高小俊，林 芳，楊沁之，陳 果 綜述 羅 茂 審校

1.西南醫(yī)科大學 藥學院（瀘州 646000）；2.西南醫(yī)科大學 藥物研究中心（瀘州 646000）；3.西南醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院（瀘州 646000）

膀胱癌是世界范圍內(nèi)常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，因膀胱癌早期無明顯癥狀難以診斷和易轉移、易復發(fā)的特點，其病因、診斷及治療已成為當前臨床研究關注的熱點。目前學術界致力于開發(fā)膀胱癌的有效檢測途徑，但限制于科學技術的發(fā)展，臨床上只能應用費用昂貴的膀胱鏡檢查和敏感性低的尿脫落細胞學檢測。臨床診斷的局限性使許多患者在診斷出病癥時癌細胞早已發(fā)生轉移，因而患者不能及時接受治療或接受不到充分治療。當前研究表明，膀胱癌的發(fā)生、侵襲和轉移是多基因及相關分子共同參與所致，此過程涉及多種相關癌基因、抑癌基因、信號通路的關鍵蛋白[1]。因此，從分子水平上識別膀胱癌的病因和病程已成為當前膀胱癌臨床治療的關鍵。

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類內(nèi)源性的小分子非編碼RNA，可于轉錄后調(diào)節(jié)目標基因。miRNAs主要來自編碼基因的內(nèi)含子或非編碼基因，通過結合靶mRNAs 的3’端非編碼區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)起到抑制mRNAs 表達和影響其翻譯途徑的作用[2]。近來，鑒于miRNAs 在細胞生物學過程中的調(diào)控，部分研究揭示了miRNAs對腫瘤細胞轉移過程的直接調(diào)控作用及在癌癥發(fā)展中間接發(fā)揮原癌基因或抑癌基因作用[3]。此外，分子生物學研究指出miRNAs 積極參與膀胱癌病程，提示miRNAs有望單獨或聯(lián)合成為膀胱癌潛在的診斷標志物和治療靶點[4]。本文對miRNAs在膀胱癌中的分子靶基因研究進展進行綜述，揭示膀胱癌中miRNAs參與的基因表達調(diào)控機制，并探討體液檢測miRNAs 診斷膀胱癌的可能性，為miRNAs 作為膀胱癌臨床診斷及治療標志物提供了新的思路。

1 膀胱癌miRNAs的靶點研究

從分子機制上揭示膀胱癌的進展已成為當前臨床研究關注的熱點[5]。例如，在miR-143對膀胱癌的研究中，miR-143 通過與Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog，K-RAS）基因的3′-UTR結合而調(diào)控RAS的表達，而RAS被證實是腫瘤中的癌基因[6]。此外，對miR-24的各種研究表明，miR-24-1-叉頭盒M1(forkhead box protein M1，F(xiàn)OXM1)軸的功能與膀胱癌中癌細胞的增殖有關，下游信號轉導可能導致膀胱癌發(fā)生過程中未知的分子機制[7]。miR-24 除通過影響半胱天冬酶募集結構域的膜相關鳥苷酸激酶蛋白（caspase recruitment domain and membrane-associated guanylate kinase-like protein 3，CARMA3)下調(diào)，抑制膀胱癌細胞的侵襲、增殖和上皮間質(zhì)轉化（epithelial to mesenchy-mal transition，EMT）外，還通過抑制死亡效應域蛋白（death effector domain containing Drotein，DEDD），改善膀胱癌[8]。

此前，許多研究已經(jīng)揭示miR-130 家族在膀胱癌中發(fā)揮重要調(diào)控作用，充當腫瘤miRNAs。例如，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶N1（protein tyrosine phosphatase nonreceptor type 1，PTPN1）與miR-130 家族靶基因受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）下游多個信號通路的負調(diào)節(jié)因子有關，而PTPN1 敲低可導致膀胱癌細胞中腫瘤特性（細胞生長、侵襲和遷移）增加和Src在酪氨酸416位點磷酸化表達增加[9]。MiR-130還通過調(diào)節(jié)促進膀胱癌細胞自噬，從而促進腫瘤細胞增殖。此外，miR-130a-3p 對轉化生長因子β 受體1（transforming growth factor beta receptor 1，TGFBR1）基因的3′-UTR 區(qū)域具有抑制作用，而TGFBR1 表達增強會上調(diào)TGF-β/SMAD3信號，進而血管內(nèi)皮生長因子D生成增多，以促進膀胱癌淋巴管的生成與轉移[10-11]。另有研究表明，T 盒轉錄因子3（t-box transcription factor 3，TBX3）是miR-143-3p 的靶基因，而TBX3 表達的下調(diào)會抑制膀胱癌腫瘤的增殖、遷移、侵襲和EMT[12]。MiR-143-3p 還可以靶向蛋白質(zhì)-L-異天冬氨酸（D-天冬氨酸) -甲基轉移酶（protein-l-Isoaspartate (DAspartate)o-methyltransferase，PCMT1）基因參與調(diào)控膀胱癌TCCSUP 或SW780 細胞的增殖、遷移和凋亡[13]。因此，通過識別miR-143-3p/TBX3 和miR-143-3p/PCMT1 軸設定的新的分子通路和目標，可能有助于更好地理解膀胱癌的進展和侵襲。

MiR-182-5p 在膀胱癌中通過幾種途徑促進癌細胞增殖、遷移和侵襲起到原癌基因的作用。ZHANG等[14]發(fā)現(xiàn)miR-182-5p 通過下調(diào)叉頭盒F2（forkhead box F2，F(xiàn)OXF2）和激活音猬因子(sonic hedgehog，SHH)通路增強膀胱癌細胞的增殖和遷移。此外，另一項研究顯示，miR-182-5p可以靶向調(diào)控p27蛋白，而p27蛋白的誘導與膀胱癌細胞增殖有關[15]。部分研究顯示，miR-200a-3p通過靶向腫瘤壞死因子α誘導蛋白3（tumor necrosis factor，alpha-induced protein 3，TNFAIP3 A20 和（STMN1）基因作為人類膀胱癌的致癌基因。進一步研究發(fā)現(xiàn)，A20與膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲、細胞周期和炎性細胞因子的釋放有關；STMN1與EMT的進程有關。因此，STMN1 和A20 可能作為膀胱癌的新治療靶點。此外，miR-200b-3p 和miR-200c-3p 通過靶向增強E 盒結合鋅指蛋白1(zinc finger e-box binding homeobox 1，ZEB1)表達促進間充質(zhì)表型，加速膀胱癌的侵襲和轉移。而miR-200c則通過下調(diào)多梳基因（ploycomb group genes，PcG）家族中的BMI-I 基因控制膀胱癌細胞的EMT 過程，并通過下調(diào)E2F3 抑制膀胱癌增殖。同時，有研究指出miR-141 與miR-429 在膀胱尿路上皮細胞癌的EMT中起重要作用[16-21]。這些數(shù)據(jù)表明，miR-200 家族在膀胱癌的進程中既有抑癌基因功能又發(fā)揮癌基因作用。

膀胱癌中，miR-34a 也通過靶向多個基因起到抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用。例如，直接靶向CD44 蛋白，可以有效地防止腫瘤的相關轉移；降低肝細胞核因子4γ（hepatocyte nuclear factor 4 gamma，HNF4G）的表達來阻止腫瘤細胞的存活、定植和侵襲；影響缺口受體1(notch receptor 1，Notch 1)信號轉導間接下調(diào)癌細胞的遷移和侵襲。此外，有研究表明，miR-34a 濃度升高會導致其靶基因高爾基磷蛋白3（golgi phosphoprotein 3，GOLPH3）的過度表達。進一步研究顯示，miR-34a/GOLPH3 軸在腫瘤干細胞中起重要作用，可能是治療耐藥尿路上皮性膀胱癌的一種途徑。MiR-34a 能夠直接調(diào)節(jié)轉錄因子T 細胞因子1（tcell factor 1，TCF1）/淋巴增強結合因子1(lymphoid enhancer binding factor 1，LEF1)軸參與調(diào)控膀胱癌的轉移和化療耐藥，據(jù)此本文推測miR-34a和TCF1/LEF1軸的調(diào)節(jié)可能成為治療化療增敏耐藥膀胱癌的新策略。值得注意的是，另一項研究揭示miR-34a作為miRNAs的抑制因子影響miR-34a/TCF1/LEF1 軸，并在膀胱癌細胞的存活中發(fā)揮重要作用。這些數(shù)據(jù)揭示miR-34a能夠通過特殊靶向以增強藥物敏感性對耐藥膀胱癌起到治療效果[22-25]。

2 膀胱癌miRNAs的臨床作用

2.1 促進/抑制癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡

膀胱癌中miRNAs 表達情況存在較大差異，且它們通過調(diào)控靶基因的表達進而參與膀胱癌的發(fā)展。例如，miR-1、miR-99a、miR-100 和miR-200 家族在膀胱癌中表達下調(diào)[26-29]；而miR-21 和miR-210 呈現(xiàn)為上調(diào)[30-31]。進一步研究顯示，這些miRNAs可調(diào)控某些細胞的生長、凋亡、死亡程序以及部分癌細胞下游的信號通路。此外，許多miRNAs已經(jīng)被證實與膀胱癌細胞的進展和轉移有關。如miR-133a、miR-30-3p 和miR-199a通過調(diào)節(jié)角蛋白7(keratin 7，KRTT)活性參與膀胱癌生長的調(diào)控[32-33]。膀胱癌中相關miRNAs 對其靶基因的調(diào)控，見圖1。

圖1 膀胱癌中相關miRNAs對其靶基因的調(diào)控Figure 1 Regulation of related miRNAs in bladder cancer and their target genes

作為腫瘤抑制因子，影響細胞生理活性的miRNAs包括miR-143-3p、miR-218、miR-325-3p 和miR-let-7c-5p，它們分別通過調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶抑制劑家族E成員1（serpin family emember 1，SERPINE1）、RAS 癌基因家族成員RAB6C、金屬硫蛋白3（metallothionein 3，MT3）和高機動性組AT-hook 2（high mobility group AThook 2，HMGA2）基因而發(fā)揮作用[34-37]。此外，miR-101、miR-20a 等癌基因分別通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factor，VEGFC)、人源性長壽保障基因2(homo sapiens longevity assurancehomologue 2 of yeast LAG1，LASS2)在膀胱癌中發(fā)揮調(diào)控作用[38-39]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-3p 通過結合叉頭盒Q1（forkhead box Q1，F(xiàn)OXQ1)的3′-UTR 區(qū)域抑制其表達，而FOXQ1 可以促進膀胱癌細胞增殖和侵襲；進一步研究顯示，miR-140-3p在體外和體內(nèi)均下調(diào)FOXQ1的表達，從而發(fā)揮對膀胱癌細胞的抗增殖和抗侵襲作用[40]。CHEN Y等[41]發(fā)現(xiàn)miR-769-5p在膀胱癌細胞和組織中表達相對較低，其與核仁和紡錘體相關蛋白1（nucleolar and spindle associated protein 1，NUSAP1）的3′-UTR 結合從而抑制NUSAP1 表達，與預后不良密切相關。NUSAP1的過表達挽救了miR-769-5p介導的細胞凋亡、鈣黏蛋白E 和B 淋巴細胞瘤-2(b-cell lymphoma-2，BCL2)相關X 蛋白（BCL2-associated X protein，Bax）表達的促進作用，以及對細胞生長、遷移、侵襲、鈣黏蛋白N 和BCL2 表達的抑制，表明miR-769-5p通過靶向NUSAP1 抑制膀胱癌得發(fā)生。miR-616 是最近發(fā)現(xiàn)的促進癌癥發(fā)生和發(fā)展的miRNAs，包括miR-616-5p 和miR-616-3p。miR-616-5p 在膀胱癌中表達上調(diào)，通過與核受體亞家族2C組成員2（nuclear receptor subfamily 2 group c member 2，NR2C2）的3′-UTR 結合以抑制NR2C2表達，達到誘導膀胱癌惡化的作用[42]。此外，miR-1290作為腫瘤促進劑在膀胱癌細胞和組織中顯著過表達，進一步研究顯示，miR-1290 可以與細胞分裂周期73基因（cell division cycle 73，CDC73）的3?-UTR 結合抑制其表達。值得注意的是，CDC73 起腫瘤抑制因子的作用，可抑制集落形成和細胞增殖，并使細胞周期暫停于G1 期，表明miR-1290 在癌細胞生長和增殖中起到關鍵作用[43]?？傊?，miRNAs作為癌基因或抑癌基因參與著膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展。

2.2 外泌體介導的miRNAs調(diào)控膀胱癌進展

外泌體是細胞外囊泡的一個子集，直徑小于150 nm，可以運輸多種生物活性分子，例如非編碼RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等，被認為是細胞間通訊的重要手段[44]。外泌體包裹的miRNAs 已被確定為致癌過程中的潛在癌癥生物標志物和促腫瘤發(fā)生介質(zhì)。迄今為止，許多研究都強調(diào)了miRNAs 在膀胱癌診斷和進展中的重要作用[45]。

miR-4644 在膀胱癌患者血漿外泌體樣本中表達上調(diào)。進一步研究顯示，miR-4644通過直接結合UbiA異戊烯基轉移酶結構域1(ubiA prenyltransferase domain containing 1，UBIAD1)的3′-UTR 區(qū)域?qū)ζ溥M行負調(diào)控。而UBIAD1的過表達有效地消除了miR-4644對膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用[46]。此外，在膀胱癌中，外泌體介導的miR-4792會降低叉頭盒C1（forkhead box protein C1，F(xiàn)OXC1）和細胞-髓細胞瘤病病毒性癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）的表達水平，延緩細胞生長，并減少Warburg 效應和乳酸含量。FOXC1下調(diào)的膀胱癌細胞在體內(nèi)明顯形成更小的腫瘤。C-Myc 的抑制可逆轉FOXC1 過表達的影響。這些數(shù)據(jù)共同支持外泌體介導的miRNAs 可通過多種途徑參與調(diào)控膀胱癌的進程，突出了一種新穎的治療策略[47]。

2.3 對抗癌藥物耐藥性的調(diào)節(jié)

膀胱腫瘤的抗癌治療有很多種，包括放射治療、化療和手術，其中化療是近年來一種廣泛用于治療各種癌癥的策略。比較常見的化療藥物包括烷化劑（尼莫司?。?、抗代謝藥（去氧氟鳥苷）、抗腫瘤抗生素（放線菌素D）和順鉑等。順鉑是目前治療膀胱癌常用的化療藥物。然而，膀胱癌細胞通常具有逃避順鉑誘導的細胞凋亡的機制。膀胱癌細胞通常過表達抗凋亡蛋白來對抗順鉑誘導的細胞死亡，這是膀胱癌細胞抗凋亡的重要策略之一。值得注意的是，有研究證實miRNAs的失調(diào)與膀胱癌對順鉑的耐藥性有關[48]。

LI 等[49]發(fā)現(xiàn)順鉑耐藥的膀胱癌細胞中過表達miR-325 可增加順鉑對其細胞毒作用，但轉染HCLS1相關蛋白X-1（HCLS1 associated protein X-1，HAX-1）質(zhì)?？上齧iR-325 對順鉑的作用。進一步研究顯示，順鉑誘導的細胞凋亡過程中，miR-325 靶向抑制HAX-1，促進線粒體崩潰，繼而釋放細胞色素C，激活半胱氨酸天冬氨酸酶（cysteinyl aspartate-specific proteinases，caspases）-3/7/9。最后，miR-325 的恢復使耐順鉑的膀胱癌細胞對順鉑誘導的凋亡再敏感。因此，miR-325促進了順鉑誘導的膀胱癌細胞線粒體崩潰和凋亡，降低膀胱癌對鉑類化療藥物的耐藥性。另一項研究中，SALIMIAN 等[50]發(fā)現(xiàn)，miR-486-5p 模擬物與順鉑的結合能夠下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、CD44 和Rho 相關激酶（Rho associated coiled-coil containing protein kinase 1，ROCK）基因來抑制膀胱癌細胞的遷移和轉移能力。進一步研究顯示，miR-486-5p與順鉑聯(lián)合應用能顯著促進膀胱癌細胞的凋亡，其作用機制是阻滯細胞周期的亞G1 期，激活caspase-3/9和p53，下調(diào)抗凋亡基因BCL2、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）、嗅覺調(diào)節(jié)素4（olfactomedin 4，OLFM4）和SMAD 家族成員2（SMAD family member 2，SMAD2）基因的表達。這些結果表明miR-486-5p 在肌肉浸潤性膀胱癌細胞中可能具有抗轉移作用。此外，miR-101 靶向環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）間接調(diào)節(jié)膀胱癌細胞對順鉑的耐藥性，進一步改善膀胱癌患者的治療情況[51]。

2.4 其他調(diào)控方式

miRNAs 還參與調(diào)控膀胱癌的其他進程。例如，MINAMI 等[52]發(fā)現(xiàn)miR-145 的異位表達通過抑制膀胱癌患者中上調(diào)的KLF轉錄因子4（KLF transcription factor 4，KLF4）來調(diào)控聚嘧啶束結合蛋白1（polypyrimidine tract binding protein 1，PTBP1）/肌肉型丙酮酸激酶M1 型（pyruvate kinase，muscle，PKM1）1/PKM 2 軸，進而調(diào)節(jié)War-burg 效應，起到抗腫瘤作用。另外，ZHAO W 等[53]發(fā)現(xiàn)，過表達的miR-3122 會阻斷膀胱癌T24、BIU-87 和EJ-1 細胞中的組蛋白H3K79me3 全基因組效應，從而調(diào)控膀胱癌進展。這些研究結果也表明單個或多個miRNAs 為膀胱癌的臨床診治提供了一個新的方向。

3 miRNAs作為膀胱癌診斷、預后和治療標記物的研究

藥物基因組學研究中，癌癥治愈情況的個體差異是由于藥物-miRNAs之間特殊作用造成。例如，LI MP等[54]發(fā)現(xiàn)的膀胱癌患者對順鉑耐藥性的降低跟AP-2α基因中的SNP位點(rs1045385)A替換為C有關，而這是患者體內(nèi)miR-200 與其靶基因相互作用引起。所以，這種特殊作用可以看作是細胞中與癌癥相關的miRNAs 的抑制劑或激動劑，它在癌癥發(fā)展過程中可導致不同細胞呈現(xiàn)增殖或凋亡趨勢。近年來新方法的發(fā)展，使生物樣品中少量miRNAs 的檢測成為可能，也為篩選出miRNAs作為膀胱癌診斷、預后和治療的生物標志物提供了可能。例如，最近為篩查早期膀胱瘤開發(fā)出檢測尿液中miRNAs 的技術。體液是miRNAs 的主要來源，提示可通過對尿液和血液等體液中miRNAs水平的變化進行臨床診斷和預測膀胱癌[55]。例如，PARIZI 等[56]整理膀胱癌患者腫瘤樣本、尿液和血液樣本中一般miRNAs 或特定miRNAs 表達變化的研究發(fā)現(xiàn)，與癌癥相關的miRNAs 表達譜與正常人有顯著差異。進一步研究顯示，在所有整理的miRNAs中，miR-1、miR-99a、miR-100 和miR-143 在所有組織、血液和尿樣中表達降低，相反，只有miR-21 和miR-210 在所有三個樣本中都表達增加。此外，最近KUTWIN P等[57]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者尿液和血清樣本中miR-106b-3p、miR-199a-5p 和miR-145-3p 的相對表達水平之間存在相關性；并且尿液和血清結果之間存在差異，尿液中所得數(shù)據(jù)比血清中數(shù)據(jù)更有說服力。更重要的是，miRNAs 作為癌癥診斷的平均靈敏度和特異性分別達到近70%和80%，這些結果表明miRNAs可以作為有用的診斷標記物。

如今，不同的miRNAs對膀胱癌的預后有一定的影響，生物流感病毒中miRNAs的存在更是被認為是一種具有高度敏感性和特異性的重要生物標志物[58]。例如，miR-200、miR-145、miR-214和miR-211-5p都是被當前眾多研究認可的判斷膀胱癌預后的重要指標[4]。同時，隨著miRNAs 表達檢測技術的發(fā)展，對在膀胱癌中表達異常的miRNAs有了更深的認識。例如，蔣貝爾等[59]研發(fā)出一種膀胱癌診斷用尿液miRNAs試劑盒，可通過檢測尿液中miR-143-3p、miR-183-5p、miR-21-3p、miR-219a-5p、miR-1-3p 和miR-18a-3p 的一種或多種組合，達到診斷是否患有膀胱癌的目的。這大大提高了膀胱癌的早期發(fā)現(xiàn)率，為膀胱癌患者的治愈贏得了寶貴時間。另外，對一些miRNAs參與膀胱癌進程的機制研究更為透徹。例如，miR-101 可以負調(diào)控細胞間質(zhì)上皮轉換因子（cellular-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met）基因，進而miR-101已經(jīng)被當作是新的T24細胞侵襲和遷移抑制劑。衰老導致的miR-34a 在膀胱癌中表達的更新部分是源自細胞分裂蛋白激酶6（cyclin dependent kinase 6，CDK6）的靶向作用[60-61]?？傊?，miRNAs 在膀胱癌進程中扮演重要角色，但對于未來膀胱癌治療中可能面臨的各種挑戰(zhàn)，仍然需要更精確、靈敏性更高的技術方法來重點檢測miRNAs 作為膀胱癌診斷、預后和治療的重要生物標志物。

4 小結與展望

本綜述歸納了特異性差異表達miRNAs 與其靶基因之間的調(diào)控關系，進一步闡明這些miRNAs可作為膀胱癌臨床早期篩查、診斷、預后和治療標記物。本研究還探討了有望通過對體液中一種或多種微量miRNAs進行檢測而達到診斷膀胱癌的可能，揭示近年來火熱的外泌體miRNAs 途徑對膀胱癌的顯著療效和闡述部分miRNAs對膀胱癌耐藥性的調(diào)節(jié)。

大量關于膀胱癌與miRNAs 關系的研究已基本揭示出miRNAs在膀胱癌發(fā)病機制中所起到的重要作用，但仍有部分問題急需進一步解決，如怎樣在全基因水平大規(guī)模篩選鑒定可能的膀胱癌miRNAs生物標志物；膀胱癌miRNAs 的異常表達及功能發(fā)揮具體受哪些因子調(diào)控；膀胱癌miRNAs經(jīng)釋放進入循環(huán)血液后涉及怎樣的基因表達調(diào)控機制及作用途徑；如何建立適宜的臨床應用膀胱癌miRNAs 標準化檢測體系等。相信隨著對miRNAs 研究不斷深入，更好地了解miRNAs 在膀胱癌中的作用機制、信號級聯(lián)和靶分子將使我們能夠開發(fā)有效的治療和預防疾病的藥物。此外，及早檢測miRNAs 使我們能夠為健康個體開發(fā)新的篩查和實驗室測試。