衛(wèi)宏健，賀文員，王越，唐明，陳輝

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院， 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510642）

褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色胺，melatonin， MT，化學(xué)式C13H16N2O2）是廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的吲哚類化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化作用［7］。植物中褪黑素的合成主要涉及色氨酸脫羧酶（tryptophan decarboxylase， TDC）、色胺5 羥化酶（tryptamine 5-hydroxylase， T5H）、血清素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（serotonin N-acetyltransferase， SNAT）、咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeic acid O-methyltransferase， COMT）和乙酰血清素甲基轉(zhuǎn)移酶（acetylserotonin methyltransferase， ASMT）［8-9］。褪黑素作用于多種植物細(xì)胞代謝和生物過程，包括生根、光合作用和脅迫耐受性［10-11］。特別是褪黑素（無論是外源施用或基因表達(dá)生物合成的內(nèi)源褪黑素）作為一種有效的抗氧化劑、膜穩(wěn)定劑和生物刺激劑，可改變氧化還原基因的表達(dá)或者滲透物質(zhì)的水平，從而顯著提高植物對(duì)生物與非生物脅迫的耐受性［12］。外源褪黑素通過提高高羊茅（Festuca arundinacea）幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性水平和葉片的光合效率，同時(shí)降低膜滲透性、丙二醛（malonaldehyde， MDA）和過氧化氫（hydrogen peroxide， H2O2）含量，以提高高羊茅幼苗的耐熱性［13］。高溫脅迫下植物調(diào)節(jié)褪黑素合成的相關(guān)基因（如BjTDC1和BjSNAT1）的表達(dá)，以增強(qiáng)芥菜（Brassica juncea）的高溫耐受性［14］。因此，富含褪黑素的植物或外源施用褪黑素在改善植物生長(zhǎng)和抗脅迫能力方面具有很高的潛力。

已知大多數(shù)陸生植物的根系能與叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi， AMF）形成共生關(guān)系［15］。前人研究發(fā)現(xiàn)，叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal， AM）共生能夠提高宿主植物對(duì)干旱、鹽、高溫和低溫等非生物脅迫的抗性［16-18］。高溫脅迫下，接種AMF 通過延緩葉片的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、游離脯氨酸和葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降以提高杜鵑花（Rhododendron simsii）的耐熱性［19］。接種AM 真菌（Septoglomus deserticola和Septoglomus constrictum）可以通過降低番茄（Solanum lycopersicum）脂質(zhì)過氧化水平和H2O2積累量，提高活性氧清除劑的活性，進(jìn)而緩解番茄的高溫?fù)p傷［20］。Zhang 等［21］發(fā)現(xiàn)AM 真菌異形根孢囊霉（Rhizophagus irregularis）通過提高蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）內(nèi)源褪黑素的含量，提高了對(duì)重金屬鉛（Pb）的耐受性，證明了共生微生物在植物中調(diào)節(jié)和合成褪黑素的潛力。目前關(guān)于菌根化植物在熱脅迫下調(diào)節(jié)褪黑素產(chǎn)生的機(jī)制，以及AM 真菌與褪黑素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)宿主植物的發(fā)育和耐熱性方面的影響尚不清楚。因此，本研究以多年生黑麥草為試驗(yàn)材料，通過接種AM真菌異形根孢囊霉和澆灌外源褪黑素，探索AMF 和外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下多年生黑麥草的生長(zhǎng)、內(nèi)源褪黑素含量及其合成基因的表達(dá)水平，抗氧化酶活性和小分子滲透物質(zhì)含量的影響，為解析褪黑素對(duì)菌根化植物的非生物脅迫抗逆性機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與基質(zhì)

本研究所用的多年生黑麥草種子（品種：首相Ⅲ）購(gòu)買于天津百綠國(guó)際草業(yè)有限公司。多年生黑麥草種子在75%的乙醇溶液中浸泡5 min 進(jìn)行表面消毒，然后用無菌蒸餾水漂洗4 次。此外，將沖洗過的種子種植在含有基質(zhì)（沙子∶泥炭=1∶3，v/v）的塑料盆中（高10 cm，直徑10 cm），播種密度為20 g·m-2?；|(zhì)中有機(jī)質(zhì)含量5.68 g·kg-1、速效磷含量22.01 mg·kg-1、速效氮含量34.53 mg·kg-1和速效鉀含量71.23 mg·kg-1。在種植多年生黑麥草種子之前，用75%的乙醇溶液對(duì)塑料盆進(jìn)行消毒，并在播種前連續(xù)3 d 在高壓滅菌鍋中（121 ℃，0.11 MPa）對(duì)基質(zhì)進(jìn)行消毒1 h。在最適溫度條件［25 ℃/20 ℃（晝/夜）］、60%的相對(duì)濕度、14 h/10 h（光/暗）的光周期以及650 mmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度下，將幼苗養(yǎng)在生長(zhǎng)室中。為保持土壤濕潤(rùn)，初始階段花盆在早上和晚上都進(jìn)行了灌溉。出苗后每天給植物澆水一次，每7 d 對(duì)植物進(jìn)行修剪，以保持8 cm 的冠層高度，同時(shí)每周使用半濃度的Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液澆灌一次，以保證足夠的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。外源褪黑素（AR 級(jí)），購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司。研究使用的叢枝菌根真菌為異形根孢囊霉（BGC BJ09，Ri）來自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，利用玉米（Zea mays）作為宿主植物進(jìn)行擴(kuò)繁后，用蔗糖梯度離心法獲得的孢子作為接種物［22］。將1 mL 含有約400 個(gè)孢子的水溶液作為孢子劑接種到14 d 苗齡的多年生黑麥草幼苗根系附近，非菌根（non-mycorrhizal，NM）處理為接種相同體積的滅菌孢子劑（在121 ℃的高壓滅菌鍋中滅菌15 min）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在接種Ri 45 d 后于2022 年10 月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。選取48 盆多年生黑麥草幼苗，均分為最適溫度條件（CK）和高溫條件（high temperature，HT）兩組，每組包含4 個(gè)處理，包括：1）既不接種AM 真菌也不澆灌外源褪黑素溶液（NM-NT）；2）僅根部接種AM 真菌（AM-NT）；3）僅用褪黑素溶液灌根（NM-MT）；4）褪黑素和AM 真菌聯(lián)合處理（AM-MT）。每個(gè)處理6 個(gè)重復(fù)（6 個(gè)盆栽），最適溫度（CK）為25 ℃/20 ℃（日/夜），高溫處理（HT）為38 ℃/33 ℃（日/夜），生長(zhǎng)室其他條件不變：60%的相對(duì)濕度、14 h/10 h（光/暗）的光周期以及650 mmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度，高溫處理共進(jìn)行28 d。參考Zhang 等［23］的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在熱脅迫處理前3 d，每天用5 mL 20 mmol·L-1褪黑素（MT）灌溉幼苗，隨后在余下的28 d 內(nèi)每隔7 d 澆灌一次，對(duì)不施用褪黑素（NT）的幼苗澆灌等體積的蒸餾水。高溫處理28 d 后收樣，將地上地下部分分開，洗凈后測(cè)量鮮重后放進(jìn)80 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，稱量并記錄其干重。其中每個(gè)處理選取4 盆植株根系來評(píng)估AM 定殖的效果，樣品的其余部分用液氮研磨成粉末，并保存在-80 ℃冰箱后進(jìn)行下一步分析。

1.3 菌根定殖率的測(cè)定

每個(gè)處理隨機(jī)選取4 盆多年生黑麥草的根系，按照Koske 等［24］的方法對(duì)根系進(jìn)行染色，利用放大十字交叉法［25］計(jì)算菌根定殖率。菌根定殖率（%）=侵染點(diǎn)數(shù)量/檢測(cè)的總交叉點(diǎn)數(shù)量×100。

1.4 抗氧化酶活性測(cè)定

采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性［26］。采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶（peroxidase， POD）活性［27］。采用紫外吸收法測(cè)定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性［28］。采用Nakano 等［29］的方法測(cè)定抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性。參考Chen 等［30］的方法測(cè)定吡咯啉-5-羧酸還原酶（pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR）活性。采用深圳子科生物科技有限公司的試劑盒，測(cè)定苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性。

1.5 膜脂過氧化指標(biāo)與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)測(cè)定

參照高俊鳳［31］的方法測(cè)定根系MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率（electrolytic leakage，EL）。采用蘇州科銘技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，按照試劑盒說明進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算脯氨酸、可溶性糖、類黃酮、總酚和甜菜堿含量。

1.6 內(nèi)源褪黑素含量測(cè)定

取0.1 g 根樣，液氮速凍后低溫研磨至粉末，加入900 μL PBS 緩沖液（pH=7.4）充分混合，12000 r·min-1離心15 min 后取上清液為待測(cè)樣品。使用深圳子科生物科技有限公司褪黑素酶聯(lián)免疫分析試劑盒（酶聯(lián)生物）測(cè)定褪黑素含量。

(5)成效慢.白猿通背拳需要日積月累的練習(xí)才能達(dá)到一定的效果，但反觀現(xiàn)在發(fā)展的比較出色的跆拳道、空手道等，其基本內(nèi)容略微簡(jiǎn)單，訓(xùn)練體系較為明晰，學(xué)生學(xué)上數(shù)月，便可看出成效.但白猿通背拳的練習(xí)則要以年來計(jì)算，并且對(duì)身體協(xié)調(diào)性與力量有著極高的要求，若沒有足夠的時(shí)間練習(xí)，則很難收獲想要的成績(jī).

1.7 基因表達(dá)分析

總RNA 采用Trizol 試劑盒參考說明書進(jìn)行提取，經(jīng)Nanodrop 2000 檢測(cè)濃度和純度以及用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性后，根據(jù)Fermentas cDNA synthesis 試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參考TaKara 公司的SYBR System 操作手冊(cè)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（BioRad，CFX96，美國(guó)）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。每個(gè)處理設(shè)置 6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3 個(gè)技術(shù)重復(fù)?；蛱禺愋砸镄蛄袇⒖急?1 進(jìn)行合成，以LpeIF4A基因?yàn)閮?nèi)參基因［32］。根據(jù)得到的Ct 值，利用2-ΔΔCt法，分別計(jì)算目標(biāo)基因在不同處理下的相對(duì)表達(dá)量。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the study

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2019 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖表分析，用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行方差分析，用 Duncan’s 法在P＜0.05 水平下進(jìn)行多重比較。采用Origin 2022 進(jìn)行制圖以及主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素處理對(duì)高溫脅迫下AMF 定殖率的影響

無論是否添加了外源褪黑素，熱脅迫均顯著降低了Ri 在多年生黑麥草根系的定殖率（P＜0.05）。在最適溫度和熱脅迫條件下，褪黑素處理均顯著提高了Ri 的定殖率（P＜0.05），其中最適溫度下褪黑素處理的菌根化多年生黑麥草表現(xiàn)出更高的定殖率（87.61%）（圖1）。

圖1 不同處理下叢枝菌根真菌在多年生黑麥草根系的定殖率Fig. 1 Colonization rate of perennial ryegrass roots by arbuscular mycorrhizal fungi under different treatments

2.2 外源褪黑素處理和AM 共生條件下多年生黑麥草內(nèi)源褪黑素含量及其合成基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)

最適溫度條件下，相比于NM-NT 和AM-NT 處理，NM-MT 和AM-MT 處理的根系內(nèi)源MT 含量分別顯著增加了1.12 和1.03 倍（P＜0.05）。在高溫條件下，外源褪黑素顯著提高了AM 和NM 多年生黑麥草的根系內(nèi)源MT 含量（P＜0.05）（圖2A）。

圖2 不同處理下的多年生黑麥草內(nèi)源褪黑素含量及其合成基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 Endogenous melatonin content and transcript levels of its synthetic genes in perennial ryegrass under different treatments

高溫脅迫下，相比于AM-NT 處理，AM-MT 處理的 MT 合 成 基 因LpTDC1、LpTDC2、LpT5H、LpSNAT、LpASMT1和LpASMT3的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升了43.84%、50.55%、21.25%、32.63%、40.25% 和44.83%（P＜0.05），而LpCOMT1的相對(duì)表達(dá)量則無顯著變化（P＞0.05）（圖2B～H）。與NM-MT 處理相比，AM-MT 處理的根系LpTDC1、LpT5H、LpSNAT、LpCOMT1、LpASMT1和LpASMT3基因相對(duì)表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）（圖2B～H）。此外，在最適溫度條件下，AM-NT 和AM-MT 處理的根系LpTDC1、LpT5H和LpSNAT基因的轉(zhuǎn)錄水平與NM-NT 和NMMT 處理差異不顯著（P＞0.05）（圖2B，D，E）。AMMT 和NM-MT 處理的根系LpTDC2、LpCOMT1、LpASMT1和LpASMT3基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于（P＜0.05）AM-NT 和NM-NT 處理。

2.3 外源褪黑素處理和AM 共生條件下多年生黑麥草生長(zhǎng)參數(shù)對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)

高溫脅迫抑制了多年生黑麥草的生長(zhǎng)，而AM-NT、NM-MT 和AM-MT 處理均減輕了熱應(yīng)激引起的生長(zhǎng)抑制（圖3A，B）。在高溫條件下，AM-MT 處理的草坪質(zhì)量、株高、地上和地下部分的鮮重和干重均顯著高于AMNT 和NM-MT 處理（P＜0.05）（圖3C 和表2）。此外，在最適溫度條件下，AM-NT 處理的草坪質(zhì)量、株高、地上和地下部分的鮮重和干重與NM-MT 處理差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同處理對(duì)高溫脅迫下多年生黑麥草生長(zhǎng)和草坪質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of different treatments on growth and turf quality of perennial ryegrass under high temperature stress

表2 不同處理下的多年生黑麥草生長(zhǎng)參數(shù)Table 2 Growth parameters of perennial ryegrass under different treatments

2.4 外源褪黑素處理和AM 共生條件下多年生黑麥草膜脂過氧化和抗氧化酶活性對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)

高溫脅迫下，與NM-NT 相比，AM-NT、NM-MT 和AM-MT 處理均顯著降低了根系MDA 含量和EL（P＜0.05），且AM-MT 的根系MDA 含量和EL 顯著低于其他處理（P＜0.05）。此外，在最適溫度條件下，NM-NT，NM-MT，AM-NT 和AM-MT 處理之間的根系MDA 含量和EL 無顯著差異（P＞0.05）（圖4A， B）。

圖4 不同處理下的多年生黑麥草膜脂過氧化指標(biāo)和抗氧化酶活性Fig.4 Indicators of membrane lipid peroxidation and antioxidant enzyme activity in perennial ryegrass under different treatments

最適溫度條件下，NM-NT，NM-MT，AM-NT 和AM-MT 處理之間的根系SOD、POD 和APX 活性無顯著差異（P＞0.05）（圖4C，D 和F），而與NM-NT 和NM-MT 處理相比，AM-NT 和AM-MT 處理顯著提高了根系CAT活性（P＜0.05）（圖4E）。熱脅迫條件下，與NM-NT 相比，NM-MT，AM-NT 和AM-MT 處理均顯著提高了根系SOD、POD、CAT 和APX 的活性（P＜0.05），其中AM-MT 處理下這4 種酶的活性最高。

2.5 外源褪黑素處理和AM 共生條件下多年生黑麥草PAL 和PPO 活性及其編碼基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)

最適溫度條件下，NM-NT，NM-MT，AM-NT 和AM-MT 處理之間的PAL 和PPO 活性，以及LpPAL和LpPPO的轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異（P＞0.05）。高溫脅迫下，與NM-NT 相比，AM-NT、NM-MT 和AM-MT 處理均顯著提高了根系PAL 活性和LpPAL基因的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05），且AM-MT 處理顯著高于其他處理（P＜0.05）（圖5A，B）。與NM-NT 相比，高溫脅迫下AM-NT 和AM-MT 處理均顯著降低了根系PPO 活性和LpPPO轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05），其中AM-MT 處理顯著低于其他處理（P＜0.05）（圖5C，D）。

圖5 不同處理下的多年生黑麥草PAL 和PPO 活性及其編碼基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 PAL and PPO activities and the transcription levels of their encoding genes in perennial ryegrass under different treatments

2.6 外源褪黑素處理和AM 共生條件下多年生黑麥草滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)

在最適溫度條件下，NM-NT，NM-MT，AM-NT 和AM-MT 處理之間的根系脯氨酸含量（圖6A）、P5CR 活性（圖6B）和LpP5CS轉(zhuǎn)錄水平（圖6C）無顯著差異（P＞0.05）。高溫脅迫下，與NM-NT 相比，NM-MT 和AM-MT處理均顯著提高了（P＜0.05）根系的脯氨酸含量、P5CR 活性和LpP5CS轉(zhuǎn)錄水平（圖6A～C），但NM-MT 與AM-MT 處理之間均無顯著差異（P＞0.05），且NM-MT 處理的根系脯氨酸含量顯著低于AM-NT 處理（P＜0.05）。高溫脅迫下，NM-MT 處理的根系類黃酮含量顯著高于AM-NT 和AM-MT 處理（P＜0.05）（圖7B），而NM-MT 和AM-NT 處理下的根系可溶性糖、總酚和甜菜堿含量則無顯著差異（P＞0.05），AM-MT 處理的根系可溶性糖、總酚和甜菜堿含量均顯著高于其他處理（P＜0.05）（圖7A，C 和E）。

圖6 不同處理下的多年生黑麥草脯氨酸含量、P5CR 活性和LpP5CS 轉(zhuǎn)錄水平Fig.6 Proline content， P5CR activity and LpP5CS transcript levels in perennial ryegrass under different treatments

圖7 不同處理下的多年生黑麥草滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量Fig.7 Content of osmoregulatory substances in perennial ryegrass under different treatments

2.7 主成分分析

為評(píng)價(jià)高溫脅迫下不同處理對(duì)多年生黑麥草根系抗氧化系統(tǒng)與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響，進(jìn)行了主成分分析，使用多年生黑麥草根系的抗氧化相關(guān)參數(shù)（MDA、EL、SOD、POD、CAT 和APX）和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)相關(guān)參數(shù)（脯氨酸、總酚、類黃酮、甜菜堿和可溶性糖含量，以及PAL 和PPO 活性）的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。每個(gè)點(diǎn)代表本試驗(yàn)中的一種處理類型，其中兩個(gè)主成分中PC1 占比77.2%，PC2占比16.4%，PC1 顯示CK（最適溫度）處理與HT（高溫）處理明顯分開，AM-MT-HT 處理與其他處理的差異最大（圖8）。

圖8 不同處理下的多年生黑麥草抗氧化與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)相關(guān)參數(shù)主成分分析Fig. 8 Principal component analysis of parameters related to antioxidant and osmoregulatory substances in perennial ryegrass under different treatments

3 討論

在非脅迫條件下，與擬南芥（Arabidopsis thaliana）等植物類似，多年生黑麥草含有較低和恒定量的褪黑素［33］，脅迫條件下褪黑素能夠通過植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)幫助植物應(yīng)對(duì)氧化損傷，發(fā)揮其內(nèi)源性抗氧化劑的作用［34］。本研究中高溫脅迫刺激了根系中褪黑素的積累，表明高溫脅迫下多年生黑麥草可能通過增加褪黑素的積累提高其抗氧化能力。AM 接種促進(jìn)了高溫脅迫下褪黑素的合成，這表明AM 植物在高溫脅迫下可以產(chǎn)生豐富的褪黑素，以應(yīng)對(duì)熱應(yīng)激導(dǎo)致的氧化損傷。Liu 等［35］觀察到脅迫條件下真菌Trichoderma asperellum中褪黑素的積累，說明微生物在非生物脅迫條件下參與褪黑素的積累。因此，AM 真菌產(chǎn)生的褪黑素可能有助于熱脅迫下多年生黑麥草根部褪黑素的積累。外源施用褪黑素或過表達(dá)褪黑素生物合成基因可提高植物內(nèi)源褪黑素含量，增強(qiáng)植物抗逆性［36］。植物體內(nèi)褪黑素合成首先通過TDC 和T5H 活性將色氨酸轉(zhuǎn)化為血清素。在轉(zhuǎn)基因水稻（Oryza sativa）種子中過表達(dá)OsTDC3導(dǎo)致褪黑素水平比野生型（wild type， WT）增加31 倍，進(jìn)而延遲轉(zhuǎn)基因水稻中暗誘導(dǎo)的葉片衰老［37］。SANT 催化5-羥色胺轉(zhuǎn)化為N-乙酰血清素，人類SNAT基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的異位表達(dá)除了表現(xiàn)出強(qiáng)耐寒性外，還表現(xiàn)出更高的內(nèi)源性褪黑素水平［38］。此外，COMT 將N-乙酰5-羥色胺甲基化為褪黑素，在轉(zhuǎn)基因水稻中過表達(dá)OsCOMT也顯著提高內(nèi)源褪黑素含量，抑制OsCOMT的表達(dá)導(dǎo)致褪黑素水平降低［39］。ASMT 是褪黑素合成中的末端酶，在褪黑素合成過程中起限速作用［40］。Fu 等［41］發(fā)現(xiàn)在干旱和低溫脅迫下多年生黑麥草通過上調(diào)LpASMT1和LpASMT3基因的轉(zhuǎn)錄水平，以增加內(nèi)源褪黑素的積累，進(jìn)而增強(qiáng)耐旱性和耐寒性。本研究發(fā)現(xiàn)外源MT 處理導(dǎo)致高溫脅迫下NM 和AM 多年生黑麥草內(nèi)源褪黑素含量顯著增加，與較高的褪黑素合成基因LpTDC1、LpT5H、LpSNAT、LpCOMT1、LpASMT1和LpASMT3的轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)。因此，褪黑素生物合成基因轉(zhuǎn)錄水平的提高和內(nèi)源褪黑素含量上升可提高多年生黑麥草的耐熱性。

熱脅迫顯著降低了Ri 在多年生黑麥草根系的定殖率。Wei 等［18］認(rèn)為非生物脅迫下AMF 在植物根中定殖率的下降與植物的光合作用下降有關(guān)，因?yàn)楣夂献饔孟陆禍p少了宿主植物對(duì)菌根真菌的碳分配。在對(duì)熱脅迫下生菜（Lactuca sativa）［42］和薰衣草（Lavandula angustifolia）［43］的菌根真菌定殖研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。褪黑素處理和AM 接種提高了高溫脅迫下多年生黑麥草的株高，地上和地下部分鮮重和干重，這是因?yàn)锳M 共生和褪黑素都能保護(hù)宿主植物的光合系統(tǒng)，提高在高溫脅迫下的光合速率，從而增加生物量，改善宿主植物對(duì)AMF 的碳分配并提高定殖率。

一般來說，在合適的生長(zhǎng)條件下，植物細(xì)胞中的ROS 水平處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，而非生物脅迫可以誘發(fā)過多的ROS 生成和膜脂過氧化，導(dǎo)致植物代謝功能失調(diào)［44］。細(xì)胞內(nèi)MDA 的產(chǎn)生是過多ROS 引起細(xì)胞膜脂過氧化的結(jié)果，EL（反映膜的完整性）和MDA 水平是評(píng)估植物氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)［45］。AM 接種和褪黑素處理均降低了EL 和MDA 水平，以保護(hù)多年生黑麥草免受氧化應(yīng)激。植物活性氧清除系統(tǒng)大多包含抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶，包括SOD、APX 和POD，SOD 催化O2-歧化為O2和H2O2，而CAT 和POD 則分別在葉綠體和細(xì)胞質(zhì)將H2O2降解為無毒害作用的水分子和氧氣，同時(shí)APX 參與抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)，催化抗壞血酸和H2O2反應(yīng)，從而協(xié)助清除植物體內(nèi)的H2O2［18，46］。因此，褪黑素和AM 共生對(duì)高溫耐受性的協(xié)同作用與減少氧化損傷和提高了抗氧化酶活性相關(guān)。

脯氨酸能調(diào)節(jié)氧化還原電位，保護(hù)大分子不被羥基自由基變性和清除，作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可提高細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，參與細(xì)胞代謝，維持膨壓，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的完整性，以維持正常的代謝活動(dòng)，從而降低非生物脅迫對(duì)植物細(xì)胞的傷害［47］。1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（1-pyrrolin-5-carboxylate synthetase， P5CS）和P5CR 是植物脯氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶［48］。Antoniou 等［49］發(fā)現(xiàn)褪黑素處理可以增加脯氨酸的積累以緩解干旱對(duì)紫花苜蓿（Medicago sativa）造成的損傷。也有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素處理通過上調(diào)MtP5CS基因的轉(zhuǎn)錄水平和增加P5CR 活性來增加脯氨酸含量，以提高菌根化蒺藜苜蓿的重金屬耐受性［21］。本研究結(jié)果與之相似，Ri 接種與褪黑素處理以及兩者的聯(lián)合，通過提高P5CR 活性和LpP5CS基因的轉(zhuǎn)錄水平，增加熱脅迫條件下多年生黑麥草根部脯氨酸含量，提高滲透調(diào)節(jié)能力，進(jìn)而提高植物的抗逆性。PAL 是苯丙烷代謝途徑的一種關(guān)鍵酶，植物體內(nèi)苯丙烷途徑的代謝產(chǎn)物包括多酚類、黃酮類和花青素，高溫會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)這些保護(hù)性小分子物質(zhì)的合成和積累，以緩解熱脅迫損傷［50］。Liang 等［51］認(rèn)為使用褪黑素可以通過提高SOD、CAT 和POD 活性，提高抗氧化能力，并通過促進(jìn)類黃酮生物合成緩解葉片衰老。褪黑素處理增強(qiáng)了獼猴桃（Actinidia chinensis）的PAL 活性，提高了耐寒性，表明了褪黑素在類黃酮合成中的潛在作用［52］。熱脅迫條件下PPO 通過苯酚氧化產(chǎn)生劇毒的醌類物質(zhì)，降低膜的完整性和抗氧化活性，導(dǎo)致膜脂過氧化［53］。氧化和聚合會(huì)對(duì)酚類物質(zhì)的特性產(chǎn)生不利影響，妨礙其清除ROS 的能力。接種Ri 和應(yīng)用外源褪黑素降低了PPO 活性和增強(qiáng)了PAL 活性，表明AM 接種和應(yīng)用褪黑素增加了酚類物質(zhì)的代謝，提高了多年生黑麥草的高溫耐受性。在涉及AMF 接種的植物生物相互作用過程中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)PAL 活性的增加，以及酚類物質(zhì)的積累。此外，上調(diào)的苯丙素途徑可能參與了宿主與AMF 之間信號(hào)傳遞，這可能是植物面對(duì)非生物脅迫的一種防御策略［54］。

可溶性總糖是草坪草細(xì)胞碳水化合物代謝中的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)組織、器官的構(gòu)建起重要作用，有利于增強(qiáng)草坪草的抗逆性，含量高低一般與植物抵抗逆境的能力呈正比［55］。甜菜堿是植物面對(duì)非生物脅迫時(shí)一種常見的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)，亦可作為滲透保護(hù)物質(zhì)提高生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，防止蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到其他物質(zhì)的破壞，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是在脅迫條件下，甜菜堿可以作為一種低分子量的伴侶分子起到對(duì)酶蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定作用，并使酶蛋白處于激活且有功能的狀態(tài)，增強(qiáng)酶的活力［56］。因此，可溶性總糖和甜菜堿含量的上升，可以有效激活多年生黑麥草的酶促防御系統(tǒng)，增強(qiáng)高溫脅迫下多年生黑麥草的抗氧化酶活性，進(jìn)而提高多年生黑麥草抵御高溫脅迫的能力。AM 接種與外源褪黑素均可以通過增加酚類物質(zhì)、脯氨酸和可溶性糖的含量，改善植物的滲透調(diào)節(jié)，提高多年生黑麥草的耐熱性。然而，AM 接種和褪黑素應(yīng)用對(duì)脯氨酸和類黃酮積累沒有協(xié)同作用，這表明AM 真菌和褪黑素的應(yīng)用對(duì)提高高溫耐受性有不同的作用。黃酮類化合物和脯氨酸的合成都受到水楊酸的調(diào)控［57-58］，褪黑素應(yīng)用［59］和AM 接種［60］對(duì)水楊酸調(diào)節(jié)的相反影響可能解釋了這一結(jié)果。而水楊酸代謝是否導(dǎo)致AM 共生和褪黑素之間的相互作用，以及褪黑素-植物激素相互作用對(duì)AM 植物的非生物脅迫抗性的影響，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

總而言之，高溫脅迫下褪黑素處理促進(jìn)了多年生黑麥草根部的AM 共生，且AM 接種與外源褪黑素處理可以通過上調(diào)多年生黑麥草根系中褪黑素合成基因的轉(zhuǎn)錄水平，提高內(nèi)源褪黑素的含量。AM 接種和褪黑素處理對(duì)多年生黑麥草的生長(zhǎng)和高溫耐受性有協(xié)同作用，這種協(xié)同作用可能與減輕氧化損傷，調(diào)控抗氧化酶活性，以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量有關(guān)。所以，AM 接種與褪黑素處理聯(lián)合應(yīng)用是幫助宿主植物應(yīng)對(duì)高溫環(huán)境的潛在有效策略。