張茜茜，朱慧明，楊肖靜，黃志偉 ，龔夢(mèng)馨，張志強(qiáng) ，牛津徽，楊洪江

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029)

【研究意義】細(xì)菌和真菌產(chǎn)生的鐵載體，是一類(lèi)對(duì)Fe3+具有較高親和力的小分子金屬離子螯合物(500～1500 daltons)，主要功能是為細(xì)胞提供鐵營(yíng)養(yǎng)成分[1]。鐵載體根據(jù)官能團(tuán)的不同主要分為氧肟酸型、兒茶酚型和檸檬酸型3類(lèi)[2]；而根據(jù)鐵載體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類(lèi)，主要分為線性結(jié)構(gòu)和環(huán)狀結(jié)構(gòu)。盡管鐵載體之間存在很多的差異，但多數(shù)借助帶負(fù)電荷的氧原子與Fe3+結(jié)合，6個(gè)配體與1個(gè)Fe3+形成最常見(jiàn)的六面體或八面體結(jié)構(gòu)[3]。隨著研究的深入，大量鐵載體的相似物被發(fā)現(xiàn)，如與ferrioxamines結(jié)構(gòu)相似的鐵載體就高達(dá)20種[4]。這些類(lèi)似物的不同之處在于側(cè)鏈上的短肽，這些多肽為Fe3+結(jié)合提供了最適的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)還保護(hù)鐵載體免受水解酶的破壞作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鐵載體一方面為生物提供鐵營(yíng)養(yǎng)成分，維持微生物的正常生長(zhǎng)；另一方面，某些鐵載體不僅能螯合Fe3+，還能與Al3+、Co2+、Pb2+和Cu2+等金屬離子結(jié)合[5]。鐵載體(desferrioxamine, DFOB)在高pH值下，與鈷離子的螯合能力大于鐵離子，在對(duì)礦山廢棄物或者金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)時(shí)，可以使用鐵載體清理重金屬離子，對(duì)于環(huán)境的生物修復(fù)具有重要應(yīng)用價(jià)值[6]。東方擬無(wú)枝酸菌Amycolatopsisorientalis產(chǎn)生的鐵載體乙二胺二琥珀酸(ethylene diaMino-disuccinic acid, EDDS)以及根瘤菌Rhizobiummeliloti產(chǎn)生的鐵載體rhizobactin，被認(rèn)為是天然的生物可降解的APCAs(aminopolycarboxylic chelating agents)型螯合劑，能夠替代合成螯合劑，與不同金屬形成絡(luò)合物，同時(shí)不污染環(huán)境，是一種經(jīng)濟(jì)且環(huán)境友好的技術(shù)[7]。【本研究切入點(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)室分離了一株產(chǎn)鐵載體的枯草芽孢桿菌MB8[8]，本研究擬對(duì)MB8合成鐵載體的培養(yǎng)條件、鐵載體的類(lèi)型及分子結(jié)構(gòu)、鐵載體的抗氧化作用以及促進(jìn)不溶性針鐵礦溶解的功能等方面進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】旨為枯草芽孢桿菌MB8的可能應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株 枯草芽孢桿菌B.subtilisMB8分離自雞糞樣品中，具有合成鐵載體的能力[8]。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌的常規(guī)培養(yǎng)，MKB(Modified King B)培養(yǎng)基主要用于對(duì)常見(jiàn)致病菌的培養(yǎng)，察氏培養(yǎng)基(Czapek Dox Medium)主要用于霉菌的培養(yǎng)。AM(Arginine Medium)培養(yǎng)基[9]主要用于培養(yǎng)菌株產(chǎn)生鐵載體，成分為K2SO41 g/L、CH3COONH43 g/L、MgSO40.8 g/L、ZnSO40.0086 g/L、MnSO40.113×10-3g/L、葡萄糖20 g/L、精氨酸1.5 g/L、Na2HPO43 g/L，調(diào)pH至7.0。

1.1.3 溶液 CAS(Chrome Azurol S)溶液[10]主要用于檢測(cè)鐵載體，成分為鉻天青S 1.21 g/L、十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide, HDTMA)1.82 g/L、FeCl3(溶于10 mmol/L HCl)0.27 g/L、無(wú)水哌嗪30.24 g/L，調(diào)pH至5.6。Arnow試劑主要用于檢測(cè)兒茶酚型鐵載體，成分為0.5 mol/L HCl、1 mol/L NaOH、10 g鉬酸鈉和10 g亞硝酸鈉，溶解于部分去離子水中，待完全溶解后體積補(bǔ)至100 mL[11]。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液，含有400 μmol/L DPPH，溶于80 %的無(wú)水甲醇。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 正交設(shè)計(jì) 為了確定最佳鐵載體產(chǎn)生條件，選取甘油、精氨酸、接種量這3個(gè)因素，以鐵載體產(chǎn)量SU為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)[12]，實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

(1)

式中，Ar是未接種的培養(yǎng)基與等體積CAS混合后的OD680，As是菌株上清與等體積CAS混合后的OD680。

1.2.2 金屬離子對(duì)鐵載體產(chǎn)量的研究 2,3-二羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。為了定量分析菌株MB8產(chǎn)生的兒茶酚型鐵載體的含量，分別配置0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 g/L的2,3-二羥基苯甲酸(2,3-dihydroxy-benzoic acid, DHBA)標(biāo)準(zhǔn)溶液，Arnow試劑檢測(cè)，以O(shè)D510的吸光度值為縱坐標(biāo)，以DHBA的濃度為橫坐標(biāo)，繪制DHBA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Fe3+對(duì)菌株鐵載體產(chǎn)量的影響。在培養(yǎng)基中添加Fe3+，使Fe3+的終濃度分別為0、0.1、0.5、1.0 μmol/L，36 h后測(cè)定菌株的生物量OD600和鐵載體產(chǎn)量，同時(shí)取1 mL菌液梯度稀釋涂板計(jì)數(shù)。

Al3+對(duì)菌株鐵載體產(chǎn)量的影響。為了比較鐵載體對(duì)Fe3+和Al3+的螯合能力，將常規(guī)的CAS溶液中的Fe3+用等體積等濃度的Al3+替代，然后取1 mL菌株MB8的無(wú)細(xì)胞上清液與2種CAS溶液混合，室溫下靜置1 h后測(cè)定OD680，以培養(yǎng)基為陰性對(duì)照；在培養(yǎng)基中添加Al3+，使其Al3+的終濃度分別為0、20、50和100 μmol/L，36 h后測(cè)定菌株的生物量OD600和鐵載體產(chǎn)量，同時(shí)取1 mL菌液梯度稀釋涂板計(jì)數(shù)。

Cu2+對(duì)鐵載體產(chǎn)量的研究。在培養(yǎng)基分別添加終濃度為0、20、50和100 μmol/L的Cu2+，36 h后測(cè)定菌株的生物量OD600和鐵載體產(chǎn)量，同時(shí)取1 mL菌液梯度稀釋涂板計(jì)數(shù)。

1.2.3 鐵載體對(duì)不溶性針鐵礦的溶解研究 不溶性針鐵礦(goethite)的制備。將180 mL 氫氧化鉀(5 mol/L)加入到100 mL硝酸鐵(1 mol/L)溶液中，迅速加入去離子水至體積為2 L，70 ℃下加熱60 h，待冷卻至室溫后去離子水洗滌至上清pH值為中性，真空冷凍干燥12 h后得到土黃色粉末狀物質(zhì)，使用將其前加入到三角瓶中，121 ℃滅菌20 min[13]。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素及水平Table 1 Orthogonal experimental design of various factors and levels

鐵載體對(duì)不溶性針鐵礦的溶解利用。菌株MB8在終濃度為0和100 μmol/L Fe3+的培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后，發(fā)酵液經(jīng)離心過(guò)濾后，在每個(gè)已分裝有3 mg自制無(wú)菌針鐵礦(goethite)的三角瓶中加入30 mL不同鐵載體含量的無(wú)細(xì)胞濾液，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)，每隔12 h取出1瓶，10 000 r/min離心5 min除去不溶的針鐵礦，-80 ℃下預(yù)凍24 h，真空冷凍干燥12 h，加入15 mL純凈水，充分溶解后，利用原子吸收分光光度法測(cè)定溶液中鐵的含量[14]。

1.2.4 鐵載體結(jié)構(gòu)的初步鑒定 鐵載體的溶劑萃取。10 000 r/min離心菌株MB8發(fā)酵液10 min，10 kD截留量的聚砜中空纖維柱超濾，濾液用6 mol/L HCl調(diào)pH值為2.0，用1/2體積的乙酸乙酯萃取3次，棄水相保留有機(jī)相，0.1個(gè)真空度30 ℃旋蒸，沉淀溶于無(wú)水甲醇，0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后4 ℃下保存[15]，為鐵載體粗提液。

液質(zhì)聯(lián)用對(duì)鐵載體結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析。①全波長(zhǎng)掃描 對(duì)含有鐵載體的溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定菌株MB8鐵載體的吸收波長(zhǎng)。②HPLC-ESI-MS。將上述得到的菌株MB8鐵載體粗提液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，條件設(shè)置分別為：色譜柱類(lèi)型：Phenomenex Luna C18(5 μm)；流動(dòng)相：5 %乙腈(0.1 %甲酸)-100 %乙腈(0.1 %甲酸)；柱溫：25 ℃；離子源：ESI；離子極性：負(fù)離子；掃描范圍：100 ℃1 000 m/z。③UPLC-ESI-MS/MS。利用Waters UPLC-Quattro Premier XE三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)菌株MB8產(chǎn)生的兒茶酚型鐵載體進(jìn)行進(jìn)一步的分析，該儀器配有Waters ACQUITY UPLC?BEH C18(1.7 μm，2.1100 mm柱子)，一級(jí)質(zhì)譜的掃描范圍是100～1000 m/z，二級(jí)質(zhì)譜的掃描范圍是50～950 m/z，二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量為10、20、30和40 V。

1.2.5 鐵載體抗氧化作用的研究 鐵載體具有的抗氧化能力通過(guò)對(duì)DPPH自由基清除能力來(lái)表示，對(duì)DPPH的清除能力越大，說(shuō)明兒茶酚型鐵載體的抗氧化能力越強(qiáng)。菌株分別在含有0 和100 μmol/L Fe3+濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，鐵載體產(chǎn)量SU分別為91.99 %和1.01 %，發(fā)酵液經(jīng)酸化和乙酸乙酯萃取處理，得到的溶液旋蒸至干，甲醇溶解后，稀釋1000倍后取不同體積(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mL)于試管中，補(bǔ)加甲醇至2 mL，然后再分別添加2 mL DPPH溶液，避光室溫下反應(yīng)30 min后測(cè)定517 nm處的吸光度值[16]。

(2)

式中，A1：樣品和DPPH混合30 min后的OD517；A2：甲醇和DPPH混合30 min后的OD517；A3：樣品和甲醇混合30 min后的OD517。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株MB8分泌鐵載體條件的優(yōu)化

選取甘油、精氨酸、接種量為單因素，選用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)。根據(jù)表2的極差分析結(jié)果可以看出，對(duì)MB8鐵載體產(chǎn)量影響的主次順序是甘油>接種量>精氨酸；從表3的正交結(jié)果方差分析顯示，區(qū)間組F=2.56，概率P= 0.1480 >α=0.05，說(shuō)明區(qū)間組差異不顯著，即可不考慮因素之間的交互作用；A(甘油)因素F= 19.32，概率P= 0.0009 <α =0.01說(shuō)明甘油濃度對(duì)鐵載體產(chǎn)量的影響極為顯著；B(精氨酸濃度)因素F= 0.99，概率P=0.4129 >α =0.05，說(shuō)明B精氨酸濃度的改變對(duì)菌株鐵載體產(chǎn)量影響不顯著；C因素F= 4.37，概率P= 0.0522>α =0.01，略大于α =0.05，說(shuō)明接種量對(duì)菌株鐵載體產(chǎn)量影響微顯著。綜上可得最優(yōu)的培養(yǎng)條件為甘油濃度4 %(mL/L)，精氨酸濃度1.5 g/L，其余成分保持不變，接種量為7 %。

表2 L9(34) 鐵載體產(chǎn)量正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results of siderophore-production

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3 ANOVA of orthogonal experiment

2.2 金屬離子對(duì)鐵載體產(chǎn)量的影響

為了定量分析兒茶酚型鐵載體的含量，按照Arnow方法檢測(cè)不同濃度的2,3-二羥基苯甲酸(2, 3-dihydroxy-benzoic acid, DHBA)標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得DHBA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。根據(jù)上述求得的方程式，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基成分和發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化，MB8產(chǎn)生的兒茶酚型鐵載體量OD510= 1.991，相當(dāng)于DHBA標(biāo)品的濃度為0.117 g/L。

Al3+是一種常見(jiàn)的三價(jià)金屬元素，與Fe3+具有相似的離子半徑，當(dāng)用等體積等濃度的Al3+代替常規(guī)CAS溶液中的Fe3+，全波長(zhǎng)掃描藍(lán)色CAS-Al3+-CTAB絡(luò)合物，發(fā)現(xiàn)CAS-Al3+-CTAB絡(luò)合物的特異吸收波長(zhǎng)依然在680 nm處。取等體積上清與2種CAS溶液混合，室溫下靜置反應(yīng)1 h，發(fā)現(xiàn)混合液中CAS-Al3+-CTAB濃度大于CAS-Fe3+-CTAB，也就是說(shuō)MB8產(chǎn)生的鐵載體在相同濃度和相同時(shí)間內(nèi)，從CAS-Al3+-CTAB中競(jìng)爭(zhēng)螯合Al3+的能力要小于從CAS-Fe3+-CTAB中競(jìng)爭(zhēng)螯合Fe3+的能力。

圖1 2,3-二羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of 2,3-dihydroxy-benzoic acid

如圖2(A)所示，當(dāng)菌株MB8在含有不同濃度的Al3+培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，菌株生物量無(wú)顯著差異，但每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的鐵載體產(chǎn)量 顯著增加，與對(duì)照(0 μmol/L Al3+)相比，Al3+濃度分別為20、50和100 μmol/L，兒茶酚型鐵載體產(chǎn)量相應(yīng)提高了24.66 %、34.15 %和34.40 %。針對(duì)這種現(xiàn)象最可能的解釋就是當(dāng)Al3+與鐵載體結(jié)合后，生物不能獲得足夠的鐵營(yíng)養(yǎng)滿足自身的生長(zhǎng)，被迫產(chǎn)生更多的鐵載體來(lái)獲得鐵元素。

除此之外，菌株的鐵載體產(chǎn)量還受到二價(jià)金屬離子的影響。如圖2(B)所示，適量的Cu2+對(duì)MB8的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，當(dāng)濃度增加到100 μmol/L時(shí)，菌株生物量出現(xiàn)明顯下降，但每個(gè)細(xì)胞的鐵載體產(chǎn)量卻沒(méi)有因Cu2+濃度的變化受到影響，說(shuō)明在一定的濃度范圍內(nèi)，Cu2+濃度的變化對(duì)鐵載體產(chǎn)量無(wú)顯著影響。

2.3 鐵載體促進(jìn)不溶性針鐵礦的溶解

在低鐵載體含量下，不溶性針鐵礦24、36和60 h的溶解度分別是0.019、0.024和0.035 μg/mL，溶解速率分別為0.002、0.002、0.003 μg/(mL·h)；高鐵載體含量下，不溶性針鐵礦在24、36、48、60、72和84 h的溶解度分別是0.028、0.028、0.111、0.139、0.167和0.223 μg/mL，此時(shí)的溶解速率分別是0.002、0.002、0.009、0.012、0.014和0.019 μg/(mL·h)，鐵載體的作用使得不溶性針鐵礦的溶解速率提高了約6倍。

圖2 金屬離子對(duì)菌株MB8鐵載體產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of metal ion on siderophore-production of MB8 strain

2.4 色譜分析鐵載體結(jié)構(gòu)

分別對(duì)標(biāo)品2,3-羥基苯甲酸(2,3-DHBA)、乙酸乙酯萃取后的水相樣品和有機(jī)相樣品，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)掃描結(jié)果選擇245 和315 nm作為吸收波長(zhǎng)。初步分離后的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)高壓液相分離，在色譜圖上出現(xiàn)多個(gè)峰，其中保留時(shí)間為13.320 min的峰(圖3)與標(biāo)品2,3-DHBA的保留時(shí)間為13.420 min相近，所以，鐵載體粗提液中可能含有DHBA。

2.5 ESI離子源負(fù)離子模式質(zhì)譜儀分析鐵載體的結(jié)構(gòu)

將高壓液相制備的物質(zhì)依次加入ESI離子源負(fù)離子模式質(zhì)譜儀中，如圖4所示，液相中保留時(shí)間11.48，13.18、13.30和14.55 min對(duì)應(yīng)的質(zhì)荷比(m/z)為311、605、153和881，分別與[(DHBA-Gly-Thr)-H]-、[(DHBA-Gly-Thr)2-H]-、[DHBA-H]-和[(DHBA-Gly-Thr)3-H]-一致。

2.6 UPLC-ESI-MS/MS質(zhì)譜儀分析鐵載體結(jié)構(gòu)

為了確認(rèn)菌株MB8合成鐵載體的結(jié)構(gòu)，選取質(zhì)荷比為881 m/z的離子進(jìn)入U(xiǎn)PLC-ESI-MS/MS質(zhì)譜儀，如圖5所示，m/z為881的離子(M)被進(jìn)一步離子化，出現(xiàn)的碎片質(zhì)荷比主要有587、293和192，分別與[M-(DHBA-Gly-Thr)-H]-、[M-(DHBA-Gly-Thr)2-H]-和[DHBA+Gly-H]-對(duì)應(yīng)，其中m/z為249是去碳酸基的[DHBA-Gly-Thr-H]-。

綜合以上結(jié)果，初步推斷菌株MB8產(chǎn)生的兒茶酚型鐵載體可能與已知的Bacillibactin相似，分子量為882，以中間代謝產(chǎn)物DHBA為前體物質(zhì)，通過(guò)肽鍵與甘氨酸Gly和蘇氨酸Thr結(jié)合形成單體，然后單體聚集在一起形成二體或環(huán)狀三體[17]。

2.7 鐵載體的抗氧化作用

Maud等人研究表明沙門(mén)氏菌能分泌的兒茶酚型鐵載體，且該物質(zhì)能幫助沙門(mén)氏菌應(yīng)對(duì)某些氧化壓力[18]。為了確定菌株MB8產(chǎn)生的兒茶酚型鐵載體是否具有抗氧化能力，利用對(duì)DPPH自由基的清除能力來(lái)表示其抗氧化能力。如圖6所示，將鐵載體產(chǎn)量SU分別為91.99 %和1.01 %的粗提液，分別稀釋1000倍后取不同體積后與DPPH溶液避光混合，其中鐵載體含量SU為91.99 %的粗提液對(duì)DPPH自由的清除能力隨著體積的增加逐漸增大，而鐵載體含量SU為1.01 %的粗提液對(duì)DPPH的清除能力幾乎沒(méi)有變化。

A：標(biāo)品2,3-二羥基苯甲酸；B：菌株MB8的鐵載體粗提液圖3 高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatogram

A：溶液1在HPLC-ESI-MS的負(fù)離子模式下的總離子流圖；箭頭：指向的是某一質(zhì)荷比的選擇離子流圖；B：相應(yīng)保留時(shí)間下物質(zhì)的質(zhì)譜圖圖4 溶液中不同保留時(shí)間下的質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of the peak with different retention time of sample

3 討 論

自然界中，細(xì)菌通過(guò)合成分泌鐵載體獲取所需的鐵元素用于生長(zhǎng)，并在各種微生物生態(tài)系統(tǒng)中獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。芽孢桿菌是重要的革蘭氏陽(yáng)性菌，目前已經(jīng)從不同環(huán)境中分離出多種能夠合成鐵載體的菌株。例如從文冠果植株根系瘤狀物分離獲得了能夠產(chǎn)鐵載體的多株內(nèi)生細(xì)菌，分別屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)和短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)[19]；從黑麥草根際土壤中分離到1株產(chǎn)鐵載體巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumLY02，該菌株具有較強(qiáng)的耐鎘能力[20]；從花生根際分離篩選出產(chǎn)鐵載體芽孢桿菌HSGJ1，對(duì)鎳離子具有較強(qiáng)耐受性，能夠有效促進(jìn)花生生長(zhǎng)，并降低花生根系的鎳離子含量[21]；從海南辣椒的根際土壤中分離了產(chǎn)鐵載體的枯草芽孢桿菌B.subtilisCAS15，能夠有效地促進(jìn)植株的生長(zhǎng)[22]；從煉鐵廠土壤中分離了芽孢桿菌Bacillussp. SD12，具有較強(qiáng)的抗真菌活性[23]。短小芽孢桿菌BacilluspumilusToIrMA-KC806242能夠合成鐵載體，可以作為潛在生物防控因子，抑制番茄枯萎病[24]；從CoffeaarabicaL.根際土壤中分離了芽孢桿菌BT42，能夠鐵載體，抑制CoffeaarabicaL.的病原菌[25]。

芽孢桿菌合成的鐵載體具有多樣性?？莶菅挎邨U菌B.subtilisCAS15能夠合成鐵載體catecholic siderophore 2,3-dihydroxybenzoate-glycine-threonine trimeric ester bacillibactin[22]。芽孢桿菌BacillusSp. SD12能夠合成異羥肟酸類(lèi)型的鐵載體[23]。蘇云金芽孢桿菌BacillusthuringiensisATCC 33679合成鐵載體bacillibactin，炭疽芽孢桿菌BacillusanthracisSterne strains和蠟狀芽孢桿菌BacilluscereusATCC 14579能夠分泌2種兒茶酚鐵載體、1種攜帶3,4-dihydroxybenzoyl基團(tuán)的鐵載體petrobactin和攜帶2,3-dihydroxybenzoyl的鐵載體bacillibactin[26]。淀粉液化芽孢桿菌BacilluslicheniformisVK21合成一種兒茶酚胺類(lèi)型鐵載體(Catecholic Siderophore)，經(jīng)過(guò)氨基酸分析與核磁共振分析，確定其結(jié)構(gòu)為2,3-dihydroxybenzoyl-glycyl-threonine[27]。

色譜圖顯示：由上至下分別m/z=881(RT=10.93)在不同碰撞能量下的二級(jí)質(zhì)譜圖，由上至下碰撞能量依次為10、20、30、40V)圖5 UPLC-ESI-MS/MS質(zhì)譜圖Fig.5 UPLC-ESI-MS/MS spectra

圖6 鐵載體對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.6 Eliminating ratio of hydroxyl radical by siderophore

鐵載體的發(fā)酵一般是在低鐵培養(yǎng)基中完成。在培養(yǎng)基中加入一定濃度的錳離子，能夠顯著提高淀粉液化芽孢桿菌BacilluslicheniformisVK21分泌鐵載體的水平[27]。巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumATCC 19213合成鐵載體于葡萄糖是否存在無(wú)關(guān)，甘油作為碳源能夠顯著提高鐵載體的水平，甘露糖具有相反作用，靜止培養(yǎng)鐵載體水平顯著低于震蕩培養(yǎng)[28]。本研究中，適當(dāng)濃度的甘油、精氨酸、鋁離子和銅離子，能夠促進(jìn)鐵載體的分泌。

4 結(jié) 論

本文對(duì)菌株B.subtilisMB8分泌的鐵載體進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在鐵脅迫條件下分泌的鐵載體水平較高，分泌的鐵載體具有良好的抑菌作用、清除DPPH自由基的抗氧化能力和加速不溶性針鐵礦溶解的能力。此外，利用UPLC-ESI-MS/MS對(duì)B.subtilisMB8產(chǎn)生的鐵載體進(jìn)行分析，初步推斷鐵載體結(jié)構(gòu)含有2,3-二羥基苯甲酸、甘氨酸和蘇氨酸，與已知鐵載體Bacillibactin具有相似結(jié)構(gòu)。B.subtilis菌株MB8能夠產(chǎn)生芽孢，對(duì)逆環(huán)境有一定的耐受能力，更易于保存和運(yùn)輸，在多種領(lǐng)域可能具有較好的應(yīng)用前景。