李夢珂,常思思,高付彥,盧娟娟,李洪霖

1.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450046; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/河南省中醫(yī)院,河南 鄭州 450002

根據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,目前肺癌的發(fā)生率排名第2,病死率排名第1[1],我國肺癌的發(fā)生率及病死率均排名第1[2]。中醫(yī)認(rèn)為,肺癌病位在肺,本質(zhì)是機(jī)體陽氣運(yùn)化不足,陰寒積聚,導(dǎo)致體內(nèi)陰陽失調(diào),故在治療時(shí)以扶陽抑陰為原則,可選用溫陽類藥物溫化扶陽、培元固本,以達(dá)到陰平陽秘的目的。

蓽茇性辛、熱,屬于溫陽類藥物,其功效為溫中散寒、下氣止痛。有研究證實(shí),蓽茇及其主要活性成分在治療肺癌過程中能發(fā)揮重要作用;蓽茇酰胺可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,是一種可能的抗肺癌天然產(chǎn)物[3]。蓽茇明堿能夠抑制小鼠瘤塊血管內(nèi)皮生長因子基因的表達(dá),減慢腫瘤生長的速度[4]。通過進(jìn)行胡椒堿對人肺癌細(xì)胞(A549)和人肺成纖維細(xì)胞(W138)的作用實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)胡椒堿能抑制細(xì)胞增殖,也能誘導(dǎo)A549凋亡[5]。

鐵死亡是一種程序性細(xì)胞死亡,區(qū)別于細(xì)胞凋亡與壞死,主要是由于鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物出現(xiàn)了損傷從而誘導(dǎo)了細(xì)胞的死亡[6]。有研究認(rèn)為,鐵死亡發(fā)生的機(jī)制主要與鐵代謝、氨基酸和谷胱甘肽代謝、脂質(zhì)代謝有關(guān)[7]。調(diào)控鐵死亡對腫瘤的治療起著很重要的作用,有可能成為治療腫瘤的新方式[8]。有研究表明,蓽茇活性成分能通過調(diào)控鐵死亡過程而延緩腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9-10],但機(jī)制尚未明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型來分析藥物靶點(diǎn)與疾病基因之間相關(guān)性的一種方法[11]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討蓽茇調(diào)控鐵死亡治療肺癌可能的作用機(jī)制,為臨床治療肺癌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蓽茇有效活性成分獲取及篩選以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性指數(shù)(drug like index,DL)≥0.18[12]為篩選條件在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)中檢索收集蓽茇主要活性成分。

1.2 蓽茇有效活性成分作用靶點(diǎn)獲取及篩選運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對1.1所得結(jié)果進(jìn)行靶點(diǎn)基因整理,得到標(biāo)準(zhǔn)化靶點(diǎn)蛋白名稱、蓽茇潛在作用靶點(diǎn),創(chuàng)建蓽茇活性成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.3 肺癌靶點(diǎn)收集在Gene Cards數(shù)據(jù)庫中以“l(fā)ung cancer”(http://www.genecards.org/)為關(guān)鍵詞,搜索與肺癌相關(guān)的基因,整理后創(chuàng)建肺癌靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.4 蓽茇作用靶點(diǎn)和肺癌作用靶點(diǎn)取交集及蛋白對蓽茇主要活性成分作用的靶點(diǎn)和肺癌作用靶點(diǎn)取交集基因,得到蓽茇治療肺癌的潛在作用靶點(diǎn)。然后輸入String數(shù)據(jù)庫,獲得蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks,PPI),構(gòu)建PPI作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 基因功能分析和通路富集分析運(yùn)用R軟件對上述基因進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析。在程序語言中,定義為P<0.05,Q<0.05,以條形圖形式將分析結(jié)果輸出。

1.6 鐵死亡調(diào)控基因獲取及其與蓽茇、肺癌三者靶點(diǎn)綜合分析運(yùn)用FerrDb數(shù)據(jù)庫[13]和韋恩分析工具獲得鐵死亡調(diào)控基因與蓽茇參與調(diào)控肺癌的靶基因的公共基因,即上述蓽茇通過調(diào)控鐵死亡治療肺癌的靶點(diǎn)。然后使用R軟件對已獲取的三者之間的公共基因組進(jìn)行KEGG信號通路分析,將分析結(jié)果以條形圖形式輸出,并通過String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.7 臨床樣本含量分析運(yùn)用TCGA分析得出的公共基因在臨床表達(dá)差異情況。

2 結(jié)果

2.1 蓽茇活性成分的篩選在TCMSP中通過篩選得到15個(gè)有效活性成分,去除重復(fù)靶點(diǎn)后得到158個(gè)有效靶點(diǎn),然后運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化基因ID。

2.2 蓽茇作用靶點(diǎn)與肺癌作用靶點(diǎn)的交集在GeneCards中共獲得肺癌相關(guān)疾病靶點(diǎn)23 469個(gè),然后將其與藥物有效靶點(diǎn)基因進(jìn)行比對,得到13個(gè)有效活性成分(表1)和68個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn),所得即為蓽茇治療肺癌潛在的靶點(diǎn)基因。

表1 蓽茇有效活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)

2.3 蓽茇主要有效活性成分、肺癌、靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖通過Cytoscape 3.8.0將蓽茇主要有效活性成分及其作用靶點(diǎn)和肺癌作用靶點(diǎn)進(jìn)行可視化分析,發(fā)現(xiàn)蓽茇通過多成分-多靶點(diǎn)-多通路治療肺癌的作用機(jī)制(圖1)。

注:紫色代表藥物蓽茇,紅色代表肺癌,藍(lán)色代表藥物有效活性成分,綠色代表共同基因靶點(diǎn)。圖1 蓽茇活性成分-肺癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI的構(gòu)建及其核心網(wǎng)絡(luò)的篩選將得到的68個(gè)交集基因輸入String數(shù)據(jù)庫,選擇限制物種為“Homo Sapiens”,然后取前30個(gè)基因進(jìn)行可視化,繪制PPI網(wǎng)絡(luò)及柱狀圖。得到結(jié)果包括68個(gè)節(jié)點(diǎn),272條邊,平均節(jié)點(diǎn)度值8。圖中的節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì),邊代表蛋白質(zhì)之間的關(guān)系(圖2、圖3)。蓽茇與肺癌的PPI結(jié)果顯示,IL-10、FOS、ACOX1、IL-6、CREB1等靶點(diǎn)度值相對較高,在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等各種細(xì)胞生物活動(dòng)均有很大的關(guān)系[14-18]。

圖2 蓽茇與肺癌的蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 每個(gè)基因的度值

2.5 GO功能富集分析對68個(gè)蓽茇治療肺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析,共得到104個(gè)富集結(jié)果。根據(jù)校正后P值大小對關(guān)鍵靶基因進(jìn)行排序,展示前20位GO功能富集分析結(jié)果(表2、圖4)。結(jié)果顯示,蓽茇主要參與G蛋白耦聯(lián)胺受體活性、G蛋白耦聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G蛋白耦聯(lián)血清素受體活性、乙酰膽堿受體活性、烯酰輔酶A水合酶活性、兒茶酚胺結(jié)合、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合等。

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO功能富集分析

表2 GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析對蓽茇治療肺癌的68個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,結(jié)果顯示共富集在68條通路上,根據(jù)校正后P值進(jìn)行排序,展示前20位KEGG通路富集分析(表3、圖5)。蓽茇治療肺癌的信號通路主要包括TNF信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、c GMP-PKG信號通路、膽堿能突觸通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路、化學(xué)致癌-受體激活、IL-17、AGE-REGE信號通路、鈣信號通道、心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號等信號通路。

圖5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

表3 KEGG 通路富集分析

2.7 鐵死亡調(diào)控因子的獲取及其與蓽茇、肺癌三者共同基因篩選和分析在FerrDb中獲得259個(gè)與鐵死亡相關(guān)的基因,將其與68個(gè)蓽茇和肺癌的公共基因進(jìn)行韋恩分析(圖6),獲得5個(gè)基因,分別為IL-6、NOX1、NOX3、PTGS2和G6PD。這5個(gè)基因既是蓽茇的作用靶點(diǎn)也是肺癌治療靶點(diǎn),同時(shí)也是鐵死亡過程調(diào)控基因,對其進(jìn)行KEGG通路分析,篩選條件為P<0.05,共得到阿爾茨海默病、神經(jīng)退行性疾病-多種疾病通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、C型凝集素受體信號通路、TNF信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、人巨細(xì)胞病毒感染9條信號通路(圖7)。

圖6 蓽茇調(diào)控鐵死亡治療肺癌的靶點(diǎn)

圖7 蓽茇調(diào)控鐵死亡治療肺癌的信號通路

對上述5個(gè)基因繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖8),結(jié)果顯示,這5個(gè)基因之間相互聯(lián)系。另外,通過對比發(fā)現(xiàn)蓽茇調(diào)控鐵死亡途徑的靶點(diǎn)與蓽茇治療肺癌的核心靶點(diǎn)有重合,推測蓽茇可以通過調(diào)控鐵死亡途徑發(fā)揮治療肺癌的重要作用。

圖8 蓽茇調(diào)控鐵死亡治療肺癌靶點(diǎn)間的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.8 TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果IL-6、NOX1、NOX3、PTGS2和G6PD 5個(gè)基因在臨床標(biāo)本數(shù)據(jù)庫中正常組織與腫瘤組織中的表達(dá)存在顯著差異(P<0.05)(圖9)。其中,NOX1、G6PD在腫瘤組織中相對高表達(dá),IL-6、PTGS2在腫瘤組織中的表達(dá)量則低于正常組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析藥物-靶點(diǎn)-疾病的相互作用關(guān)系[19],構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián),初步得出蓽茇的主要活性成分、肺癌靶點(diǎn)、關(guān)鍵功能靶點(diǎn),和蓽茇通過調(diào)控鐵死亡過程防治肺癌的相關(guān)通路。通過分析共得到IL-6、NOX1、NOX3、PTGS2和G6PD 5個(gè)公共靶點(diǎn),說明蓽茇通過這5個(gè)基因調(diào)控鐵死亡起到治療肺癌的作用。

本研究通過對蓽茇有效活性成分的挖掘,發(fā)現(xiàn)蓽茇的有效活性成分中主要包括生物堿及酰胺類等,其中胡椒堿、芝麻素、蓽茇酰胺3者是網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中較為核心的成分,提示這3種有效活性成分對肺癌有治療作用。研究顯示,胡椒堿具有很強(qiáng)的抗腫瘤特性,其作用機(jī)制主要為抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)抑制誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程,未來胡椒堿將進(jìn)一步運(yùn)用于轉(zhuǎn)移性肺癌和EMT等治療中[20]。芝麻素通過降低肺癌細(xì)胞內(nèi)線粒體離子肽酶1 (lon peptidase 1,mitochondrial,LONP1)水平,達(dá)到抑制細(xì)胞增殖和生長的目的,LONP1蛋白的減少可能會(huì)抑制肺癌的發(fā)生、發(fā)展[21]。蓽茇酰胺可以促使細(xì)胞發(fā)生凋亡,抑制肺癌細(xì)胞的生長,同時(shí)也能抑制細(xì)胞集落和細(xì)胞遷移的過程[3,22]。

鐵死亡是一種程序性細(xì)胞死亡,鐵死亡具有促進(jìn)和抑制腫瘤的雙重作用[23]。本研究對鐵死亡調(diào)控基因進(jìn)行篩選并與蓽茇和肺癌一起分析,得到 IL-6、NOX1、NOX3、PTGS2和G6PD 5個(gè)靶點(diǎn)。IL-6 在肺癌干細(xì)胞中能夠促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖,在腫瘤的發(fā)生進(jìn)展等過程中起著重要作用[24]。Han等[25]發(fā)現(xiàn),IL-6可以降低支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞活性,促進(jìn)脂質(zhì)過氧化,破壞BEAS-2B細(xì)胞的鐵穩(wěn)態(tài)并加快誘導(dǎo)鐵死亡。有研究表明,NOX1(胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1)可能通過增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)的表達(dá),引起A549細(xì)胞的凋亡,顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用[26]。NOX1通過催化產(chǎn)生活性氧過程,阻止誘導(dǎo)ROS來抑制鐵死亡過程[27]。NOX3(酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶3)屬于NOX家族,NOX家族參與一種膜結(jié)合酶復(fù)合物,與其他蛋白質(zhì)一起,可以通過質(zhì)膜運(yùn)輸電子,產(chǎn)生超氧化物和其他下游ROS,由NOX家族介導(dǎo)的ROS生成可促進(jìn)鐵死亡的脂質(zhì)過氧化[28]。李宏謙等[29]提出,NOX3可能通過增加細(xì)胞的遷移速率,達(dá)到侵襲腫瘤細(xì)胞的目的。有研究表明,PTGS2(前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2或環(huán)氧合酶2)參與鐵死亡過程當(dāng)中的脂質(zhì)代謝,可調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵死亡過程,可能促進(jìn)鐵死亡[30-31]。Pan等[32]發(fā)現(xiàn),環(huán)氧合酶抑制劑可以降低ELMO 3(吞噬和運(yùn)動(dòng)蛋白3)的表達(dá),而ELMO 3抑制肺癌的生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)系。Talmadge等[33]發(fā)現(xiàn),環(huán)氧合酶可以促進(jìn)Lewis肺癌細(xì)胞的表達(dá),環(huán)氧合酶抑制因子能夠促進(jìn)特異性 T 細(xì)胞反應(yīng),在免疫治療學(xué)廣泛應(yīng)用。研究證明,G6PD在多種惡性腫瘤中均有表達(dá),特別是與肺癌的臨床研究相關(guān),是肺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測標(biāo)志物[34]。有研究表明,G6PD可調(diào)節(jié)核糖-5-磷酸和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的生成,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NADPH水平,調(diào)控鐵死亡過程[35]。綜上,5種核心基因都可以有效地參與鐵死亡進(jìn)程,同時(shí)與肺癌臨床進(jìn)程相關(guān),所以靶向這些基因進(jìn)行鐵死亡治療對于肺癌的治療有著至關(guān)重要的作用。

目前,臨床治療肺癌多采用多方法綜合治療方案,中醫(yī)藥療法作為其中一種治療方案也越來越被認(rèn)可。以中醫(yī)理論方法為指導(dǎo)的溫陽法治療肺癌療效顯著。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析蓽茇治療肺癌的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,通過挖掘蓽茇調(diào)控鐵死亡治療肺癌發(fā)揮作用的潛在靶標(biāo)及相關(guān)通路,結(jié)果顯示,蓽茇治療肺癌與鐵死亡調(diào)控有相同基因,說明蓽茇可以通過調(diào)控鐵死亡途徑發(fā)揮治療肺癌的作用,為中醫(yī)藥治療肺癌提供了新思路。