王彥佳,胡伯昂,陳佳欣,許麗婷,姚琳,馮麗榮,郭長虹*
(1. 黑龍江省分子細胞遺傳與遺傳育種重點實驗室,哈爾濱師范大學生命科學與技術(shù)學院,黑龍江 哈爾濱 150000;2. 黑龍江國宏節(jié)能環(huán)保有限公司,黑龍江 哈爾濱 150028)
鉀是植物生長和發(fā)育不可缺少的元素[1]。土壤全鉀量高于全氮、全磷量,但由鉀長石、云母等硅鋁酸鹽組成的難溶性鉀占95%,因而可被植物直接吸收利用的鉀非常少[2]。中國缺鉀的耕地約占70%,嚴重缺鉀的耕地約占45%[3]。隨著中國種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整,農(nóng)作物產(chǎn)量和種植面積不斷提高,對鉀肥的需求也隨之增高[4]。通常通過施加化肥來補充植物對鉀的需求,但長期大規(guī)模施用化肥可能對土壤產(chǎn)生不利影響,并對環(huán)境構(gòu)成威脅[5]。開發(fā)解鉀菌生物制劑替代化學鉀肥,是解決植物缺鉀的一條有利途徑。
解鉀菌(potassium-solubilizing bacteria, KSB)能夠?qū)⑼寥乐须y溶性的鉀轉(zhuǎn)化為可被植物直接吸收利用的有效鉀,從而促進植物生長[6]。Xiao 等[7]從油菜(Brassica campestris)根際篩選出3 株解鉀菌,接種后提高了黑麥草(Lolium perenne)的鉀含量和生物量。Bakhshandeh 等[8]研究表明,接種解鉀菌提高了水稻(Oryza sativa)的根長、葉面積和生物量,增強了水稻的光合作用,促進了水稻幼苗的生長。解鉀菌不僅對鉀的吸收有積極的作用,還能通過分泌吲哚-3-乙酸(indoleacetic-3-acid, IAA)、產(chǎn)生鐵載體,溶解磷酸鹽促進植物生長。楊華等[9]分離了6 株解鉀菌,促進了植物對鉀的吸收,還可通過產(chǎn)生IAA 和鐵載體來促進水稻的生長,提高了株高、葉面積、總根長、根冠比和組織鉀含量。史靜靜等[10]研究發(fā)現(xiàn),分離的5 株解鉀菌,同時具有較高的溶磷能力,在棉花(Gossypium hirsutum)上施用解鉀菌,根系活力、株高、干重得到了顯著提高。這些研究表明,解鉀菌作為生物菌劑在改善植物生長方面表現(xiàn)出良好的應用前景。
紫花苜蓿(Medicago sativa)是多年生豆科牧草,蛋白含量高,適口性好,被譽為“牧草之王”[11]。紫花苜蓿的種植面積在全球已超過3000 多萬hm2[12]。隨著中國畜牧業(yè)的發(fā)展和人們對畜產(chǎn)品需求的增加,紫花苜蓿種植面積不斷增加[13]。紫花苜蓿對鉀的需求較高,缺鉀會導致植株根系發(fā)育不良,葉片邊緣變黃,生長速度減慢,產(chǎn)量降低[14]。但是,目前對于紫花苜蓿解鉀菌的研究還非常有限。
本研究從紫花苜蓿根際土壤中篩選解鉀菌,評估其解鉀能力及潛在的植物促生特性,包括IAA 合成、鐵載體產(chǎn)生和磷酸鹽溶解能力,通過盆栽試驗分析解鉀菌株接種對紫花苜蓿的產(chǎn)量、品質(zhì),土壤酶活性和土壤速效鉀含量的影響,可為開發(fā)解鉀微生物制劑,促進紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供菌株資源。
2019 年,供試紫花苜蓿根際土取自黑龍江省哈爾濱師范大學農(nóng)園(45°51′ N,126°32′ E)。將5 株紫花苜蓿連同根際土混勻裝入干凈保鮮袋中,帶回實驗室4 ℃保存。
參照陳宇豐等[15]的方法從根際土壤中分離細菌。取1 g 紫花苜蓿根際土,加入盛有玻璃珠和99 mL 無菌水的錐形瓶中,在28 ℃搖床上劇烈振蕩30 min。采用平板稀釋法[16]分離細菌:將土壤樣品用無菌水稀釋至10-2~10-5濃度梯度,取100 μL 涂布在硅酸鹽細菌培養(yǎng)基(silicate bacteria medium)上,倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d,選取有水解圈的單菌落,進行平板劃線純化,反復進行,直至獲得純菌種,并挑取單菌落接種于LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基,待菌落長出后于冰箱中4 ℃保存,或制備成甘油菌-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
分別用接種環(huán)挑取純化后的菌株,接種于50 mL 種子液培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h 后在6000 r·min-1下離心10 min棄上清液。收集無培養(yǎng)基的菌體,并用去離子水將菌體懸浮,制成菌懸液(OD600=0.50±0.04)。將菌懸液按5%的接種量,接種于解鉀液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)7 d。以等量滅活菌懸液作為對照處理。取解鉀液體培養(yǎng)基的發(fā)酵液10 mL,加入2 mL 的H2O2并在沸水浴中消化1 h 后用去離子水補足10 mL,在13000 r·min-1下離心5 min,取上清液采用火焰分光光度計法測定鉀含量[17],與空白對照對比分析,計算出菌株對鉀長石礦粉的分解率。
按照東秀珠等[18]的方法,對篩選出的菌株進行形態(tài)特征、吲哚測定、甲基紅、伏普、檸檬酸鹽、淀粉水解、硫化氫、明膠液化、脲酶、接觸酶試驗,以及葡萄糖利用和革蘭氏染色等生理指標的測定。
采用CTAB/NaCl 方法提取細菌DNA[19],采用細菌16S 通用引物F8(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和R1541(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')擴增16S rDNA 基因序列。擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結(jié)果在NCBI(https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)進行同源性比較分析,確定親緣關(guān)系,用MEGA 7.0 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析,采用 Neighbor-joining 法和 Jukes-Cantor 模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
采用Salkowski 比色法測定菌株產(chǎn) IAA 能力[20]。供試菌株先在DF(Dworkin and Foster)培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h,再取1 mL 轉(zhuǎn)入添加不同濃度色氨酸(L-Trp)的DF 培養(yǎng)液(含0、100、200、500 μg·mL-1)中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每個菌株3 次重復,取樣測菌液OD600處吸光值。其余培養(yǎng)液室溫下10000 r·min-1離心,取500 μL 上清液,添加2 mL Salkowski 試劑,室溫培養(yǎng)20 min 后,在OD535處測吸光值。
定性試驗參照Schwyn 等[21]的方法進行,將已分離保存的細菌接種于鉻奧醇CAS(Chrome Azurol Sulphonate)培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)48 h,觀察菌落周圍的顏色變化,有橘黃色暈圈產(chǎn)生即可產(chǎn)生鐵載體。定量檢測參照王平等[22]的方法。將可產(chǎn)生橘黃色暈圈的菌株接種于MKB(Modified King’S B)培養(yǎng)基中,28 ℃搖床培養(yǎng)48 h(180 r·min-1);菌液離心,取上清液,以1∶1 的體積比加入CAS 檢測液,充分混勻。靜置1 h 后,OD630處測吸光值A(chǔ),以去離子水與CAS 檢測液等體積混合測得的Ar 為對照,A/Ar 代表樣品中鐵載體的相對含量。
定性試驗參照喬策策等[23]的方法進行,將已分離保存的細菌接種于改良的PVK(Pikovskaya)培養(yǎng)基上,于28 ℃培養(yǎng)48 h,觀察菌落周圍的顏色變化,有透明暈圈產(chǎn)生即可溶解無機磷。定量采用鉬銻抗顯色法計算有效磷含量[24]。挑選菌株接種到LB 培養(yǎng)基,在10000 r·min-1離心10 min 富集菌體,將菌懸液濃度調(diào)至1×108cfu·mL-1,將細菌懸液按1%量接種在20 mL PVK 液體培養(yǎng)基中,以不接菌為對照,平行3 組,在28 ℃,180 r·min-1搖床上培養(yǎng)72 h 后,取發(fā)酵液在4 ℃ 10000 r·min-1下離心10 min,取上清液,加5 mL 鉬銻抗顯色液定容至50 mL,反應30 min,利用722E 型可見光分光光度計(上海元析儀器有限公司)在OD600處測定光密度并計算有效磷含量,減去對照的值即為溶磷量。
1.7.1 盆栽試驗 盆栽試驗于2019 年在哈爾濱師范大學重點實驗室進行,紫花苜蓿種子表面消毒后,試驗設置:對照組CK:無鉀長石粉、無解鉀菌;處理組1:對照組CK+鉀長石粉(CK+K);處理組2:只加解鉀菌XLT-4(XLT-4);處理組3:解鉀菌XLT-4+鉀長石粉(XLT-4+K);處理組4:只加解鉀菌XLT-7(XLT-7);處理組5:解鉀菌XLT-7+鉀長石粉(XLT-7+K)。處理組用XLT-4 和XLT-7 菌懸液(1×108cfu·mL-1)浸種2 h,經(jīng)無菌水浸泡處理2 h 的為對照(CK)。將對照組和處理組的種子均勻播種于同一規(guī)格的花盆中。每盆10 粒種子,室溫培養(yǎng),每天光照8 h,適當澆水保持土壤水分含量。每隔7 d 用50 mL 菌懸液均勻澆灌于幼苗根部周圍,對照組用等量無菌水。
1.7.2 樣品測定 種苗60 d 后測定紫花苜蓿的株高、根長、地上鮮重、地下鮮重、地上干重、地下干重。采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)法對根活力進行測定[25],采用火焰分光光度計法、釩鉬黃比色法、凱氏定氮法、中性洗滌纖維法、酸性洗滌纖維法測定植株鉀含量、磷含量、粗蛋白含量、中、酸性洗滌纖維含量[26-28]。根據(jù)《土壤酶及其研究方法》[29]和《土壤農(nóng)化分析》[30]測定土壤酶活性及土壤速效鉀含量。
使用SPSS 23.0(IBM, 美國)對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。采用T檢驗和單因素方差分析(ANOVA)進行不同處理組數(shù)據(jù)的比較分析。不同數(shù)據(jù)中的誤差柱代表標準偏差(standard deviation, SD),不同小寫字母代表統(tǒng)計學計算得到的差異顯著性(P<0.05)。
將紫花苜蓿根際土壤接種到硅酸鹽細菌培養(yǎng)基上初步分離篩選出26 株可產(chǎn)生水解圈的解鉀菌,對26株菌進行搖瓶釋鉀試驗,孵化7 d 后測定菌株的解鉀率,從中挑選出解鉀率較高的2 株菌,標記為XLT-4、XLT-7,其解鉀率分別為10.53%和9.75%(圖1)。
圖1 從紫花苜蓿根際分離出的解鉀菌的解鉀能力Fig. 1 Potassium-solubilizing ability of potassiumsolubilizing bacteria isolated from alfalfa rhizosphere
XLT-4 菌落呈圓形,不透明,黏稠,邊緣整齊,表面光滑濕潤,長時間培養(yǎng)可產(chǎn)生黃色色素。XLT-7 菌落圓形,淡黃色或乳白色,微微凸起,邊緣光滑整齊。提取細菌XLT-4 和XLT-7 的DNA,進行16S rDNA序列的PCR 擴增,XLT-4 的GenBank 登錄號為OQ726246,XLT-7 的GenBank 登錄號為OQ726247。經(jīng)BLAST 比對分析發(fā)現(xiàn),菌株XLT-4 與巨大芽孢桿菌(Priestia megaterium)、阿氏芽孢桿菌(Priestia aryabhattai)、彎曲芽孢桿菌(Priestia flexa)、副彎曲芽孢桿菌(Priestia paraflexa)同屬近緣種,序列同源性達99%;菌株XLT-7 與耐寒短桿菌(Peribacillus frigoritolerans)、食丁酸短桿菌(Peribacillus butanolivorans)、盧氏短桿菌(Peribacillus loiseleuriae)、棉籽殼短桿菌(Peribacillus gossypii)的同源性為99%(圖2)。基于16S rDNA 和系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明,菌株XLT-4 屬于芽孢桿菌屬(Priestia),XLT-7 屬于短桿菌屬(Peribacillus)。進一步通過生理生化試驗表明,菌株XLT-4 的檸檬酸鹽、淀粉水解試驗呈陽性,明膠液化呈陰性,革蘭氏染色為陽性;菌株XLT-7 的明膠液化呈陽性,檸檬酸鹽、淀粉試驗呈陰性,革蘭氏染色為陽性(表 1)。根據(jù)菌落形態(tài)特征,16S rDNA 進化樹分析及生理生化鑒定,確定菌株XLT-4 和XLT-7 分別為巨大芽孢桿菌和耐寒短桿菌。
圖2 分離菌株的16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA of bacterial isolates
兩株菌在CAS 和PVK 檢測培養(yǎng)基上分別形成了橘黃色和透明的暈圈,即均具有產(chǎn)鐵載體和溶磷的能力(圖3)。
圖3 2 株解鉀菌在CAS 和PVK 培養(yǎng)基上進行斑點培養(yǎng)Fig.3 Two strains of potassium solubilizing bacteria were blotted on CAS and PVK medium
進一步對菌株進行了IAA 合成,產(chǎn)鐵載體和溶解磷能力的定量測定。隨著色氨酸濃度的增加,IAA 的合成水平也隨之增加,當色氨酸的濃度達到100、200 和500 μg·mL-1時,菌株XLT-4 和XLT-7 IAA 含量分別為12.37和23.52 μg·mL-1、12.22 和26.90 μg·mL-1、12.32 和28.90 μg·mL-1(圖4)。其鐵載體的相對含量(A/Ar 值)分別為0.73 和1.16;A/Ar 值越低則鐵載體含量越高;菌株XLT-4 和XLT-7 的溶磷量分別為97.45 和116.93 μg·mL-1。兩株菌均具有合成IAA、產(chǎn)生鐵載體和溶解無機磷的能力。
圖4 2 株解鉀菌產(chǎn)IAA、鐵載體、溶磷能力Fig.4 IAA production, siderophore and phosphorus solubilization capacity of two strains of potassium solubilizing bacteria
通過盆栽試驗評價了解鉀菌株對紫花苜蓿的促生效果。結(jié)果表明,接種XLT-4 和XLT-7 紫花苜蓿的株高、根長分別顯著提高了16.22%和13.43%、17.31%和13.15%,地上干鮮重分別顯著提高了25.35%和13.17%、28.87% 和19.45%、地下干鮮重分別顯著提高了 29.27% 和 20.34%、29.27% 和22.03%(P<0.05)。XLT-4 和XLT-7 及鉀長石粉(K)共接種與鉀長石粉(K)接種相比紫花苜蓿植株的株高、根長分別顯著增加了19.19%和8.56%、19.90%和8.87%,地上干、鮮重分別顯著增加了30.26%和15.96%、36.84%和22.55%,地下干鮮重分別顯著增加了29.17%和20.97%、33.33%和21.77%(P<0.05)(表 2)。
與對照相比,接種菌株XLT-4 和XLT-7 根系活力分別顯著提高了29.70%和24.75%(圖5)、植株鉀含量分別顯著提高了15.64%和18.24%、磷含量分別顯著提高了40.48%和42.86%、粗蛋白含量分別顯著提高了67.64%和46.83%、中性洗滌纖維含量分別顯著降低了15.41%和13.24%、酸性洗滌纖維含量分別顯著降低了15.09%和12.88%(P<0.05)。XLT-4 和XLT-7 及鉀長石粉(K)共接種與鉀長石粉(K)接種相比,根系活力分別顯著提高了49.55%和40.54%、植株鉀含量分別顯著提高了17.27%和20.91%、磷含量分別顯著提高了50.00%和52.08%、粗蛋白含量分別顯著提高了37.16%和37.16%,中性洗滌纖維含量分別顯著降低了17.50%和16.85%、酸性洗滌纖維含量分別顯著降低了16.54%和13.32%(P<0.05)。
表1 XLT-4 和XLT-7 的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of XLT-4 and XLT-7
圖5 接種2 株解鉀菌紫花苜蓿的根系活力、鉀、磷、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量Fig. 5 The root activity, K, P, crude protein, neutral detergent fiber (NDF) and acid detergent fiber (ADF) contents of two strains of potassium solution-producing alfalfa were inoculated
表2 解鉀菌對紫花苜蓿生物量的影響Table 2 Effects of potassium solubilizing bacteria on biomass of alfalfa
與對照相比,接種XLT-4 和XLT-7 紫花苜蓿根際土壤脲酶活性分別顯著提高了20.17%和24.54%(圖6),過氧化氫酶活性分別顯著提高了20.69%和27.59%,蔗糖酶活性分別顯著提高了24.09%和22.03%,土壤速效鉀含量分別顯著提高了7.31%和8.19%(P<0.05)。XLT-4 和XLT-7 及鉀長石粉(K)共接種與鉀長石粉(K)接種相比,土壤脲酶活性分別顯著提高了29.16% 和28.41%,過氧化氫酶活性分別顯著提高了35.48% 和38.71%,蔗糖酶活性分別顯著提高了25.57%和24.14%,土壤速效鉀含量分別顯著提高了10.29%和9.43%(P<0.05)。
圖6 接種2 株解鉀菌紫花苜蓿根際土壤脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶活性及速效鉀含量Fig. 6 The activity of urease, catalase, sucrase and available potassium content in the rhizosphere soil of alfalfa inoculated with two strains of potassium-solutionizing bacteria
鉀是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素,但土壤中大部分的鉀以不溶的形式存在,接種解鉀菌是提高土壤速效鉀含量的重要措施[31]。在過去的研究中,發(fā)現(xiàn)了許多具有解鉀能力的菌株,易浪波等[32]分離出11 株生長良好的解鉀菌,其解鉀率為10.03%~11.00%。Raji 等[33]從兩個不同石生棲息地植物根際土壤中篩選出15 株能力不同的解鉀菌,通過16S rDNA 序列分析,確定出4 株菌株分別與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)相似。本研究從紫花苜蓿根際土壤中篩選出2 株高效解鉀菌XLT-4 和XLT-7,為巨大芽孢桿菌和耐寒短桿菌,具有較強的解鉀能力。
2 株解鉀菌XLT-4 和XLT-7,均具有產(chǎn)生IAA 和鐵載體的能力。IAA 可以刺激根組織的分裂和伸長,促進根系萌發(fā)和生長[34]。鐵載體可以溶解以氧化物形式存在的難溶性鐵,使植物能夠吸收,從而促進植物生長[35]。孫科等[36]從牛蒡(Arctium lappa)根際土壤中分離得到1 株具有較強解鉀和產(chǎn)IAA 能力的菌株,并通過盆栽試驗證明其能夠促進宿主植物生長。王歡等[37]從茶樹(Camellia sinensis)根際分離到1 株解鉀菌GD3,菌株具有產(chǎn)鐵載體的特性。本研究選用的2 株解鉀菌產(chǎn)生IAA 的同時還具有產(chǎn)鐵載體的能力,可能是促進紫花苜蓿生長的原因之一。
解鉀菌能作為微生物菌肥促進植物的生長。陳臘等[38]通過田間試驗發(fā)現(xiàn),接種解鉀菌,顯著提高了玉米(Zea mays)拔節(jié)期的株高和地上生物量。研究發(fā)現(xiàn),用解鉀菌接種馬鈴薯(Solanum tuberosum),株高和枝條干重顯著增加[39]。Biswas 等[40]研究表明,接種解鉀菌,顯著提高了蘿卜(Raphanus sativus)的根長和鮮重。本研究接種菌株XLT-4 和XLT-7,紫花苜蓿株高、根長、地上干鮮重和地下干鮮重較對照組顯著增加。說明這2 株解鉀菌具有促進紫花苜蓿生長的能力。
植物根系活力和養(yǎng)分吸收能力直接影響地上部分的生物量以及作物的品質(zhì)[41]。Basak 等[42]研究表明,接種解鉀菌提高了獼猴桃(Actinidia chinensis)的根系活力和地上部分果實的產(chǎn)量和品質(zhì)。磷對植物生長有重要的作用,在植物體內(nèi)參與光合作用、呼吸作用,磷能促進早期根系的形成和生長,其次磷對蛋白質(zhì)的合成與分解也起著重要的作用[43]。接種解鉀菌G218 與未接種相比,顯著提高了薇甘菊(Mikania micrantha)植株的磷含量和鉀含量[44]。粗蛋白含量是評價植物營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標[45]。Singh 等[46]報道,施用不同解鉀菌顯著提高了馬鈴薯植株磷含量、鉀含量和馬鈴薯塊莖中粗蛋白含量。本研究的兩株解鉀菌在具有解鉀能力的同時,均具有溶解磷的能力,可以顯著提高紫花苜蓿根系活力、磷、鉀和粗蛋白含量。表明接種解鉀菌可顯著促進植物對鉀、磷的吸收,進而提高作物的品質(zhì)。
土壤酶的類型及酶活性的大小,可以反映土壤中微生物的代謝活動。土壤脲酶活性能夠代表土壤的供氮能力,脲酶的增加伴隨著土壤氮素的增加,增加根際氮源,促進紫花苜蓿健康生長;土壤過氧化氫酶是一種促進土壤物質(zhì)能量循環(huán)的氧化還原酶,可以反映土壤的呼吸強度;土壤蔗糖酶在碳循環(huán)中起著重要作用,促進植物生長和植株養(yǎng)分的吸收[47]。在本研究中,XLT-4 和XLT-7 解鉀菌處理后可以顯著提高土壤脲酶、過氧化氫酶和蔗糖酶活性。Raghavendra 等[48]研究表明,施用解鉀菌CR 顯著提高了土壤酶活性,促進養(yǎng)分循環(huán),并提高作物生產(chǎn)力。解鉀菌可以改善植物根際微環(huán)境,分解土壤礦物中的難溶性鉀,提高土壤速效養(yǎng)分含量[49]。本研究接種解鉀菌XLT-4 和XLT-7 后紫花苜蓿根際土壤速效鉀含量顯著提高。萬兵兵等[50]研究表明,接種解鉀菌后,煙草(Nicotiana tabacum)根際土壤速效鉀含量增加了4.72%,本研究結(jié)果與其一致。
從紫花苜蓿根際土壤中分離出2 株具有很強解鉀能力的菌株,分別為巨大芽孢桿菌和耐寒短桿菌。2 株菌株均具有產(chǎn)IAA、鐵載體和溶磷的能力。接種2 株解鉀菌顯著提高了紫花苜蓿的生物量、根系活力和粗蛋白含量,降低了纖維含量,并且提高了根際土壤酶活性和速效鉀含量。菌株XLT-4 和XLT-7 可作為開發(fā)微生物制劑的優(yōu)質(zhì)菌株資源。