李思誠(chéng), 郭鶴鳴, 黃 韻, 劉翠平, 方 晨, 胡 吉

(1. 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科, 江蘇 蘇州, 215004;2. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院江蘇省臨床免疫學(xué)研究所/江蘇省臨床免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 蘇州, 215006)

1型糖尿病(T1DM)的特征是胰島β細(xì)胞的自身免疫破壞,導(dǎo)致胰島素缺乏和終身外源性胰島素依賴[1]。研究[2]表明, B細(xì)胞在自身免疫性糖尿病中發(fā)揮著不可替代的作用。B細(xì)胞消耗性抗體利妥昔單抗可延遲近期發(fā)病患者的T1DM進(jìn)展。程序性死亡受體配體1(PD-L1)被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的重要特征,其可通過(guò)與程序性死亡受體-1(PD-1)的直接相互作用調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[3]。研究[4]表明, PD-L1阻斷加速了非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的糖尿病發(fā)病,提示PD-L1在T1DM中具有關(guān)鍵的保護(hù)作用。本課題組既往研究[5]發(fā)現(xiàn),T1DM患者血清中的可溶性PD-L1水平降低。雖然B細(xì)胞的自身抗原遞呈被認(rèn)為可以啟動(dòng)自身免疫,但目前尚不清楚B細(xì)胞上的PD-L1是否參與了T1DM的發(fā)生。相關(guān)研究[6]表明,自身免疫性糖尿病患者循環(huán)中B細(xì)胞的頻率發(fā)生了改變。本研究深入探討這些B細(xì)胞,以期能更好地了解T1DM患者循環(huán)B細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1 樣本收集

本研究收集了2023年在蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的患者血樣。T1DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照參考文獻(xiàn)[7]。患者來(lái)自T1DM的各個(gè)階段(T1DM組,n=25)。選取年齡、性別與T1DM患者相匹配的健康人群(健康對(duì)照組,n=25)。此外,健康人群自述健康,并經(jīng)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)證實(shí)無(wú)糖尿病,所有糖尿病自身抗體陰性,同時(shí)除外炎癥、傳染病、癌癥或任何其他自身免疫性疾病。參與者知情并同意本研究。本研究已獲得蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 臨床指標(biāo)收集

記錄受試者的年齡、性別和病程等信息。檢測(cè)肌酐(Cr)、尿素(BUN)、尿酸(UA)、白蛋白/肌酐(ACR)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、空腹c肽(FCP)。采用放射配體法檢測(cè)胰島自身抗體[谷氨酸脫羧酶自身抗體(GADA)、胰島素瘤相關(guān)抗原2自身抗體(IA-2A)、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8自身抗體(ZnT8A) ]。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)

通過(guò)靜脈穿刺收集受試者4 mL外周血樣本,采集的真空管中含有EDTA抗凝。在50 μL全血中加入異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)、降鈣素原(PCT)和藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記的抗人單抗,并以相應(yīng)熒光標(biāo)記的IgG1或IgG2作為同型對(duì)照。具體標(biāo)色方案為: ① CD19-PE,PD-L1-FITC; ② CD19-PE,CD27-APC,PD-L1-FITC; ③ CD19-PE, CD5-APC, CD1d-PCT,PD-L1-FITC; ④ CD19-PE,CD21-APC, CD23-PCT, PD-L1-FITC。在室溫避光孵育30 min后,用Beckman Coulter OptiLyse C裂解液進(jìn)行紅細(xì)胞溶解和細(xì)胞固定。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后,取細(xì)胞懸液(500 μL/次),用COULTER Epics XL流式細(xì)胞儀(Beckman COULTER)檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 2組B細(xì)胞和B細(xì)胞亞群表達(dá)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD19+細(xì)胞(B細(xì)胞)。T1DM組和健康對(duì)照組的B細(xì)胞頻數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.08)。流式細(xì)胞術(shù)在外周血樣本中識(shí)別出6個(gè)主要的CD19+B細(xì)胞亞群: 幼稚B細(xì)胞(CD19+CD27+)、記憶B細(xì)胞(CD19+CD27+)、B10 (CD19+CD5+CD1d+)、邊緣區(qū)B細(xì)胞(MZB)(CD19+CD23-CD21+)、濾泡B細(xì)胞(FoB)(CD19+CD23+CD21-)和過(guò)渡性T2-邊緣區(qū)前體B細(xì)胞 (T2-MZP)(CD19+CD23+CD21+) 。T1DM組和健康對(duì)照組的B細(xì)胞亞群頻率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在T1DM患者中,B細(xì)胞亞群的頻率無(wú)系統(tǒng)性差異。見(jiàn)圖1。

A: B細(xì)胞; B: 記憶B細(xì)胞; C: 幼稚B細(xì)胞; D: B10細(xì)胞; E: MZB細(xì)胞; F: FoB細(xì)胞; G: T2-MZP細(xì)胞。

2.2 B細(xì)胞亞群上PD-L1的表達(dá)

與健康對(duì)照組的(14.06±5.72)相比, T1DM組CD19+細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)頻率為(6.51±3.92), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。T1DM組患者CD19+CD27+細(xì)胞上PD-L1表達(dá)為(13.43±10.45), CD19+CD27-細(xì)胞上PD-L1表達(dá)為(11.17±7.69); 健康對(duì)照組CD19+CD27+細(xì)胞上PD-L1表達(dá)為(23.57±9.81), CD19+CD27-細(xì)胞上PD-L1表達(dá)為(15.59±6.14)。T1DM組CD19+CD27+細(xì)胞、CD19+CD27-細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)頻率低于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)圖2、圖3。2組PD-L1在B10[T1DM組為(18.15±8.48), 健康對(duì)照組為(23.44±17.75),P=0.19]、MZB[T1DM組為(19.71±12.89), 健康對(duì)照組為(21.22±8.04),P=0.62]和FoB[T1DM組為(41.50±24.15), 健康對(duì)照組為(41.77±23.08),P=0.97]細(xì)胞上的頻率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T1DM組PD-L1在T2-MZP細(xì)胞中表達(dá)頻率(35.48±18.17)低于健康對(duì)照組(44.92±14.62), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048 6), 見(jiàn)圖4、圖5。

A: CD19+CD27+和CD19+CD27-細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的門(mén)控策略; B: T1DM組與健康對(duì)照組CD19+ CD27+細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)比較; C: T1DM組與健康對(duì)照組PD-L1在CD19+ CD27-細(xì)胞上的表達(dá)比較。

A: CD19+CD5+CD1D+細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的門(mén)控策略; B: T1DM組與健康對(duì)照組 CD19+CD5+CD1D+細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)比較。每個(gè)點(diǎn)代表個(gè)體PD-L1的比例。水平線表示平均值。

2.3 臨床特征與B細(xì)胞亞群PD-L1的相關(guān)性

T1DM患者的臨床特征見(jiàn)表1。MZB細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)與BUN呈正相關(guān)(P<0.01); FoB細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)與LDL水平呈負(fù)相關(guān)(P=0.016), 與HDL水平無(wú)相關(guān)性(P=0.268), 見(jiàn)表2。

表1 T1DM患者臨床特征

表2 B細(xì)胞亞群PD-L1水平與臨床特征之間的相關(guān)性

3 討 論

B細(xì)胞通過(guò)體液免疫直接發(fā)揮作用,并作為關(guān)鍵抗原提呈細(xì)胞在T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性糖尿病的啟動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮作用[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn), T1DM患者的胰島功能和血糖水平與B細(xì)胞亞群相關(guān)。自身免疫性糖尿病與抗PD-1/PD-L1抗體治療有關(guān),研究[10-11]表明T1DM患者CD4+T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)顯著降低,表明PD-1/PD-L1通路在T1DM中對(duì)破壞β細(xì)胞起關(guān)鍵作用。本研究旨在探討T1DM患者外周血中不同B細(xì)胞亞群上PD-L1的表達(dá)情況。本研究的主要發(fā)現(xiàn)為T(mén)1DM患者外周血B細(xì)胞,尤其是T2-MZP B細(xì)胞和記憶B細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)水平降低。

B細(xì)胞在T1DM發(fā)生發(fā)展中的重要性已經(jīng)在NOD小鼠中得到證實(shí),缺乏B細(xì)胞的NOD小鼠不會(huì)發(fā)生T1DM[12]。同樣,通過(guò)抗CD20單克隆抗體選擇性消耗B細(xì)胞,可防止糖尿病的發(fā)生[2]。提示B細(xì)胞在T1DM的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。B細(xì)胞亞群在免疫調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮了重要作用,調(diào)節(jié)性B細(xì)胞通過(guò)白細(xì)胞介素-10 (IL-10)依賴的方式調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答,在炎癥、感染和自身免疫性疾病中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[13]。MZB細(xì)胞和FoB細(xì)胞作為重要的抗原遞呈細(xì)胞,尤其是抗原特異性抗原遞呈細(xì)胞,能夠有效激活并促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖[14]。自身抗原通過(guò)Toll樣受體(TLR)激活B細(xì)胞,通過(guò)FasL誘導(dǎo)致病性T細(xì)胞凋亡,并通過(guò)分泌TGF-β抑制抗原遞呈細(xì)胞的功能來(lái)破壞免疫耐受。本研究發(fā)現(xiàn), CD19+B細(xì)胞頻率在T1DM組和健康對(duì)照組中無(wú)顯著差異,這與既往研究結(jié)果相一致。本研究中, B細(xì)胞亞群頻率在T1DM組和健康對(duì)照組中無(wú)顯著差異。有研究[9]表明,與健康對(duì)照組和2型糖尿病(T2DM)患者相比, T1DM或LADA患者M(jìn)ZB細(xì)胞百分比增加,FoB細(xì)胞百分比降低。研究人群數(shù)量不足可能是導(dǎo)致這種差異的原因。

本研究還關(guān)注了B細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)。PD-1/PD-L1在T細(xì)胞上的研究較多,在B細(xì)胞上的研究較少,但已知PD-1及其配體PD-L1可參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞功能[15]。一項(xiàng)研究[16]表明, Treg上PD-1上調(diào)需要B細(xì)胞上PD-L1的表達(dá),即B細(xì)胞通過(guò)PD-L1向Treg提供激活信號(hào),從而抑制免疫應(yīng)答。同時(shí), B細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)PD-L1的表達(dá),抑制自身免疫病中的炎癥反應(yīng),高表達(dá)PD-L1的B細(xì)胞通過(guò)減弱T細(xì)胞的活化和抗體的產(chǎn)生[17]而顯著抑制體液反應(yīng)。相反,缺乏PD-L1可能向T細(xì)胞提供抑制信號(hào),導(dǎo)致免疫應(yīng)答的激活。本研究發(fā)現(xiàn), T1DM患者CD19+B細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)低于健康對(duì)照組,提示PD-L1的表達(dá)減低,導(dǎo)致對(duì)免疫應(yīng)答的抑制減弱,進(jìn)而導(dǎo)致了T1DM的發(fā)生。除總B細(xì)胞(CD19+)外,本研究還評(píng)估了B細(xì)胞亞群上PD-L1的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),與健康對(duì)照組相比,初始B細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)無(wú)差異,但記憶性B細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)較低。已有研究[18]表明,記憶性B細(xì)胞比初始B細(xì)胞反應(yīng)更快、更劇烈。首先,記憶性B細(xì)胞比初始B細(xì)胞被更早招募進(jìn)入分裂,經(jīng)歷更多的分裂輪數(shù);其次,記憶B細(xì)胞具有更多細(xì)胞表面受體,如CD21、CD27和TACI, 這使得記憶B細(xì)胞能夠更快、更迅速地對(duì)共刺激信號(hào)做出反應(yīng)[19-20]; 再次,記憶性B細(xì)胞表達(dá)高水平的CD80和CD86, 這有助于向輔助性T細(xì)胞尋求幫助。因此提出以下假設(shè): 由于PD-L1的表達(dá)水平減低,使記憶B細(xì)胞在T1DM的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了更強(qiáng)的作用。

研究[21]表明,產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞(Breg)在T1DM的啟動(dòng)中發(fā)揮著不可或缺的作用。相關(guān)研究[22-23]在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中,發(fā)現(xiàn)分泌IL-10的B細(xì)胞表型為CD21+CD23+。Breg細(xì)胞可以通過(guò)增加PD-L1的表達(dá)來(lái)抑制自身免疫病中的炎癥反應(yīng)[17]。因此, Breg細(xì)胞上PD-L1表達(dá)的降低可能促進(jìn)自身免疫性糖尿病的炎癥反應(yīng)。本研究納入的B細(xì)胞亞群中,只有T2-MZP上的PD-L1表達(dá)降低。這表明抑制T1DM中炎癥的Breg可能是T2-MZP。探究B細(xì)胞亞群PD-L1水平與臨床特征之間的相關(guān)性時(shí),發(fā)現(xiàn)PD-L1在FoB細(xì)胞上的表達(dá)與LDL呈負(fù)相關(guān),與既往研究[24]中血糖、血脂與免疫細(xì)胞相關(guān)的結(jié)果一致。

綜上所述, T1DM患者B細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)頻率較健康對(duì)照組低。PD-L1可能在T1DM的發(fā)病中起保護(hù)作用。PD-L1高表達(dá)的B細(xì)胞可能為自身免疫性糖尿病的治療提供新的有效策略。但本研究存在一定局限,本研究未檢測(cè)到IL-10和TGFb等炎性細(xì)胞因子,因此無(wú)法直接探討PD-L1對(duì)B細(xì)胞功能的影響,還需進(jìn)一步深入研究。