何威華,鄧蘭,蔣益蘭

1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院,湖北 武漢 430050; 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410208; 3.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006; 4.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410006

研究顯示,結(jié)直腸癌2020年新增病例占全球新增癌癥病例的10%[1],肝轉(zhuǎn)移是其主要死因[2]。因此,積極探索結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移機制,并采取有效的防治措施以提高結(jié)直腸癌患者的生存期具有重要意義。1993年,Ioannides和Whiteside正式提出“腫瘤微環(huán)境”的概念[3],它是由各種細胞(腫瘤細胞、基質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、免疫細胞)、細胞因子(炎癥因子、趨化因子和血管生成因子)、相關(guān)信號分子等共同構(gòu)成的局部內(nèi)環(huán)境,具有低氧、低pH值、間質(zhì)高壓、生長因子和蛋白水解酶產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)以及免疫抑制等生物學(xué)特征,為腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為提供了“肥沃土壤”[4-5]。研究表明,腫瘤細胞之所以能在特定的器官發(fā)生或轉(zhuǎn)移,腫瘤微環(huán)境起著至關(guān)重要的作用[6]。腫瘤微環(huán)境中存在與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的因子,包括趨化因子受體 4(chemokine receptor 4,CXCR4)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、整合素αv β5(integrin αv β5,ITG αv β5)、血清鈣結(jié)合蛋白 A4(calcium-binding protein A4,S100A4)、血清鈣結(jié)合蛋白 A8(calcium-binding protein A8,S100A8)、血清鈣結(jié)合蛋白 A9(calcium-binding protein A9,S100A9)等。

健脾消癌方是湖南省名中醫(yī)蔣益蘭主任醫(yī)師的經(jīng)驗方,既往臨床研究顯示,健脾消癌方能夠降低結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率,延長其無病生存期及總生存期[7-8]。實驗研究發(fā)現(xiàn),健脾消癌方可降低結(jié)直腸癌裸鼠模型的肝轉(zhuǎn)移率[9],但其具體機制尚未完全闡明。本實驗擬探索健脾消癌方對結(jié)腸癌HCT116細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響及對腫瘤微環(huán)境中腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子(CXCR4、TGF-β、ITG αv β5、S100A4、S100A8、S100A9)表達的影響,為健脾消癌方治療結(jié)腸癌的臨床應(yīng)用提供循證依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞與動物人結(jié)腸癌HCT116細胞株購自廣州吉妮歐生物科技有限公司,編號JNO-373,傳至第4代進行后續(xù)研究。SPF級SD大鼠14只,體質(zhì)量(20±2) g,雄性,購自三峽大學(xué)實驗動物中心,合格證號:SCXK(鄂)2017-0012。所有大鼠均飼養(yǎng)于恒溫(25±2) ℃,濕度50%～60%的SPF級屏障環(huán)境中,自由進食和飲水。本實驗獲得武漢市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準,倫理審批號:武中醫(yī)倫KW2021-039。

1.2 藥物與試劑人參、薏苡仁、淫羊藿、白花蛇舌草、藤梨根、郁金、炒枳殼、重樓按《中華人民共和國藥典》2015年版的標準采購,由武漢市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供,并由張義生主任藥師鑒定為正品。CXCR4抗體、S100A4抗體(Bioss公司,貨號:bs-1011R、bs-3759R);TGF-β抗體、S100A8抗體、S100A9抗體、ITG αv β5抗體(Affinity公司,貨號:AF1027、DF6556、DF7596、AF0185);HRP標記山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司,貨號:BA1054);GAPDH抗體(杭州賢至生物有限公司,貨號:AB-P-R 001);CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(Biosharp公司,貨號:BS350B);Transwell小室(美國BD Biosciences公司,貨號:353097);McCoy′s 5A培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液(美國Gibco公司,貨號:16600-082、10091-148、15070-063);RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號:P0013B、P0010);蛋白marker(美國Thermo公司,貨號:26616);Trizol(美國Ambion公司,貨號:15596-026);HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)(Vazyme公司,貨號:R101-01/02)。

1.3 儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司,型號:MCO-15AC);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司,型號:DHG 9203A);倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司,型號:IX51);超凈工作臺(蘇州集團安泰空氣技術(shù)有限公司,型號:SW-CJ-1FD);PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司,型號:EDC-810);微量移液器(美國ThermoFisher公司);低速離心機(德國Eppendorf公司,型號:5702R);酶標儀(美國Molecular Devices公司,型號:Flexstation?3)。

2 方法

2.1 藥物制備健脾消癌方由人參15 g,薏苡仁30 g,淫羊藿10 g,白花蛇舌草30 g,藤梨根15 g,郁金15 g,炒枳殼6 g,重樓10 g組成。按生藥量加入10倍量水,煎煮1 h,保存藥液;藥渣再加入8倍量水,煎煮1 h。合并兩次藥液,濃縮成近2倍水量時,放置過夜。去沉淀,繼續(xù)濃縮成2.4 kg·L-1的儲備液,保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 健脾消癌方含藥血清制備14只SD大鼠隨機分為無藥血清組及健脾消癌方組,每組各7只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始灌胃。藥物劑量根據(jù)動物體表面積與劑量換算得出[10],按70 kg成人每日生藥用量120 g進行人與大鼠等效劑量換算,大鼠臨床等效劑量為10.8 g·kg-1。無藥血清組按大鼠體質(zhì)量灌胃等體積生理鹽水,兩組均連續(xù)灌胃7 d。末次給藥后,以10 %水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,劑量為 3.3 mL·kg-1,小心剪開腹腔和胸腔,以環(huán)氧乙烷滅菌后的注射器進行心臟采血,放于10 mL滅菌離心管中,靜置2 h以上,無菌分離血清,56 ℃水浴 30 min 滅活后,分裝并用封口膜封口,放于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 細胞培養(yǎng)HCT116細胞采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基,于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁,約鋪滿培養(yǎng)瓶底 90%時,進行細胞傳代,傳代比率為13,取匯合率為80%的對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗處理。

2.4 CCK-8實驗檢測細胞增殖能力取生長狀態(tài)良好的HCT116細胞,以每孔5×103個細胞的密度種植于96孔板內(nèi),放入恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中過夜。待細胞貼壁后,分為空白組(含細胞及培養(yǎng)基)、5%無藥血清組、10%無藥血清組、20%無藥血清組、5%健脾消癌方含藥血清組、10%健脾消癌方含藥血清組、20%健脾消癌方含藥血清組,每組設(shè)置3個復(fù)孔。各組細胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,使用酶標儀測定 450 nm 處的光密度(optical density,OD)值,并最終根據(jù)每孔細胞的OD值繪制細胞生長曲線,篩選最佳干預(yù)血清濃度和最佳干預(yù)時間。

2.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲、遷移能力取對數(shù)生長期HCT116細胞,調(diào)整細胞濃度為2.5×105mL-1。取預(yù)先制備好的Transwell小室,在Transwell上室分別接入200 μL 20%無藥血清培養(yǎng)的細胞或20%健脾消癌方含藥血清培養(yǎng)的細胞,在培養(yǎng)箱(37 ℃,5%CO2)中培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室,用70%冰乙醇溶液固定細胞1 h后,用0.5%結(jié)晶紫染色20 min,在光學(xué)顯微鏡下隨機取3個視野進行計數(shù),以細胞數(shù)目衡量細胞的侵襲能力。細胞遷移實驗除不在小室鋪膠外,其余步驟同細胞侵襲實驗。

2.6 Western Blot實驗檢測CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5蛋白表達水平以20%無藥血清或20%健脾消癌方含藥血清處理細胞,48 h后收集細胞,分別加入100 μL RIPA 蛋白裂解液,冰上裂解30 min,4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min,取上清,采用BCA試劑盒進行蛋白定量,按照比例加入SDS-PAGE蛋白緩沖液,煮沸 5 min,立即分裝,置于-20 ℃冰箱中備用。取 50 μg 蛋白上樣,SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,封閉,一抗(稀釋比例為15 000)室溫孵育4 h,二抗(稀釋比例為15 000)室溫孵育2 h,ECL發(fā)光液顯影,分別檢測CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5蛋白的表達水平,用 BandScan軟件分析蛋白灰度值。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白,通過測量各目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值來反映各目的蛋白的相對表達水平。每次獨立重復(fù)實驗3次。

2.7 RT-PCR法檢測CXCR4mRNA、TGF-βmRNA、S100A4mRNA、S100A8mRNA、S100A9mRNA、ITGαvβ5mRNA的表達水平以20%無藥血清或20%健脾消癌方含藥血清處理細胞,48 h后收集細胞。采用Trizol法提取細胞總RNA,采用HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,逆轉(zhuǎn)錄條件為50 ℃,15 min;85 ℃,5 min;-80 ℃ 冰箱中保存。以GAPDH作為內(nèi)參,通過PCR儀對CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITGαvβ5進行擴增,擴增條件為95 ℃預(yù)變性10 min,1個循環(huán);95 ℃變性 15 s;60 ℃退火 40 s,40個循環(huán);95 ℃延伸15 s;60 ℃降溫60 s;95 ℃ 終延伸15 s,1個循環(huán);50 ℃保存。每個實驗重復(fù)3次。使用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。引物由擎科生物科技有限公司合成,見表1。

表1 引物序列表

3 結(jié)果

3.1 健脾消癌方對結(jié)腸癌HCT116細胞增殖的影響實驗24 h時,10%健脾消癌方含藥血清組OD值低于同濃度的無藥血清組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);5%、20%濃度的健脾消癌方含藥血清組OD值和同濃度的無藥血清組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗48 h時,5%、10%、20%濃度的健脾消癌方含藥血清組OD值均低于同濃度的無藥血清組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗 72 h 時,5%、10%濃度的健脾消癌方含藥血清組OD值低于同濃度的無藥血清組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);20%的健脾消癌方含藥血清組OD值和同濃度無藥血清組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。其中,實驗48 h時,20%健脾消癌方含藥血清組OD值低于其余各組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),因此后續(xù)實驗選擇20%健脾消癌方含藥血清處理細胞,干預(yù)時間為48 h。見圖1。

注:與20%無藥血清組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與10%無藥血清組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;與5%無藥血清組比較,△P<0.05。圖1 健脾消癌方對HCT116細胞增殖的影響

3.2 健脾消癌方對結(jié)腸癌HCT116細胞侵襲及遷移的影響結(jié)果顯示,與20%無藥血清組比較,20%健脾消癌方含藥血清能顯著抑制HCT116細胞的侵襲及遷移,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2—圖4。

注:與20%無藥血清組比較,*P<0.05,**P<0.01。圖2 健脾消癌方對HCT116細胞侵襲及遷移的影響

注:A:20%無藥血清組;B:20%健脾消癌方含藥血清組。圖3 健脾消癌方對HCT116細胞侵襲能力的影響

注:A:20%無藥血清組;B:20%健脾消癌方含藥血清組。圖4 健脾消癌方對HCT116細胞遷移能力的影響

3.3 健脾消癌方對HCT116細胞CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5蛋白表達的影響結(jié)果顯示,與20%無藥血清組比較,20%健脾消癌方含藥血清能明顯降低CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5的蛋白表達水平,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖5、表2。

圖5 蛋白表達條帶圖

表2 健脾消癌方對CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5蛋白表達的影響

3.4 健脾消癌方對HCT116細胞CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITGαvβ5mRNA表達的影響結(jié)果所示:與20%無藥血清組比較,20%健脾消癌方含藥血清能顯著降低CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITGαvβ5mRNA表達水平,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 健脾消癌方對CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5 mRNA表達水平的影響

4 討論

腫瘤微環(huán)境具有微觀整體性,與中醫(yī)的整體觀有著相似性。學(xué)者們認為中醫(yī)藥防治腫瘤轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢在于可以從整體上改善腫瘤患者機體內(nèi)環(huán)境,即腫瘤微環(huán)境,從而起到抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[11-12]?！胺N子與土壤”理論說明了“土壤”即腫瘤微環(huán)境可以影響“種子”即癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能[13]。以整體觀念為指導(dǎo)思想的中醫(yī)藥治療方法,一方面可以抑制“種子”即癌細胞及其分泌或攜帶的相關(guān)物質(zhì)的活性,另一方面又可以調(diào)整“土壤”即腫瘤微環(huán)境,以使癌細胞難于在此微環(huán)境中種植、存活、生長,從而達到抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[14]?；谀[瘤微環(huán)境在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要作用,針對腫瘤微環(huán)境的治療措施已成為防治腫瘤轉(zhuǎn)移的新策略[15-17]。

蔣益蘭主任醫(yī)師經(jīng)過長期臨床實踐,認為“虛、毒、瘀”是結(jié)直腸癌的基本病機特點。根據(jù)此病機研制了用于防治結(jié)直腸癌的經(jīng)驗方:健脾消癌方。本方方藥為人參、郁金、薏苡仁、白花蛇舌草、藤梨根、重樓。人參、薏苡仁健脾益氣,白花蛇舌草、藤梨根、重樓清熱解毒散結(jié),郁金行氣活血化瘀。諸藥合用,共奏健脾益氣、行氣活血解毒之功,以達到“健脾消癌”的目的。研究表明,人參活性成分通過重塑腫瘤微環(huán)境來實現(xiàn)抗癌作用[18]。人參衍生的納米顆粒通過重新編排腫瘤微環(huán)境來增強免疫檢查點抗體的功效[19]。薏苡仁提取物能抑制NF-κB的表達從而抑制結(jié)直腸癌細胞系中TNF-α介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用[20]。它還能通過抑制缺氧條件下ERK1/2和AKT通路的活化來抑制結(jié)腸癌細胞的遷移、侵襲和黏附[21]。白花蛇舌草能抑制腫瘤干細胞的活性從而發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用[22]。此外,藤梨根乙醇提取物能夠調(diào)控多條結(jié)直腸癌相關(guān)信號通路,并調(diào)節(jié)多種炎癥因子和血管生成因子的表達,從而誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制細胞增殖及腫瘤血管的生成[23]。藤梨根可通過調(diào)節(jié)Notch/DLL4/Hes通路抑制體內(nèi)腫瘤血管生成從而抑制結(jié)腸癌細胞的增殖,還可通過Notch信號通路抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲及遷移[24]。重樓可抑制核梭桿菌來源和外泌體誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細胞遷移,還可通過誘導(dǎo)自噬從而抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖,同時能提高化療藥物阿霉素的療效[25-26]。郁金-黃芪藥對通過Sp1/ZFAS1/miR-153-3p/CCR5調(diào)節(jié)軸抑制M2型巨噬細胞極化,以抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[27]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),健脾消癌方能下調(diào)缺氧微環(huán)境中結(jié)腸癌細胞HIF-1α水平,間接影響其下游靶基因的表達,從而抑制結(jié)腸癌細胞增殖、促進細胞凋亡、減弱細胞遷移,發(fā)揮抗癌作用[28]。

CXCR4是G蛋白偶聯(lián)的趨化因子受體,有研究顯示,結(jié)腸癌細胞來源的外泌體可通過提高趨化因子受體CXCR4的表達促進肝轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成,從而促進結(jié)直腸癌細胞在肝臟中種植與生長[29-30]。TGF-β是一種多功能的細胞因子,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移中都具有重要作用。腫瘤微環(huán)境中,TGF-β通過影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而加速腫瘤進展[31],活化后的TGF-β可促進結(jié)直腸癌細胞與間質(zhì)的相互作用,導(dǎo)致結(jié)直腸癌進展與轉(zhuǎn)移[32-33]。整合素屬于細胞黏附受體家族,在微環(huán)境中發(fā)揮重要作用,因為它們能夠?qū)⒓毎麢C械地固定在細胞外基質(zhì)上,在細胞之間、細胞與外環(huán)境之間傳送有關(guān)信息[34]。整合素幾乎涉及癌癥的每一個步驟,包括癌癥的起始和增殖、局部侵襲和內(nèi)浸潤進入血管系統(tǒng)、循環(huán)腫瘤細胞的存活、轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的啟動,以及遠處器官上的轉(zhuǎn)移定植[35]。循環(huán)結(jié)腸癌細胞通過ITG αv β5的介導(dǎo)作用選擇性地黏附在肝臟的微血管中,從而促進結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移[36]。S100家族蛋白是鈣結(jié)合蛋白中最大的亞族之一,有20余個成員,包括S100A1-A5、S100B、S100P等,S100蛋白在大量腫瘤中高表達,與腫瘤細胞的增殖、浸潤及疾病的發(fā)展密切相關(guān)。S100家族蛋白S100A4、S100A8、S100A9等是癌細胞和基質(zhì)細胞之間聯(lián)系的紐帶,有助于腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成[37],從而促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。

本研究發(fā)現(xiàn)健脾消癌方能抑制HCT116細胞的增殖、侵襲及遷移,并能降低CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5的表達,提示健脾消癌方可能通過作用于CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5等腫瘤微環(huán)境相關(guān)因子從而發(fā)揮抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的作用。下一步,我們將開展動物實驗探究健脾消癌方能否在體內(nèi)通過作用于腫瘤微環(huán)境相關(guān)因子發(fā)揮抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用。