陳春穎, 陶 超, 丁木子, 王鳳舞, 朱小麗, 申 麗

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225009; 2. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 揚(yáng)州, 225009;3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島, 266109)

微生物來(lái)源的天然藥物是新藥及其先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源,特殊生態(tài)環(huán)境下的微生物與特殊的次生代謝產(chǎn)物密切相關(guān),因此微生物源新藥或先導(dǎo)化合物的研究更多地集中于特殊生境微生物[1-2]。生活在海洋環(huán)境中的真菌和細(xì)菌,在寡營(yíng)養(yǎng)、低溫、高壓、高鹽、無(wú)光照等惡劣條件下,常形成特殊的代謝途徑,易產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的次生代謝產(chǎn)物[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn),海洋真菌和細(xì)菌與海洋動(dòng)物(節(jié)肢動(dòng)物、刺胞動(dòng)物、軟體動(dòng)物等)存在密切的共生關(guān)系,海洋共生微生物很可能是多種海洋生物活性成分的真正產(chǎn)生者。海洋動(dòng)物共生菌作為海洋微生物藥物的重要研究方向之一,為新藥研發(fā)提供了豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。毀絲霉(Myceliophthora)為半知菌類真菌,在自然界中廣泛分布。Myceliophthora屬真菌根據(jù)分子鑒定和表型可分為4個(gè)分支,即Myceliophthora、Corynascus、Crassicarpon和Thermothelomyce[5], 其中Crassicarponthermophilum和Thermothelomycespp. 為嗜熱真菌,其能產(chǎn)生非常豐富的酶系。目前,關(guān)于Myceliophthora屬真菌的研究大多集中在其所產(chǎn)生的耐熱木聚糖酶[6]、淀粉酶[7]、纖維素酶[8]等熱穩(wěn)定性酶方面,次生代謝產(chǎn)物相關(guān)研究則極少。前期實(shí)驗(yàn)[9]從長(zhǎng)島海域牡蠣中分離得到共生真菌MyceliophthoraluteaML-1(M.luteaML-1), 本研究基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)研究其發(fā)酵液的化學(xué)成分,以期明確M.luteaML-1的次生代謝產(chǎn)物譜,為挖掘新穎結(jié)構(gòu)藥物先導(dǎo)化合物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Atlantis T3色譜柱(2.1 mm×150 mm, 3 μm), 美國(guó)安捷倫科技有限公司; 色譜甲醇,美國(guó)TEDIA化學(xué)試劑有限公司; 色譜甲酸,美國(guó)ACS恩科化學(xué)公司; D-山梨醇,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; D-(+)-麥芽糖一水合物,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 酵母膏,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; L-色氨酸,阿拉丁生化科技有限公司; 海鹽,中國(guó)鹽業(yè)集團(tuán)有限公司; 其他試劑為分析純。

TripleTOF 4600液-質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)AB SCIEX有限公司); SHP-250恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司); SKY-200B恒溫振蕩搖床(上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司); DW-HL388超低溫冰箱(中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)等。

1.2 菌株發(fā)酵和發(fā)酵產(chǎn)物提取方法[10]

M.luteaML-1是從長(zhǎng)島海域牡蠣中分離得到的共生真菌[9](Genbank號(hào): ON005439), 菌株保存于揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院天然藥物化學(xué)研究室。使用真菌1號(hào)培養(yǎng)基(山梨醇20 g、麥芽糖20 g、味精10 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、色氨酸0.5 g、酵母膏3 g、海鹽30 g、水1 000 mL)進(jìn)行菌株小量發(fā)酵。從M.luteaML-1凍存管中挑取少量菌體接入PDA平板, 28 ℃培養(yǎng)2～3 d; 挑取菌塊接入500 mL三角瓶中(200 mL PD培養(yǎng)基), 28 ℃、120轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)3 d; 再將種子液接入1 000 mL三角瓶中(400 mL真菌1號(hào)培養(yǎng)基), 28 ℃、120轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)15 d。發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,減壓蒸餾去除溶劑,得到粗浸膏。發(fā)酵液粗浸膏經(jīng)色譜甲醇溶解、0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后,進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.3 發(fā)酵液粗浸膏的LC-MS/MS分析[10]

高效液相色譜(HPLC)條件: Atlantis T3柱(2.1 mm× 150 mm, 3 μm), 流動(dòng)相A(0.1%甲酸溶液),流動(dòng)相B(甲醇),梯度洗脫(0～10 min, 80%→20% A; 10～20 min, 20%→1% A; 20～32 min, 1%→1% A), 流速0.3 mL/min, 柱溫40 ℃, 進(jìn)樣量5 μL。

四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(Q-TOF-MS/MS)條件: 電噴霧離子源; 正離子模式; 氣簾氣壓力35 kV; 霧化溫度550 ℃; 霧化氣55 Psi, 輔助氣55 Psi; 噴霧電壓5 500 V; 去簇電壓80 eV; 碰撞電壓35 eV; 全掃描模式,一級(jí)母離子掃描范圍100～2 000, 二級(jí)子離子掃描范圍50～2 000。

1.4 經(jīng)典分子網(wǎng)絡(luò)(CMN)構(gòu)建和化學(xué)成分識(shí)別

原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)MSconvert軟件轉(zhuǎn)換為.mzXML格式文件,再上傳至全球天然產(chǎn)物社會(huì)分子網(wǎng)絡(luò)(GNPS)平臺(tái)構(gòu)建CMN。參數(shù)設(shè)置: 碎片離子質(zhì)量誤差值為0.02 Da, 最小余弦值為0.6, 最小碎片匹配峰為6。將生成的CMN導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化,同時(shí)可利用GNPS平臺(tái)“MS/MS Library”檢索功能快速識(shí)別潛在化學(xué)成分,設(shè)置最小匹配峰為6和最小匹配分?jǐn)?shù)為0.7。

1.5 特征峰分子網(wǎng)絡(luò)(FBMN)構(gòu)建和相對(duì)定量

原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)MSconvert軟件轉(zhuǎn)換為.mzXML格式文件后,導(dǎo)入MZmine 2軟件進(jìn)行原始譜圖的識(shí)別、提取、對(duì)齊、去噪、分組等處理,再以.mgf和.csv格式文件導(dǎo)出,并上傳至GNPS平臺(tái)的“FBMN”模塊中構(gòu)建FBMN。參數(shù)設(shè)置: 前體離子質(zhì)量誤差值為0.02 Da, 碎片離子質(zhì)量誤差值為0.02 Da。將生成的FBMN導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化。FBMN可通過(guò)LC-MS特征豐度(峰面積或峰高度)更準(zhǔn)確地估計(jì)相對(duì)離子強(qiáng)度,因此能進(jìn)行化學(xué)成分的相對(duì)定量[11]。FBMN中,節(jié)點(diǎn)大小可直觀反映化合物的相對(duì)含量。

2 結(jié) 果

2.1 基于CMN的發(fā)酵液化學(xué)成分識(shí)別和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

應(yīng)用CMN進(jìn)行大規(guī)模數(shù)據(jù)集的元分析,可以方便快捷地分析LC-MS2數(shù)據(jù)。對(duì)M.luteaML-1發(fā)酵液粗浸膏的LC-MS/MS譜進(jìn)行處理后,上傳到GNPS平臺(tái)構(gòu)建CMN, 見(jiàn)圖1、圖2。該分子網(wǎng)絡(luò)共有1 282個(gè)節(jié)點(diǎn),其中節(jié)點(diǎn)數(shù)≥3的分子簇有39個(gè),見(jiàn)圖2。利用GNPS平臺(tái)的"MS/MS Library"功能搜庫(kù),將初步匹配的化合物與平臺(tái)二級(jí)質(zhì)譜庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),結(jié)果識(shí)別出潛在的化學(xué)成分39個(gè); 在此基礎(chǔ)上,根據(jù)分子簇中各節(jié)點(diǎn)間的質(zhì)荷比和MS2碎片離子關(guān)系又進(jìn)一步預(yù)測(cè)出10個(gè)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu),見(jiàn)圖2、表1。已識(shí)別和預(yù)測(cè)出的化合物包括18個(gè)脂肪酸類衍生物(分子簇A, 化合物1～18)、8個(gè)蒽醌類化合物(分子簇B, 化合物19～20,23～26; 2個(gè)單節(jié)點(diǎn)簇,化合物21和22)、12個(gè)環(huán)二肽類化合物(分子簇C, 化合物27～38)及11個(gè)其他類型化合物(化合物39～49), 見(jiàn)圖2。研究[11]發(fā)現(xiàn),在非靶向LC-MS2數(shù)據(jù)采集過(guò)程中,同一前體離子在色譜洗脫過(guò)程中經(jīng)常被多次碎片化,雖然MS-Cluster通常能夠?qū)⑦@些光譜聚類到CMN中的1個(gè)節(jié)點(diǎn)中,但在某些情況下,會(huì)產(chǎn)生代表同一化合物的多個(gè)節(jié)點(diǎn)。此外,由于算法的原因,分析結(jié)果會(huì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)類似物并未聚集在同一個(gè)分子簇的現(xiàn)象[12]。

圖1 牡蠣共生真菌M.lutea ML-1發(fā)酵液粗浸膏的總離子流圖

A: 脂肪酸類化合物; B: 蒽醌類化合物; C: 環(huán)二肽類化合物。紅色節(jié)點(diǎn)為已識(shí)別或預(yù)測(cè)出的化合物。

直接利用GNPS平臺(tái)的"MS/MS Library"功能, 快速發(fā)現(xiàn)菌株ML-1發(fā)酵液中存在15個(gè)脂肪酸類化合物(化合物1～15), 其中化合物1～10分別為L(zhǎng)inolenic acid(1)、13-hydroxyoctadeca-6, 9, 11-trienoic acid(2)、9, 12-Octadecadienoicacid(3)、1-stearoyl-sn-glycerol(4)、Monopalmitin(5)、2, 3-Dihydroxypropyl 9, 12, 15-octadecatrienoate(6)、1-Monolinolein(7)、elaidic acid(8)、13-Docosenamide(9)、Oleamide(10)。分析分子網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn), 節(jié)點(diǎn)m/z293.248 0([M+H-H2O]+,tR=14.51 min)、m/z339.289 0([M+H-H2O]+,tR=16.98 min)、m/z295.264 9([M+H-H2O]+,tR=17.58 min)、m/z381.301 2([M+H-H2O]+,tR=17.76 min)和m/z263.236 7([M+H-H2O]+,tR=16.4 min)分別與化合物methyl 13-hydroxyoctadeca-9, 11-dienoate、Glyceryl monooleate、methyl 12-hydroxyoctadec-9-enoate、1-oleoyl-2-acetoyl-sn-glycerol和10, 12-Octadecadienoic acid具有相同的二級(jí)質(zhì)譜, 故確定其分別為methyl 13-hydroxyoctadeca-9, 11-dienoate(11)、Glyceryl monooleate(12)、methyl 12-hydroxyoctadec-9-enoate(13)、1-oleoyl-2-acetoyl-sn-glycerol(14)和10, 12-Octadecadienoic acid(15); 比對(duì)二級(jí)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn),節(jié)點(diǎn)m/z357.300 6([M+H]+,tR=16.95 min)與m/z339.289 0([M+H-H2O]+,tR=16.98 min)為同一化合物Glyceryl monooleate(12)。在此基礎(chǔ)上,依據(jù)分子網(wǎng)絡(luò)提示的相鄰節(jié)點(diǎn)之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系進(jìn)行其他節(jié)點(diǎn)化合物的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果又識(shí)別出3個(gè)化合物。節(jié)點(diǎn)m/z309.241 3([M+H]+,tR=14.35 min)比節(jié)點(diǎn)m/z295.225 7([M+H]+,tR=12.22 min, 化合物2)多1個(gè)CH2, 同時(shí)比節(jié)點(diǎn)m/z293.248 0([M+H-H2O]+,tR=14.51 min, 化合物11)少2個(gè)H, 結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜可確定其為化合物Methyl 13-oxo-9, 11-octadecadienoate(16); 節(jié)點(diǎn)m/z341.306 1([M+H-H2O]+,tR=18.26 min)比節(jié)點(diǎn)m/z339.289 0([M+H-H2O]+,tR=16.98 min,12)多2個(gè)H原子, 結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜推測(cè)其為化合物1-Monostearin(17); 節(jié)點(diǎn)m/z280.264 5([M+H]+,tR=15.27 min)與節(jié)點(diǎn)m/z281.248 1([M+H]+,tR=16.4 min, 化合物3)質(zhì)荷比相差1, 同時(shí)比m/z282.279 9([M+H]+,tR=16.43 min, 化合物10)少2個(gè)H原子,可能是化合物3結(jié)構(gòu)中的羧基變?yōu)轷０坊?結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜確定其為化合物9, 11-Octadecadienamide(18)。分子簇中某些節(jié)點(diǎn)分子的提示信息較少,僅靠二級(jí)碎片無(wú)法確定結(jié)構(gòu),有待進(jìn)一步鑒定。見(jiàn)表1-1、圖3。

表1-1 牡蠣共生真菌M.lutea ML-1發(fā)酵液的脂肪酸類化學(xué)成分

圖3 分子網(wǎng)絡(luò)中的脂肪酸類化合物分子簇

運(yùn)用"MS/MS Library"檢索功能,快速發(fā)現(xiàn)菌株ML-1發(fā)酵液分子網(wǎng)絡(luò)中的蒽醌類化合物分子簇。節(jié)點(diǎn)m/z543.127 7([M+H]+,tR=10.77 min)、m/z節(jié)點(diǎn)575.119 4([M+H]+,tR=7.95 min)、m/z節(jié)點(diǎn)285.075 9([M+H]+,tR=13.73 min)和節(jié)點(diǎn)m/z315.050 4([M+H]+,tR=9.11 min)分別與GNPS平臺(tái)譜庫(kù)收錄的蒽醌類化合物Rugulosin A、(-)-Luteoskyrin、1, 8-dihydroxy-3-methoxy-6-methylanthracene-9, 10-dione和Endocrocin的二級(jí)質(zhì)譜基本一致,故確定上述節(jié)點(diǎn)化合物為Rugulosin A(19)、(-)-Luteoskyrin(20)、1, 8-dihydroxy-3-methoxy-6-methylanthracene-9, 10-dione(21)和Endocrocin(22)。依據(jù)相鄰節(jié)點(diǎn)之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系,對(duì)節(jié)點(diǎn)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),又識(shí)別出4個(gè)蒽醌類化合物: ① 節(jié)點(diǎn)m/z559.124 1([M+H]+,tR=9.21 min)比節(jié)點(diǎn)m/z543.127 7(Rugulosin A, 化合物19)質(zhì)荷比大16(多1個(gè)O原子),其結(jié)構(gòu)有3種可能,分別為Rugulosin A(19)的C-6、C-8、C-11羥基化衍生物; 其比節(jié)點(diǎn)m/z575.119 4[(-)-Luteoskyrin, 化合物20]質(zhì)荷比小16(少1個(gè)O原子),也存在3種結(jié)構(gòu)可能,即 (-)-Luteoskyrin(20)的C-2、C-5、C-8脫羥基化衍生物; 綜合上述結(jié)構(gòu)信息,并結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律,推測(cè)其為化合物19的C-8位羥基化衍生物(+)-Deoxyluteoskyrin(23)。② 同理推測(cè)節(jié)點(diǎn)m/z591.113 7([M+H]+,tR=5.55 min, 化合物24)是節(jié)點(diǎn)m/z575.119 4(-)-Luteoskyrin, 化合物20)的一氧化物,其有4種可能結(jié)構(gòu),即(-)-Luteoskyrin(20)的C-2、C-4a、C-6、C-11羥基化衍生物; 以分子式C30H22O13檢索SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn), (-)-Luteoskyrin(20)的C-4a羥基化衍生物(-)-4α-Oxyluteoskyrin已有報(bào)道,但化合物24是否為該化合物有待進(jìn)一步確定。③ 節(jié)點(diǎn)m/z[M+H]+573.101 9(C31H24O11,tR=10.07 min, 化合物25)和節(jié)點(diǎn)m/z[M+H]+589.099 5(C31H24O12,tR=8.63 min, 化合物26)分別為化合物(+)-Deoxyluteoskyrin(化合物23, C30H22O11)和化合物(-)-Luteoskyrin(化合物20, C30H22O12)的甲基化衍生物。用化合物25、26的分子式檢索SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù),未發(fā)現(xiàn)符合二蒽醌結(jié)構(gòu)特征的化合物,提示這2個(gè)化合物可能為新二蒽醌類化合物。因二蒽醌化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律比較復(fù)雜,僅靠二級(jí)質(zhì)譜信息暫時(shí)無(wú)法確定化合物25、26的具體結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖4、表1-2。

表1-2 牡蠣共生真菌M.lutea ML-1發(fā)酵液的蒽醌類化學(xué)成分

圖4 分子網(wǎng)絡(luò)圖中的蒽醌類化合物所在分子簇

運(yùn)用"MS/MS Library"功能進(jìn)行化合物匹配,快速發(fā)現(xiàn)菌株ML-1發(fā)酵液分子網(wǎng)絡(luò)中的環(huán)二肽類化合物分子簇,經(jīng)與GNPS平臺(tái)譜庫(kù)收錄的二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行比對(duì),快速識(shí)別出9個(gè)節(jié)點(diǎn)化合物,分別為cyclo(Leu-Pro)(27)、cyclo(Val-Pro)(28)、cyclo(Phe-Pro)(29)、cyclo(Leu-Phe)(30)、cyclo(Phe-4-hydroxy-Pro)(31)、cyclo(L-Leu-trans-4-hydroxy-L-Pro)(32)、cyclo(Val-Phe)(33)、cyclo(Leu-Val)(34)和cyclo(Tyr-Pro) (35)。根據(jù)分子網(wǎng)絡(luò)提示的節(jié)點(diǎn)化合物的分子式以及相鄰節(jié)點(diǎn)的結(jié)構(gòu)關(guān)系,結(jié)合環(huán)二肽類化合物的裂解規(guī)律[13-15], 進(jìn)一步將節(jié)點(diǎn)m/z263.139 2([M+H]+,tR=3.92 min)、節(jié)點(diǎn)m/z185.128 5([M+H]+,tR=3.77 min)和節(jié)點(diǎn)m/z227.176 9([M+H]+,tR=7.46 min)分別鑒定為化合物cyclo(Val-Tyr)(36)、cyclo(Ala-Leu)(37)和cyclo(Leu-Ile)(38), 見(jiàn)表1-3、圖5。

表1-3 牡蠣共生真菌M.lutea ML-1發(fā)酵液的環(huán)二肽類化學(xué)成分

圖5 分子網(wǎng)絡(luò)圖中環(huán)二肽類化合物所在分子簇

除脂肪酸類、蒽醌類、環(huán)二肽類化合物,本研究還識(shí)別出11個(gè)其他結(jié)構(gòu)類型化合物,具體包括: 鄰苯二甲酸酯類, dibutyl phthalate(39)和dioctyl phthalate(40); 麥角甾醇類, ergosterol-5, 8-peroxide(41); 香豆素類, 1H-2-Benzopyran-1-one(42); 喹啉類, 4-Hydroxy quinolie(43)和4-Quinolinecarboxylic acid(44); 吡啶類, 3-Pyridinecarboxylic acid(45); 仲胺, N-benzyl-1-phenylmethanamine(46); 聚醚類, Nonaethylene glycol(47)、EG-10(48)和undecaethylene glycol(49)。見(jiàn)表1-4。

表1-4 牡蠣共生真菌M.lutea ML-1發(fā)酵液的其他類型化學(xué)成分

2.2 基于FBMN的發(fā)酵液化學(xué)成分分析

利用GNPS平臺(tái)的“Feature Networking”模塊構(gòu)建菌株發(fā)酵液的FBMN, 見(jiàn)圖6。FBMN共有649個(gè)節(jié)點(diǎn),比CMN少633個(gè),結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)快速識(shí)別出41個(gè)化合物; 節(jié)點(diǎn)數(shù)≥3的分子簇有14個(gè),比CMN少25個(gè)。FBMN構(gòu)建前的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理,在剔除儀器、雜質(zhì)離子和系統(tǒng)誤差等因素影響的同時(shí),還會(huì)過(guò)濾掉一些質(zhì)譜信息,因此FBMN的節(jié)點(diǎn)和分子簇比CMN少。構(gòu)建FBMN需使用適當(dāng)?shù)奶幚聿襟E和參數(shù),否則會(huì)影響分子網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果; 此外, CMN使用光譜計(jì)數(shù)或前體離子計(jì)數(shù),而FBMN可通過(guò)LC-MS特征豐度(峰面積或峰高度)更準(zhǔn)確地估計(jì)相對(duì)離子強(qiáng)度,從而實(shí)現(xiàn)分子網(wǎng)絡(luò)化學(xué)成分的相對(duì)定量[11]。本研究利用FBMN進(jìn)行發(fā)酵液化學(xué)成分的相對(duì)定量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),節(jié)點(diǎn)m/z317.245 5(tR=18.63 min)、m/z319.225 0(tR=12.96 min)、m/z763.179 0(tR=24.75 min)、m/z837.198 8(tR=26.91 min)、m/z279.232 5(tR=12.96 min)、m/z321.240 5(tR=13.81 min)、m/z393.298 1(tR=18.01 min)、m/z303.229 7(tR=16.91 min)、m/z235.097 1(tR=6.56 min)和m/z211.144 5(tR=4.69 min)為相對(duì)含量排名前10位的化學(xué)成分。其中,節(jié)點(diǎn)m/z279.232 5(tR=12.96 min)、m/z235.097 1(tR=6.56 min)和m/z211.144 5(tR=4.69 min)分別被鑒定為脂肪酸類化合物L(fēng)inolenic acid(1)的順?lè)串悩?gòu)體(兩者的二級(jí)質(zhì)譜相同,但保留時(shí)間有明顯差異)、香豆素類化合物1H-2-Benzopyran-1-one(42)和環(huán)二肽類化合物cyclo(Leu-Pro)(27), 其余7個(gè)節(jié)點(diǎn)分子的結(jié)構(gòu)有待鑒定,見(jiàn)圖6、圖7。該分析結(jié)果明確了菌株ML-1采用真菌1號(hào)培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)的主要次生代謝產(chǎn)物。

圖7 M.lutea ML-1發(fā)酵液中的主要次生代謝產(chǎn)物(相對(duì)含量排名前10位)

3 討 論

Index fungorum網(wǎng)站(https://www.indexfungorum.org/Names.asp)統(tǒng)計(jì)顯示,Myceliophthora屬已被報(bào)道的種共有19個(gè),去掉同物異名和無(wú)效種,被承認(rèn)的種僅14個(gè),即M.fergusii、M.guttulate、M.heterothallica、M.hinnulea、M.indica、M.lutea、M.novoguineensis、M.officinarum、M.sepedonium、M.setosus、M.sexualis、M.similis、M.thermophila和M.verrucosa[16]。但目前為止,僅M.thermophila、M.lutea和M.heterothallica有次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究報(bào)道。GAO Y L等[17]從M.thermophilaATCC 42464中分離得到4個(gè)具有反式稠合十氫萘骨架的聚酮-氨基酸雜合化合物myceliothermophin A、B、E、F, 其中新化合物myceliothermophin F對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD-1、人肝癌細(xì)胞株Hep3B、人肝癌細(xì)胞株HepG2、人胃癌細(xì)胞株HGC-27有顯著抑制作用,半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.48、0.89、0.80、0.33 μg/mL。NOZAWA O等[18-19]從M.luteaTF-0409中分離得到2個(gè)新的δ-內(nèi)酯化合物Waols A、Waols B, 其具有廣譜體外細(xì)胞毒活性,對(duì)阿霉素耐藥人白血病細(xì)胞株HL-60/ADR、人白血病細(xì)胞株HL-60、小鼠白血病細(xì)胞株P(guān)388、人膀胱癌細(xì)胞株T-24、人宮頸癌細(xì)胞株Hela、人肺癌細(xì)胞株A549具有顯著抑制活性,IC50分別為0.1、0.2、4.0、0.5、1.0、1.0 μg/mL和0.2、0.2、4.0、0.5、1.0、1.0 μg/mL。此外, Waols A和Waols B僅對(duì)金黃色葡萄球菌有較弱的抑制活性。SMETANINA O F等[20]從庫(kù)頁(yè)灣(鄂霍次克海)海洋沉積物來(lái)源的真菌M.lutea中分離得到2個(gè)新化合物isoacremine D和acremine A, 其中acremine A在光作用下會(huì)轉(zhuǎn)化為spiroacremines A和spiroacremines B。這4個(gè)化合物對(duì)海膽精細(xì)胞具有體外細(xì)胞毒活性,濃度分別為40、50、15、30 μg/mL時(shí),能使海膽精子的受精能力下降50%; isoacremine D在200 μg/mL時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌活性,而acremine A、spiroacremines A和spiroacremines B對(duì)測(cè)試的革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌沒(méi)有抗菌活性。深入開(kāi)展Myceliophthora屬真菌的次生代謝產(chǎn)物研究,能夠?yàn)橥诰蛟搶僬婢幕瘜W(xué)多樣性和生物活性多樣性提供科學(xué)依據(jù),并為真菌資源的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

2014年,基于LC-MS/MS的GNPS平臺(tái)正式開(kāi)放使用,這是一個(gè)基于分子網(wǎng)絡(luò)和數(shù)據(jù)共享的信息平臺(tái),能幫助研究者快速識(shí)別天然化合物的分子特征,已成為研究微生物次級(jí)代謝組學(xué)的重要技術(shù)手段。本研究利用CMN對(duì)牡蠣共生真菌M.luteaML-1發(fā)酵液粗浸膏的化學(xué)成分進(jìn)行分析,共識(shí)別和預(yù)測(cè)出49個(gè)化合物,包括18個(gè)脂肪酸類化合物、8個(gè)蒽醌類化合物、12個(gè)環(huán)二肽類化合物和11個(gè)其他類化合物,其中可能有2個(gè)新二蒽醌類化合物,初步明確了該菌株的次生代謝產(chǎn)物譜。本研究進(jìn)一步利用FBMN進(jìn)行相對(duì)定量分析發(fā)現(xiàn)了真菌1號(hào)培養(yǎng)基的主要次生代謝產(chǎn)物,目前已識(shí)別出其中的3個(gè)化合物,該結(jié)果為后續(xù)化學(xué)成分的導(dǎo)向分離提供了思路,也為通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件提高微量化合物的產(chǎn)量提供了依據(jù)。但由于GNPS平臺(tái)收錄的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)有限,且可能存在新穎結(jié)構(gòu)成分,目前僅從M.luteaML-1發(fā)酵液中識(shí)別及預(yù)測(cè)出不足5%的節(jié)點(diǎn)分子,后續(xù)考慮將“種子化合物”與菌株發(fā)酵產(chǎn)物共同構(gòu)建分子網(wǎng)絡(luò),利用“種子化合物”的結(jié)構(gòu)線索幫助識(shí)別出更多化學(xué)成分,從而闡明菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物譜,為挖掘發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的藥物先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。