有交互作用，對微生物的生長和代謝產生影響.本研究對4 株菌共發(fā)酵初始培養(yǎng)基進行了優(yōu)化與篩選，結果發(fā)現，在去除乙酸鈉的培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌才會生長，而對其余菌株生長影響不顯著；在共發(fā)酵培養(yǎng)基中分別去除檸檬酸氫二銨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀和硫酸錳4 種無機鹽均會對某些菌株的生長造成抑制，所以4 種無機鹽在共發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加十分必要.該實驗結果表明，在共發(fā)酵過程中保證碳源、氮源兩大營養(yǎng)要素的前提下，無機鹽的種類對微生物的生長至關重要，后期將會進一步優(yōu)化無機鹽和有機營養(yǎng)成分的含量.Niu 等[16]研究發(fā)現，微生物對無機鹽的需求量很少，通常低濃度起促進作用，而高濃度可能會產生抑制，最適的無機鹽種類及濃度需根據菌種的生理特性等條件確定，這與本研究結果相似.現階段復合益生菌制劑在生產和加工過程中面臨的主要問題為菌體易受外界影響而失活，本研究發(fā)現，在制劑加工過程中，共發(fā)酵培養(yǎng)基中無機鹽成分及比例對菌株的生長有顯著影響.

微生物應用過程中，游離分散的細胞易受到環(huán)境因子的影響，導致菌的活性及密度不高，進而影響整個生物反應過程[17].針對這一問題，微生物固定化技術越來越受到研究者關注，該技術主要采用物理或化學方法將微生物通過吸附、共價結合、截留及包埋等方式固定在特定材料中，再將整體加入到反應體系中，以此提升微生物活性與密度[18-19].本研究首先通過固定化吸附劑對比實驗，確定了菌株發(fā)酵液在進行凍干之前所需的最佳固定化吸附劑，4 種常用的固定化吸附劑牡蠣殼粉、稻殼粉、玉米粉和玉米芯粉中，最適合做4 株菌發(fā)酵液固定化吸附劑的是玉米粉.與其他3 種吸附劑相比，玉米粉對4 株菌都有較強的吸附性.吸水性實驗結果表明，4 種吸附劑中，玉米粉的吸水效果較差，但是對菌體有較強的的吸附性，由此說明吸水性好的固定化吸附劑不一定對菌體的吸附效果好，還需要進一步實驗證明，不能盲目選擇.

液態(tài)的益生菌制劑通常對包裝和保存條件要求較高，且容易造成菌體活性降低，不利于市面上流通及使用[20].真空冷凍干燥技術可將液態(tài)的益生菌制成固態(tài)的益生菌制劑，菌粉水分含量低，有利于長期保存，菌體存活率較高，發(fā)酵活力較好，遺傳特性穩(wěn)定[21]，是目前制備微生態(tài)制劑的常用方法[22-23].然而，菌體在冷凍干燥過程中會暴露在額外的應激壓力下，細胞內形成冰晶，再結晶過程中會對細胞膜造成損傷，降低成品活性[24]，所以凍干保護介質成為提升菌體存活率的重要影響因素. 實際操作中由于益生菌細胞的差異，不同的凍干保護劑對不同菌體的保護效果有很大差異[25]，如脫脂奶粉常用作乳酸菌的凍干保護劑，且效果較好[26].本研究進行了凍干保護劑篩選實驗，采用的甘油、可溶性淀粉和脫脂奶粉均為常見的凍干保護劑.用3 種凍干保護劑對共培養(yǎng)的4 株菌進行凍干保護實驗，結果顯示，脫脂奶粉保護效果最好，每種菌的活性均可達到64%以上，脫脂奶粉最適質量分數確定為16%，將其作為復合制劑的凍干保護劑.昝繼清等[27]在精釀啤酒酵母SCE14 凍干保護劑的篩選優(yōu)化研究中發(fā)現，保護劑海藻糖、蔗糖、脫脂奶粉作為凍干保護劑效果較好；陳顏紅等[28]在植物乳桿菌LP-7501S 凍干保護劑優(yōu)化研究中發(fā)現，效果較好的保護劑為脫脂奶粉、山梨醇、蔗糖，而海藻糖作用效果不顯著.由此可見，同一種保護劑對不同菌株作用效果不同，需要依據復合菌株的綜合特性選擇凍干保護劑.

本研究通過初始培養(yǎng)基中單一無機鹽去除實驗，確定了4 株水產養(yǎng)殖用益生菌的復合發(fā)酵培養(yǎng)基.通過固定化吸附劑和凍干保護劑的對比篩選實驗，確定了復合益生菌使用的固定化吸附劑和凍干保護劑及其最佳使用濃度，為后續(xù)復合益生菌制劑的開發(fā)利用提供了實驗依據.