張燕軍，李潔麗 綜述 張 凱 審校

西南醫(yī)科大學(xué)：1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 化學(xué)教研室；2.藥學(xué)院(瀘州 646000)

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一類高活性的含氧物質(zhì)，在細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、免疫、信號(hào)傳遞等過程發(fā)揮著重要的作用[1]。過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）是人體內(nèi)ROS 的重要組成部分，它主要來源于細(xì)胞線粒體，經(jīng)線粒體傳遞鏈（electron transport chain，ETC）復(fù)合體等途徑產(chǎn)生[2-3]。H2O2對(duì)細(xì)胞具有雙重的生理作用：適量的H2O2有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和維持[4-5]；而過量的H2O2會(huì)引起細(xì)胞的損傷、凋亡和自噬，從而誘發(fā)炎癥、心腦血管疾病、老年癡呆（senile dementia，SD）和癌癥等多種疾病[6-8]。因此，精確識(shí)別和檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2O2對(duì)生命科學(xué)研究和臨床診斷都具有非常重要的意義。

針對(duì)H2O2常見的檢測(cè)方法主要有：比色法[9]、電化學(xué)法[10]、質(zhì)譜分析法[11]和熒光分析法[12]等。其中，基于小分子熒光探針的熒光分析法由于具有操作簡(jiǎn)單、生物相容度高、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、可實(shí)時(shí)原位檢測(cè)等特點(diǎn)而備受關(guān)注；將熒光分析法與激光共聚焦顯微鏡技術(shù)結(jié)合而產(chǎn)生的熒光成像技術(shù)，也成為生物分析、檢測(cè)的重要手段，應(yīng)用于生物學(xué)研究、疾病早期診斷和臨床治療評(píng)價(jià)等領(lǐng)域[13-14]。近年來針對(duì)H2O2熒光檢測(cè)和成像的研究已成為有機(jī)小分子探針發(fā)展的重要方向，本文將從小分子熒光探針的響應(yīng)機(jī)理進(jìn)行歸納總結(jié)，介紹H2O2熒光探針的設(shè)計(jì)、構(gòu)建及生物應(yīng)用，并展望其發(fā)展方向和應(yīng)用前景。

1 H2O2熒光探針類型

H2O2熒光探針主要包括納米熒光探針及有機(jī)小分子熒光探針。小分子熒光探針由于具有純化簡(jiǎn)便、結(jié)構(gòu)明確、便于調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)，是熒光探針發(fā)展的重要方向。通常，小分子H2O2熒光探針依靠探針分子的識(shí)別位點(diǎn)與H2O2反應(yīng)，發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，放出相應(yīng)的熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2的熒光檢測(cè)。熒光探針對(duì)H2O2的響應(yīng)大多是通過氧化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，主要反應(yīng)類型有：硼酸酯的氧化、氧鎓離子的氧化、α-二羰基化合物的氧化、Payne/Dakin串聯(lián)反應(yīng)和芳基磺酸酯的過氧水解等。

1.1 硼酸酯氧化型H2O2熒光探針

在溫和的條件下，硼酸酯可以與H2O2發(fā)生反應(yīng)。基于這一特性，有大量的H2O2熒光探針被設(shè)計(jì)合成出來并應(yīng)用于體內(nèi)/外H2O2的熒光檢測(cè)與成像。LIN 小組[15]以咔唑?yàn)榛緹晒饽负?，合成了具有長(zhǎng)波長(zhǎng)發(fā)射性能的咔唑乙烯基吡啶鹽，并以硼酸酯作為識(shí)別基團(tuán)，構(gòu)建了H2O2熒光探針CAI（圖1）。相較于咔唑，CAI具有更長(zhǎng)的發(fā)生波長(zhǎng)（575 nm），更長(zhǎng)的Stocks 位移（157 nm），可有效避免熒光自吸收現(xiàn)象，提高探針的靈敏度。CAI 在H2O2的作用下，硼酸酯水解，釋放出酚羥基，導(dǎo)致熒光信號(hào)發(fā)生變化；由于吡啶鹽帶有正電荷，結(jié)合線粒體的質(zhì)子泵作用，該探針分子還能靶向進(jìn)入到細(xì)胞線粒體內(nèi)[16]，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞線粒體內(nèi)H2O2的熒光檢測(cè)。但是由于該探針屬于關(guān)型，很容易受到背景干擾，這就限制了CAI在H2O2檢測(cè)方面的應(yīng)用。

圖1 H2O2熒光探針CAI的結(jié)構(gòu)和響應(yīng)機(jī)理Figure 1 The structure of CAI and its response mechanism to H2O2

由于4-（二氰基亞甲基）-2-甲基-6-（4-二甲基氨基苯乙烯）-4H-吡喃（[2-[2-[4-（Dimethylamino）phenyl]ethenyl] -6-methyl-4H-pyran-4-ylidene]propanedinitrile，DCM）類染料發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)、光穩(wěn)定性好，被廣泛應(yīng)用于熒光探針的設(shè)計(jì)和構(gòu)建中[17-21]。GAO等[22]以近紅外熒光染料DCM作為熒光母體，芐基作為可自脫落連接臂，硼酸酯作為識(shí)別基團(tuán)構(gòu)建了基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（intramolecular charge transfer，ICT）增強(qiáng)的近紅外熒光探針DCM-HNU（圖2），用于H2O2的熒光檢測(cè)和成像。DCM-HNU 的發(fā)射在近紅外區(qū)域（658 nm），可有效降低光生物熒光和光散射帶來的背景干擾，且具有光毒性小、穿透性好的特點(diǎn)；Stocks 位移達(dá)205 nm，進(jìn)一步避免了熒光自吸收現(xiàn)象，更有利于生物熒光檢測(cè)。進(jìn)一步的溶液實(shí)驗(yàn)證明，在pH=7.4 的緩沖體系中，DCM-HNU 對(duì)H2O2的響應(yīng)具有非常好的選擇性和穩(wěn)定性；在0～200 μM 濃度的緩沖溶液（pH=7.4）中，DCM-HNU 對(duì)H2O2的響應(yīng)表現(xiàn)出優(yōu)良線性關(guān)系，檢測(cè)限達(dá)到了0.17 μM。在此基礎(chǔ)上，研究者將DCM-HNU應(yīng)用于Hela 細(xì)胞及斑馬魚體內(nèi)H2O2的熒光檢測(cè)和成像，結(jié)果表明，DCM-HNU對(duì)內(nèi)源性和外源性的H2O2都具有非常好的響應(yīng)。

圖2 近紅外熒光探針DCM-HNU的結(jié)構(gòu)和響應(yīng)機(jī)理Figure 2 The structure of DCM-HNU and its response mechanism to H2O2

由于雙光子熒光成像具有激發(fā)波長(zhǎng)長(zhǎng)、穿透性好、生物毒性小、空間分辨率高、可實(shí)時(shí)暗場(chǎng)成像等優(yōu)點(diǎn)，已成為生物熒光成像的重要研究領(lǐng)域[23-25]。LI 等[26]以DCM 作為熒光單元，硼酯作為識(shí)別基團(tuán)，構(gòu)建針對(duì)H2O2的近紅外熒光探針TPNR-H2O2（圖3），進(jìn)行生物體內(nèi)H2O2的雙光子熒光成像。通過雙光子激發(fā)、TPNR-H2O2與H2O2反應(yīng)后，可在近紅外激發(fā)（860 nm）、近紅外發(fā)射（573～ 630 nm），有效避免了生物熒光干擾。溶液中的熒光檢測(cè)表明，TPNR-H2O2對(duì)H2O2的檢測(cè)限達(dá)72.48 nm，可以用來檢測(cè)低濃度的H2O2。MTT 實(shí)驗(yàn)證實(shí)探針具有較低的生物毒性后，作者將TPNR-H2O2與細(xì)胞內(nèi)源性H2O2的雙光子熒光成像，并通過長(zhǎng)時(shí)間激光激發(fā)的方式考察探針的光穩(wěn)定性，TPNR-H2O2在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出非常好的光穩(wěn)定性，可用于細(xì)胞內(nèi)H2O2的長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

圖3 近紅外熒光探針TPNR-H2O2的結(jié)構(gòu)和響應(yīng)機(jī)理Figure 3 The structure of TPNR-H2O2 and its response mechanism to H2O2

由于H2O2在腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展過程起著非常重要的作用，因此，發(fā)展具有腫瘤組織靶向能力的熒光探針鑒別腫瘤組織，對(duì)癌癥的早期診斷具有重大意義[27-28]。ZHU 小組[29]以萘酰亞胺作為熒光基團(tuán)，硼酸作為識(shí)別基團(tuán)，褪黑素作為腫瘤靶向基團(tuán)構(gòu)建H2O2熒光探針NH-MT（圖4）。實(shí)驗(yàn)證明，NH-MT 具有較好的水溶性，在pH=7.4的緩沖溶液中可與H2O2發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而在550 nm釋放出強(qiáng)的熒光信號(hào)。作者進(jìn)行了MTT（3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide）實(shí)驗(yàn)，證實(shí)探針具有較低的生物毒性；進(jìn)一步的生物熒光成像實(shí)驗(yàn)表明，NH-MT不僅可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞及斑馬魚體內(nèi)H2O2的熒光成像，還能有效識(shí)別腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，為腫瘤的早期診斷提供成像依據(jù)。

圖4 H2O2熒光探針NH-MT的結(jié)構(gòu)和響應(yīng)機(jī)理Figure 4 The structure of NH-MT and its response mechanism to H2O2

LI 課題組[30]設(shè)計(jì)構(gòu)建了喹啉鹽-氧雜蒽型的近紅外熒光染料QX-OH（圖5），該染料的發(fā)射波長(zhǎng)達(dá)772 nm。又以QX-OH 為熒光基團(tuán)，構(gòu)建熒光探針QX-B。在生理?xiàng)l件下，隨著H2O2的加入，QX-B 被H2O2氧化，脫去硼酯和亞甲基酚，形成酚的結(jié)構(gòu)，使ICT 增強(qiáng)，進(jìn)而引起光信號(hào)的變化：溶液在585 nm 處的吸收明顯降低，又在725 nm 形成一個(gè)新的吸收峰，同時(shí)在772 nm處的發(fā)射也隨之增強(qiáng)。H2O2滴定實(shí)驗(yàn)證明，在0.5～50 μM 濃度范圍內(nèi)，探針在772 nm 處的熒光強(qiáng)度與H2O2的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.17 μM，具有定量檢測(cè)H2O2的潛力。進(jìn)一步的干擾實(shí)驗(yàn)證明生物體系內(nèi)常見的干擾離子、氨基酸和活性氧均不會(huì)與QX-B發(fā)生反應(yīng)，證明QX-B 具有良好的選擇性。作者還采用核磁滴定和理論計(jì)算的方法，研究證實(shí)了QX-B 對(duì)H2O2響應(yīng)的ICT 增強(qiáng)機(jī)制。MTT 實(shí)驗(yàn)證明QX-B 具有較低的細(xì)胞毒性，進(jìn)一步細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)表明，QX-B 可以檢測(cè)內(nèi)源性和外源性的H2O2，其成像熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)的H2O2濃度相關(guān)。最后，QX-B 還被用于斑馬魚和糖尿病小鼠模型的熒光成像。斑馬魚實(shí)驗(yàn)證明，QX-B 可以對(duì)生物體內(nèi)的H2O2進(jìn)行熒光監(jiān)測(cè)。糖尿病小鼠實(shí)驗(yàn)表明，小鼠體內(nèi)H2O2表達(dá)水平與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在糖尿病引發(fā)的氧化應(yīng)激過程中，H2O2主要富集在肝臟和腎臟，且對(duì)腎臟的損傷明顯，這就為進(jìn)一步探究熒光探針在糖尿病早期診斷和預(yù)防中的應(yīng)用提供了可能性。

圖5 近紅外熒光探針QX-B的響應(yīng)機(jī)理和成像研究Figure 5 The structure and response mechanism of QX-B to H2O2

線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的主要場(chǎng)所，也是次氯酸、ATP等生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生場(chǎng)所，這些活性物質(zhì)在細(xì)胞微環(huán)境下共同作用，參與線粒體的各項(xiàng)生理活動(dòng)[31-34]。因此，開發(fā)能夠同時(shí)檢測(cè)線粒體內(nèi)多種活性物質(zhì)及微環(huán)境狀態(tài)的熒光探針對(duì)研究線粒體生理功能和相關(guān)的生物化學(xué)過程具有實(shí)際意義[35-37]。TIAN課題組[38]以羅丹明和萘酰亞胺為熒光母體，構(gòu)建熒光探針TFP（圖6），可通過雙光道熒光成像同時(shí)檢測(cè)線粒體內(nèi)H2O2和ATP 的表達(dá)水平。萘亞酰胺一側(cè)為H2O2響應(yīng)單元，當(dāng)向探針溶液中加入H2O2時(shí)，硼酸酯發(fā)生水解，紫外吸收從410 nm 藍(lán)移至380 nm，且吸光度急劇降低；而雙光子吸收截面（λex=710 nm）則從（7±2）GM升高到（35 ± 5）GM，導(dǎo)致470 nm 的熒光強(qiáng)度顯著升高，同時(shí)伴隨熒光壽命的提高，反應(yīng)在8 min 后達(dá)到平衡；H2O2滴定實(shí)驗(yàn)表明，在0.4～10 μM 范圍內(nèi)，470 nm的熒光強(qiáng)度與過氧化氫呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限在（68 ± 5）nM。羅丹明一側(cè)為ATP 響應(yīng)單元，ATP 可與分子中的乙二胺單元通過氫鍵相互作用，打開螺環(huán)，形成開環(huán)的氧雜蒽結(jié)構(gòu)，釋放出熒光信號(hào)。向TFP 溶液中加入ATP 后，在562 nm 出現(xiàn)一組新的吸收峰，而401 nm的吸收幾乎不變，證實(shí)了螺環(huán)的打開；用710 nm激發(fā)光進(jìn)行雙光子熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)氧雜蒽的雙光子吸收截面增加至（125±12）GM，是螺環(huán)結(jié)構(gòu)的50 倍，同時(shí)在590 nm出現(xiàn)一組強(qiáng)的熒光信號(hào)，并在2 min后達(dá)到平衡；滴定熒光實(shí)驗(yàn)表明，ATP 與TFP 的結(jié)合常數(shù)為（173±8）M-1，TFP對(duì)ATP（0.5～15 mM）的響應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限（33±2）μM；繼續(xù)向溶液中加入三磷酸腺苷雙磷酸酶，隨著溶液中ATP的消耗，590 nm的熒光消失，證明探針對(duì)ATP的檢測(cè)具有可逆性，這對(duì)實(shí)時(shí)生物檢測(cè)具有非常重要的意義。進(jìn)一步通過溶液實(shí)驗(yàn)證明了，TFP可同時(shí)選擇性地檢測(cè)H2O2和ATP，且沒有任何能量共振轉(zhuǎn)移（frster resonance energy transfer，F(xiàn)RET）和信號(hào)干擾的現(xiàn)象。最后，作者通過雙光子熒光壽命成像的方法，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞線粒體內(nèi)的氧化應(yīng)激過程進(jìn)行研究，探討了熒光探針在生化研究中應(yīng)用的可行性。

同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的診斷和治療，也是當(dāng)前熒光探針研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[39-42]。研究表明II 型糖尿病與肝腎疾病密切相關(guān)，相互促進(jìn)，嚴(yán)重影響患者的身體健康，細(xì)胞內(nèi)活性氧在中間起到了重要的作用[43-44]。YU等[45]以近紅外熒光基團(tuán)DX作為診斷基團(tuán)，硼酯作為響應(yīng)、給藥基團(tuán)，結(jié)合鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（sodiumdependent glucose transporters 2，SGLT-2）抑制劑達(dá)格列凈設(shè)計(jì)構(gòu)建了診療型熒光探針DX-B-DA（圖7），用于II 型糖尿病及其引發(fā)的肝、腎損傷的診斷和治療。DX-B-DA 與H2O2反應(yīng)后，中間的硼酯部分脫落，同時(shí)釋放出熒光基團(tuán)和藥物分子。溶液實(shí)驗(yàn)表明，向DXB-DA 溶液加入H2O2后，溶液的最大吸收波長(zhǎng)由590 nm紅移至685 nm，700 nm處的熒光也隨之增強(qiáng)。在熒光滴定實(shí)驗(yàn)中，DX-B-DA 對(duì)H2O2的檢測(cè)響應(yīng)下限為0.36 μM，并且對(duì)細(xì)胞內(nèi)的其他活性氧、氨基酸、金屬離子均無(wú)明顯響應(yīng)，表現(xiàn)出良好的選擇性。所以作者認(rèn)為DX-B-DA 具有檢測(cè)生物體內(nèi)H2O2的潛力。為了驗(yàn)證DX-B-DA的診療能力，他們又以II型糖尿病小鼠模型進(jìn)行進(jìn)一步的生物治療、成像實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，診療分子在檢測(cè)H2O2的同時(shí)，還能釋放出藥物分子，減輕糖尿病引發(fā)的肝腎損傷。

圖6 熒光探針TFP的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機(jī)理Figure 6 The structure of TFP and its response mechanism to H2O2

圖7 診療型熒光探針DX-B-DA的響應(yīng)釋放機(jī)理Figure 7 The structure of DX-B-DA and its response mechanism to H2O2

1.2 氧鎓離子氧化型H2O2熒光探針

一般開關(guān)型的熒光探針，只有一個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)；比率型熒光探針在同一激發(fā)波長(zhǎng)下可發(fā)出兩組不同波長(zhǎng)的發(fā)射光，互為參照，可以根據(jù)兩組發(fā)射光的強(qiáng)度之比實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的準(zhǔn)確檢測(cè)[46-48]。LI 課題組[49]合成了一個(gè)具有氧鎓離子結(jié)構(gòu)的比率型熒光探針GPC（圖8）。由于具有較長(zhǎng)的共軛體系和推拉電子結(jié)構(gòu)，GPC 本身在410 nm 和650 nm 有兩組較強(qiáng)的吸收；與H2O2反應(yīng)后，由于共軛結(jié)構(gòu)變短，410 nm 的吸收增強(qiáng)，650 nm 的吸收減弱，該變化通過肉眼也可以觀察到。同時(shí)在以410 nm 激光作為激發(fā)光源進(jìn)行的溶液熒光實(shí)驗(yàn)中，482 nm的熒光增強(qiáng)，706 nm熒光減弱。根據(jù)H2O2滴定實(shí)驗(yàn)，706 nm 與482 nm 處的熒光強(qiáng)度之比（F482/F706）與溶液中過氧化氫的濃度（1～50 μM）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.9981），檢測(cè)限為0.33 μM。因?yàn)镚PC對(duì)細(xì)胞內(nèi)的其他活性物質(zhì)幾乎沒有響應(yīng)，所以具有對(duì)細(xì)胞內(nèi)H2O2進(jìn)行比率型熒光檢測(cè)的潛力。在生物成像實(shí)驗(yàn)中，作者考察了探針的靶向能力，實(shí)驗(yàn)證明，由于糖苷的引入，GPC可以選擇性地富集到肝細(xì)胞內(nèi)，表現(xiàn)出非常強(qiáng)的熒光信號(hào)，而其他細(xì)胞則沒有這種現(xiàn)象；在使用Mito-Tracker Green 進(jìn)行細(xì)胞器共定位的實(shí)驗(yàn)中，由于氧鎓離子自身帶正電，GPC更多的富集到線粒體內(nèi)，Pearson系數(shù)達(dá)0.91。最后作者還將GPC用于斑馬魚模型，為藥物的肝毒性研究提供成像依據(jù)。

圖8 比率型H2O2熒光探針GPC的響應(yīng)機(jī)理Figure 8 The structure of GPC and its response mechanism to H2O2

1.3 α-二羰基化合物氧化型H2O2熒光探針

HE 等[50]以DCM 為染料，α-二羰基化合物為識(shí)別基團(tuán)構(gòu)建由關(guān)到開型的近紅外H2O2熒光探針DCHP（圖9）。DCHP 與H2O2反應(yīng)后，酰胺堿斷裂，識(shí)別基團(tuán)以對(duì)硝基苯甲酸的形式脫落，同時(shí)暴露出氨基，使分子的光學(xué)信號(hào)發(fā)生改變：溶液顏色由黃色變?yōu)榧t色；紫外吸收峰從448 nm 紅移至487 nm；653 nm 的熒光信號(hào)（λex=487 nm）也增強(qiáng)22 倍。探針對(duì)H2O2具有良好的選擇性，檢測(cè)限為5.3 μM。作者在細(xì)胞水平驗(yàn)證探針的實(shí)用性后，還以銅離子誘發(fā)驗(yàn)證的斑馬魚作為模型，考察了探針對(duì)活體內(nèi)H2O2的成像能力。

圖9 近紅外H2O2熒光探針DCHP的響應(yīng)機(jī)理Figure 9 The structure of DCHP and its response mechanism to H2O2

1.4 Payne/Dakin串聯(lián)反應(yīng)型H2O2熒光探針

YE等[51]以對(duì)亞甲基鄰羥基苯甲醛作為識(shí)別基團(tuán)，萘亞酰胺和試鹵靈作為熒光信號(hào)基團(tuán)，分別設(shè)計(jì)構(gòu)建了基于Payne/Dakin 串聯(lián)反應(yīng)的比率型熒光探針HKPerox-Ratio 和近紅外熒光探針HKPerox-Red（圖10），對(duì)H2O2具有很好的選擇性。HKPerox-Red被用來研究斑馬魚活體內(nèi)的氧化應(yīng)激現(xiàn)象，對(duì)H2O2表現(xiàn)出良好的響應(yīng)性能，又被用來檢測(cè)含有葡萄糖、尿酸和肌氨酸等與糖尿病、痛風(fēng)、前列腺癌相關(guān)物質(zhì)的生物樣本。HKPerox-Ratio被用于白血病細(xì)胞內(nèi)H2O2的熒光檢測(cè)，首次通過流式細(xì)胞儀和活細(xì)胞校正曲線實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)源性H2O2的準(zhǔn)確定量分析。作者期望探針可用于H2O2生理、生化作用方面的研究，并為藥物篩選和疾病診斷提供依據(jù)。

1.5 磺酸酯型H2O2熒光探針

圖10 H2O2熒光探針HKPerox-Ratio和HKPerox-Red的響應(yīng)機(jī)理Figure 10 The response mechanism of HKPerox-Ratio and HKPerox-Red to H2O2

GUO等[52]開發(fā)了一種基于磺酸酯水解反應(yīng)的近紅外熒光探針Cy-PFS（圖11）。苯并花菁作為熒光基團(tuán)，具有近紅外發(fā)射、生物相容度高、生物毒性低、吸光系數(shù)大等特點(diǎn)[53-54]；因?yàn)轫憫?yīng)機(jī)制為五氟甲磺酸的H2O2水解反應(yīng)，可以有效避免生物環(huán)境中其他活性氧化物的干擾，提高探針的選擇性；苯環(huán)上的五個(gè)氟原子可以增強(qiáng)磺酸酯的H2O2水解活性，促進(jìn)探針的靈敏度。由于推拉電子的長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)，Cy-PFS 的最大吸收峰達(dá)830 nm，加入H2O2后，長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)被酮式結(jié)構(gòu)Keto-CY取代，在560 nm 出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰；在730 nm 光源激發(fā)下，Cy-PFS的發(fā)射峰位于836 nm，加入H2O2后，使用560 nm光源激發(fā)，635 nm處的發(fā)射隨之增強(qiáng)；因此，可以通過635 nm和836 nm兩處不同的發(fā)射波長(zhǎng)，構(gòu)建比率型熒光探針，對(duì)H2O2進(jìn)行近紅外熒光成像。H2O2滴定實(shí)驗(yàn)表明，0～100 μM 內(nèi)，lg（F635/F836）與H2O2的濃度呈線性關(guān)系（R2=0.9880），檢測(cè)限50 nM。根據(jù)化學(xué)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，10 μM 的Cy-PFS 與100 μM 的H2O2可在200 s內(nèi)完成反應(yīng)，反應(yīng)的準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)為6.9×10-3S-1。外加其他活性氧化物、氨基酸、金屬離子等，對(duì)檢測(cè)不產(chǎn)生干擾，證明探針具有非常好的選擇性。在此基礎(chǔ)上，使用激光共聚焦熒光成像，可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)H2O2進(jìn)行監(jiān)測(cè)，進(jìn)而研究與之相關(guān)的能量代謝和細(xì)胞增殖過程。最后，Cy-PFS被用來檢測(cè)不同發(fā)育階段小鼠大腦內(nèi)H2O2的表達(dá)水平，研究了內(nèi)源性H2O2與小鼠大腦發(fā)育及細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)，首次闡明了內(nèi)源性H2O2可以作為信號(hào)分子促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂，加速大腦的發(fā)育。

圖11 比率型熒光探針Cys-PFS的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機(jī)制Figure 11 The structure of Cys-PFS and its response mechanism to H2O2

2 小結(jié)與展望

熒光檢測(cè)技術(shù)是當(dāng)前針對(duì)生物活性物質(zhì)的重要研究手段，具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便、可實(shí)時(shí)原位分析等優(yōu)點(diǎn)。熒光成像技術(shù)將熒光探針與激光共聚焦顯微鏡技術(shù)結(jié)合，可對(duì)細(xì)胞、組織和活體內(nèi)的活性物質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)原位成像分析，是當(dāng)前生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域研究的前沿科學(xué)技術(shù)。

本文主要綜述了近五年H2O2熒光探針的研究進(jìn)展，在響應(yīng)機(jī)理的基礎(chǔ)上，歸納總結(jié)了部分H2O2熒光探針的設(shè)計(jì)策略、發(fā)展方向及其在生物學(xué)研究中的應(yīng)用，表明熒光探針在生物以及臨床診斷、治療領(lǐng)域中發(fā)揮著極其重要的作用。但是，當(dāng)前報(bào)道的H2O2熒光探針發(fā)射波長(zhǎng)大多集中在可見光及近紅外一區(qū)，導(dǎo)致其組織穿透性和空間分辨率不足，限制了熒光探針在生物活體成像領(lǐng)域的應(yīng)用。由于近紅外二區(qū)的熒光探針激發(fā)波長(zhǎng)更長(zhǎng)、穿透性更強(qiáng)、光毒性更小、背景干擾更低等特點(diǎn)，開發(fā)新型近紅外二區(qū)熒光染料，并將其作為熒光基團(tuán)構(gòu)建近紅外二區(qū)的熒光探針是今后H2O2熒光探針發(fā)展的重要方向。此外，因?yàn)閱我粺晒獬上袢匀缓茈y滿足目前對(duì)深層、活體、超靈敏、三維、高時(shí)空分辨率等檢測(cè)的需求，因此，結(jié)合核磁、光聲等成像手段構(gòu)建針對(duì)活體內(nèi)H2O2檢測(cè)的多模態(tài)生物檢測(cè)平臺(tái)，也是未來熒光探針發(fā)展的重要內(nèi)容。