夏文彬，石阿茜，沈闐闐，陳 晨，魏玉輝

蘭州大學第一醫(yī)院藥劑科(蘭州 730000)

中醫(yī)臨床用藥的主要形式為中藥配伍，即兩種或兩種以上的藥物相互配合使用從而發(fā)揮協同增效的作用。在中藥配伍理論中，藥對（根據配伍規(guī)律在臨床上多年使用的相對固定的兩味中藥）是中藥配伍的基本單位，亦是中藥方劑的重要組成部分和基礎[1]，經配伍后的方劑往往可以增強療效，降低毒性[2]。中藥女貞子和淫羊藿配伍組成的藥對是由國家級老中醫(yī)李世增教授根據50余年的臨床經驗精選而出，具有平衡腎中陰陽兩虛的功效[3]。國內學者對女貞子-淫羊藿藥對的研究主要集中在老年性骨質疏松癥、哮喘等方面[4-6]。作為經典的滋補腎陰陽配伍使用的女貞子-淫羊藿，是否對藥物性腎損傷有保護作用鮮有報道。本研究旨在研究女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致大鼠腎毒性的保護作用，并從抗氧化和抗炎兩方面對其發(fā)揮腎保護作用的分子機制進行探討，為女貞子-淫羊藿藥對的臨床合理應用提供新的循證依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

女貞子和淫羊藿均購于甘肅冠蘭中藥飲片有限公司，經甘肅省藥品檢驗研究院宋平順教授鑒定為木犀科植物女貞（Ligustrum lucidumAit）的干燥成熟果實和小檗科植物淫羊藿（Epimedium brevicomuMaxi）的干燥葉。順鉑（P4394）購自Sigma 公司；Anti-NADPH oxidase 4（NOX4）抗體（1∶1 000；ab133303）購自abcam；大鼠腎損傷分子1（KIM-1）抗體（1∶1 000；AF3689）購自R&D SYSTEMS；NADP+/NADPH試劑盒（S0179）購自上海碧云天生物技術有限公司；還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factorα，TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）和白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）等ELISA 試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。

PD-1C-50冷凍干燥機（上海比朗儀器制造有限公司）；Multiskan FC型酶標儀（上海賽默飛世爾儀器有限公司）；DYCZ-24DN電泳儀（北京六一儀器廠）；DYCZ-40N濕轉儀（北京六一儀器廠）；WD-9405B水平脫色搖床（北京六一儀器廠）。

1.2 實驗動物

SPF 級Wistar 雄性大鼠（180～ 200）g 30 只購自中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，合格證號為SCXK（甘）2015-0001。動物于溫度（24 ± 1）℃、濕度50%～70%、12 h明暗交替的條件下適應性飼養(yǎng)1周，自由進食飲水，定期更換消毒墊料。所有動物實驗操作均符合動物實驗原則并獲得蘭州大學第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（編號：LDYYLL2020-29）。

1.3 女貞子-淫羊藿水提物粉末的制備

分別稱取3 份女貞子100 g 和淫羊藿50 g（根據蘭州大學第一醫(yī)院院內制劑仙貞扶正顆粒中君藥女貞子-淫羊藿配伍比例2∶1 作為參考），混合后加入15 倍量的蒸餾水浸泡1 h，強火煮沸后文火保持微沸煎煮1 h，過濾收集上清藥液，加熱濃縮至150 mL 左右，為滿足冷凍干燥機抽真空制備成粉末的條件，濃縮液放-20℃冷凍過夜形成固體即可，最后置于冷凍干燥機（-50 ℃，<10 Pa）得女貞子-淫羊藿水提物的冷凍干燥粉（17.36±4.68）g，提取率為（11.68±2.34）%。

1.4 動物分組及給藥

將30只Wistar大鼠（180～200）g，應用隨機數字表法，分為對照組（Control 組）、模型組（Model 組）、女貞子-淫羊藿藥對組（YD組），每組10只。對照組每日灌胃蒸餾水25 mg/kg，連續(xù)7 d；除對照組外，其他兩組均于第4 d腹腔注射順鉑3 mg/kg[7-8]；女貞子-淫羊藿藥對組每日灌胃350 mg/kg水提物，連續(xù)給藥7 d。

1.5 大鼠體重變化率和腎臟指數的計算[8]

1.6 大鼠血清生化指標及腎臟組織病理學考察

末次給藥禁食12 h 后，腹腔注射10%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 500 rpm離心10 min后分離出血清，-80 ℃保存。全自動生化分析儀測定血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，CREA）和尿酸（Uric acid，UA）。頸部異位處死大鼠，摘取腎組織，用生理鹽水清洗并用濾紙擦干，置于10%甲醛溶液中固定48～72 h，蘇木素-伊紅染色（hematoxylineosin staining，HE），光學顯微鏡下觀察腎組織病理學變化。

1.7 腎組織中KIM-1和NOX4表達水平檢測

將脫蠟的腎組織切片與KIM-1（1∶20）和NOX4（1∶200）的一抗在4 ℃下孵育過夜，用PBS 洗滌三次后，將樣品與二抗在37 ℃孵育1 h，用PBS 洗滌三次，然后用3，3’-二氨基聯苯胺（DAB）染色，用蘇木精復染，通過光學顯微鏡觀察免疫染色強度。

腎組織0.04 g于1.5 mL離心管中，加入含PMSF的RIPA 裂解液400 μL 充分勻漿，液氮反復凍融3 次后，4 ℃條件下14 000 rpm低溫離心10 min，收集上清液加入5×蛋白上樣緩沖液（樣品上清∶上樣緩沖液=4∶1），95 ℃加熱變性5 min。梳孔中依次加入Marker 和樣品蛋白，先調節(jié)電壓為75 V，待溴酚藍電泳到達分離膠時調整電壓為120 V至電泳結束。分離蛋白質后，在50 V恒壓下轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上200 min，用5%脫脂牛奶全封閉1 h（以破壞非特異性結合）后，將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜。用TBST 洗滌三次后，將膜與二抗在室溫下孵育1 h，使用ECL化學發(fā)光檢測信號，并用Image J軟件測量蛋白質條帶強度。

1.8 腎組織中MDA、SOD、CAT、GSH 和NADP+/NADPH的測定

按照南京建成生物工程研究所提供的商業(yè)化試劑盒說明書，檢測波長在405、420、450和532 nm下CAT、GSH、SOD和MDA的OD值，通過BCA法得到的50個樣品組織濃度，并利用相關公式計算上述指標的含量水平。此外NADP+/NADPH 水平按照上海碧云天生物技術有限公司提供的試劑盒說明書進行檢測。

1.9 腎組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的測定

按照上海酶聯生物科技有限公司提供的ELISA試劑盒說明書，檢測450 nm IL-1β、IL-6 和TNF-α 的OD值，通過BCA 法得到的50 個樣品組織濃度，并利用相關公式計算上述指標的含量水平。

1.10 統計學方法

用SPSS 25.0軟件對數據進行統計學分析，結果以均數±標準差（）描述，多組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），LSD 法進行多重比較，P <0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致腎毒性大鼠體重和臟器指數的影響

大鼠腹腔注射順鉑后，攝水量和攝食量明顯減少，女貞子-淫羊藿藥對治療前后體重及臟器指數變化情況如表1所示：與對照組相比，模型組大鼠體重顯著降低（P<0.05），腎臟器指數明顯升高（P<0.001）；給予女貞子-淫羊藿藥對水提物后，腎臟器指數顯著下降（P<0.05），但大鼠體重并無明顯變化，見表1。

2.2 女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致腎毒性大鼠血清生化指標和組織病理學的影響

女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致腎毒性大鼠血清生化指標的影響如表2所示：與對照組相比，模型組大鼠血清BUN 和CREA 顯著升高（P<0.05），UA 也有一定程度的升高，但差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組相比，女貞子-淫羊藿藥對組血清BUN和UA顯著性降低（P<0.05），CREA也有一定程度降低，但差異無統計學意義（P>0.05）對順鉑所致腎毒性大鼠組織病理學的影響，見圖1。

表1 女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致腎毒性大鼠體重和臟器指數的影響（，n=10）Table 1 Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on body weight and renal index of cisplatin induced nephrotoxicity in rats（，n=10）

表1 女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致腎毒性大鼠體重和臟器指數的影響（，n=10）Table 1 Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on body weight and renal index of cisplatin induced nephrotoxicity in rats（，n=10）

注：YD表示女貞子-淫羊藿藥對組；a與對照組相比，P<0.05；b與對照組相比，P<0.001；c與模型組相比，P<0.05。

表2 女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致腎毒性大鼠血清生化指標的影響（，n=10）Table 2 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on serum biochemical indicators in rats with cisplatin induced nephrotoxicity（，n=10）

表2 女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致腎毒性大鼠血清生化指標的影響（，n=10）Table 2 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on serum biochemical indicators in rats with cisplatin induced nephrotoxicity（，n=10）

注：YD表示女貞子-淫羊藿藥對組；a與對照組相比，P<0.05；b與對照組相比，P<0.01；c與模型組相比，P<0.05；d與模型組相比，P<0.01。

圖1 女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致腎毒性大鼠組織病理學的影響（放大倍數=200×，比例尺=50μm）Figure1 Effects of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on histopathological change in the kidney（Magnification=200×，Scale bar=50μm）

2.3 女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致腎毒性大鼠KIM-1的影響

腎組織中近端腎小管特異性生物標志物KIM-1的蛋白表達水平如圖2A 所示：與對照組相比，模型組KIM-1蛋白表達顯著性增加（P<0.05）；給予藥對水提物后，可顯著下調順鉑引起腎臟KIM-1 蛋白的表達（P<0.05）。免疫組化表達情況如圖2B 所示：與對照組相比，模型組大鼠腎小管細胞膜、胞漿腎皮質和腎髓質交界處的管腔中可見大量KIM-1陽性抗原，且KIM-1 蛋白表達明顯增多；給予藥對水提物后，腎組織中KIM-1陽性表達的腎小管數量明顯減少，見圖2。

圖2 女貞子-淫羊藿藥對對順鉑致腎毒性大鼠KIM-1的影響（放大倍數=200×，比例尺=100μm，，n=10）Figure 2 Effects of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on KIM-1 in rats with nephrotoxicity induced by cisplatin（magnification=200×，Scale bar=100μm，，n=10）

2.4 女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致腎毒性大鼠抗氧化酶NOX4和氧化應激標志物的影響

氧化應激在順鉑腎毒性中起關鍵性作用，因此通過檢測相關抗氧化酶NOX4和氧化應激標志物（MDA、SOD、CAT 和GSH）來評估氧化損傷程度。因氧化應激可以提高活性氧ROS 的水平[9]，且ROS 主要來源NADPH 氧化酶，故利用試劑盒檢測大鼠腎臟NADP+/NADPH 比值結果如表3 所示，與對照組相比，模型組NADP+/NADPH比值升高，給予藥對水提物后，NADP+/NADPH 比值顯著性降低（P<0.05）。NOX4 蛋白表達及免疫組化實驗結果如圖3A、B 所示：與對照組相比，模型組腎臟組織中NOX4陽性信號表達加強且蛋白表達升高；給予藥對水提物后，NOX4陽性信號減弱，蛋白表達也有所降低，但無顯著性差異，見表3、圖3。

表3 女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致腎毒性大鼠腎臟NADP+/NADPH比值的影響（，n=10）Table 3 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on NADP+/NADPH ratio in rats with cisplatin induced nephrotoxicity（，n=10）

表3 女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致腎毒性大鼠腎臟NADP+/NADPH比值的影響（，n=10）Table 3 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on NADP+/NADPH ratio in rats with cisplatin induced nephrotoxicity（，n=10）

注：YD表示女貞子-淫羊藿藥對組；a與對照組相比，P<0.001；b與模型組相比，P<0.001。

圖3 女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致腎毒大鼠腎組織中NOX4的影響（放大倍數=200×，比例尺=100μm，，n=10）Figure 3 Effects of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on NOX4 in renal tissues of rats with cisplatin induced nephrotoxicity（magnification=200×，Scale bar=100μm，，n=10）

考察氧化應激標志物MDA、CAT、SOD和GSH水平如表4所示：與對照組相比，模型組腎臟中脂質過氧化物MDA 蓄積顯著升高（P<0.05），抗氧化酶CAT、SOD和GSH 活性均顯著性降低（P<0.05）；女貞子-淫羊藿藥對干預后，大鼠腎臟MDA累積明顯降低（P<0.05），CAT、SOD 和GSH 抗氧化能力顯著性提高（P<0.05），見表4。

表4 女貞子-淫羊藿藥對對大鼠腎臟氧化應激標志物的影響（，n=10）Table 4 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on oxidative stress markers in rat kidney（，n=10）

表4 女貞子-淫羊藿藥對對大鼠腎臟氧化應激標志物的影響（，n=10）Table 4 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on oxidative stress markers in rat kidney（，n=10）

注：YD表示女貞子-淫羊藿藥對組；a與對照組相比，P<0.05；b與模型組相比，P<0.05；c與模型組相比，P<0.01。

2.5 女貞子-淫羊藿藥對對順鉑所致腎毒性大鼠炎癥因子的影響

用ELISA法檢測腎組織勻漿中TNF-α、IL-6和IL-1β 水平，結果如表5 所示：與對照組相比，模型組大鼠腎組織勻漿中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，給予藥對水提物后可顯著降低腎組織勻漿中TNF-α 和IL-6 的水平（P<0.05），IL-1β 水平有所降低，但無顯著性差異（P>0.05），見表5。

3 討論

順鉑是臨床上應用最廣泛治療多種實體瘤的化療藥之一，可用于睪丸癌、肺癌、宮頸癌和卵巢癌等各種類型的癌癥[10]，然而它的臨床應用受到其嚴重的劑量依賴性毒副作用限制，其中最常見的是腎毒性[11]。近年來，越來越多的腫瘤患者在腫瘤細胞侵襲和治療手段毒副作用的雙重損傷下，更愿選擇中醫(yī)藥作為疾病的輔助治療，不僅可以改善人體臟腑功能，還可使機體恢復正常水平。除此之外，眾多國內外學者致力于探討傳統中藥防治順鉑腎毒性的研究[12-13]，其中中藥提取物、中藥單體的報道日益增多[14-16]，女貞子與淫羊藿配伍的藥對具有補腎壯骨之功效[17]，但其對順鉑所致腎毒性是否發(fā)揮腎保護作用缺乏研究。故本研究重點對女貞子-淫羊藿藥對對臨床化療藥順鉑所致大鼠腎毒性的腎保護作用及機制進行探討。

表5 女貞子-淫羊藿藥對對大鼠腎臟炎癥因子標志物的影響（，n=10）Table 5 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on inflammatory factor markers in rat kidney（，n=10）

表5 女貞子-淫羊藿藥對對大鼠腎臟炎癥因子標志物的影響（，n=10）Table 5 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on inflammatory factor markers in rat kidney（，n=10）

注：YD表示女貞子-淫羊藿藥對組；a與對照組相比，P<0.05；b與對照組相比，P<0.01；c與模型組相比，P<0.05。

美國食品和藥物管理局FDA 和歐洲藥品管理局（EMEA）批準了7 種可能影響臨床決策的腎毒性檢測新生物標志物：KIM-1、白蛋白、B2-微球蛋白、胱抑素C、總蛋白簇蛋白和三葉因子-3[19-20]。其中，腎損傷分子KIM-1 是一種腎近端小管頂端跨膜糖蛋白，其在健康患者尿液中濃度非常低，而在患有腎損傷的動物和人類尿液中，其濃度與腎損傷程度呈正相關，同時也表明炎癥的嚴重程度，可能是一種能夠早期識別腎損傷的潛在生物標志物，且被一些作者認為KIM-1 對順鉑腎毒性有著預測作用[21-22]。故本研究利用免疫組化和Western blotting 法檢測大鼠腎組織中KIM-1 的蛋白表達水平，發(fā)現經順鉑誘導的腎毒性大鼠KIM-1 蛋白表達顯著性升高，女貞子-淫羊藿藥對干預后可降低KIM-1的表達，從而緩解腎損傷程度。

氧化應激在順鉑腎毒性的發(fā)病機制中起著至關重要作用[23]。當活性氧ROS的產生和抗氧化防御系統之間缺乏平衡時，氧化應激隨之而來。順鉑腎毒性中產生的ROS 主要來源于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，也稱為NOXs[24-25]。NOXs 家族由7種亞型組成：NOX1 表達于結腸組織，NOX2 表達于吞噬細胞，NOX3 表達于內耳，NOX5 表達于淋巴組織，Duxo1 和Duxo1 表達于甲狀腺和支氣管，其中NOX4 主要在腎臟中高表達[26]。因此采用免疫組化和Western blotting 考察了大鼠腎臟NOX4 表達的水平，結果顯示女貞子-淫羊藿藥對通過抑制NOX4 氧化酶發(fā)揮腎保護作用。與此同時，還檢測了氧化應激標志物的水平，SOD 可催化超陽陰離子生成過氧化氫和氧氣，MDA 是氧自由基和脂質過氧化的最終產物，均可反映機體的損害情況[27]。順鉑誘導的腎毒性會產生大量的ROS和消耗GSH，降低SOD 和CAT 的水平，并導致MDA 的蓄積[28]。在本研究中也觀察到了類似的現象，且女貞子-淫羊藿藥對預處理后可有效的將這些氧化應激標志物變化逆轉到相對正常的水平。除此之外，炎癥在順鉑所致腎毒性的發(fā)病機制中同樣起著重要作用[29]。在本研究中，暴露于順鉑的大鼠腎組織中的炎癥因子TNFα、IL-6和IL-1β水平顯著增加，女貞子-淫羊藿藥對可明顯降低其在腎組織中的水平。

4 結論

本研究結果顯示，女貞子-淫羊藿藥對可降低順鉑誘導腎毒性小鼠BUN 和UA，明顯緩解腎小管損傷，發(fā)揮腎保護作用。其機制可能與抑制腎組織中KIM-1的表達、激活抗氧化酶的活性和抑制炎癥因子的釋放有關。