趙帆 邵智利 尤小寒 焦建成 范麗莉 孫敏 孟靈芝 馬莉
(河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省兒童醫(yī)院 新生兒科,河北 石家莊 050031)
胎兒新生兒溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn,HDFN)是指母嬰血型不合而引起的胎兒和新生兒免疫性溶血病。 目前國(guó)際輸血協(xié)會(huì)確認(rèn)的人類紅細(xì)胞有378個(gè)抗原[1],ABO 和Rh 血型不合所引發(fā)的HDFN 最常見(jiàn),其他血型系統(tǒng)不合引起的HDFN 極為少見(jiàn)[2]。 HDFN 的診斷主要依賴于臨床表現(xiàn)及血清學(xué)檢測(cè),包括血型鑒定、溶血三項(xiàng)試驗(yàn),即直接抗人球蛋白試驗(yàn)(direct antiglobulin test,DAT,直抗試驗(yàn))、血清游離抗體試驗(yàn)(游離試驗(yàn))和紅細(xì)胞抗體釋放試驗(yàn)(釋放試驗(yàn))。 但溶血試驗(yàn)并不完全可靠,可能出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。 若不參考溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果,直接將存在血型不合的高膽紅素血癥患兒診斷為HDFN,可能會(huì)導(dǎo)致溶血病的過(guò)度診斷[3-4]。 因此其診斷標(biāo)準(zhǔn)始終存在爭(zhēng)議。 曾有學(xué)者指出ABO-HDFN 無(wú)論從臨床或?qū)嶒?yàn)室檢測(cè)的角度,均無(wú)法被充分定義[5]。
在膽紅素的代謝過(guò)程中,血紅素分解成膽紅素時(shí)會(huì)產(chǎn)生膽綠素、鐵,同時(shí)產(chǎn)生等當(dāng)量的一氧化碳(carbonic oxide,CO),因此自上世紀(jì)60 年代起即有研究采用測(cè)定內(nèi)源性CO增長(zhǎng)率評(píng)估溶血程度[6]。 內(nèi)源性CO 生成可通過(guò)呼氣末一氧化碳(end-tidal carbon monoxide,ETCO)及碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin,COHb)2 種方法測(cè)定。 有研究報(bào)道[7]在未獲得血清學(xué)結(jié)果的情況下,COHb 對(duì)于病因診斷、高膽紅素血癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及治療具有一定意義。 且與ETCO 相比,臨床上通過(guò)血?dú)夥治鰞x檢測(cè)COHb 水平相對(duì)更易獲得,但其應(yīng)用價(jià)值尚未被充分研究。 我們通過(guò)對(duì)臨床可疑溶血病的新生兒進(jìn)行回顧性分析,評(píng)估溶血三項(xiàng)、COHb 及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HDFN 的診斷價(jià)值,為臨床規(guī)范診療提供依據(jù)。
1.1 病例選擇及分組 選取2019 年1 月1 日—2022 年12月31 日于本院新生兒科收治的疑似新生兒溶血病并送血清學(xué)檢測(cè)的患兒,其中臨床診斷為HDFN 的患兒作為溶血組。納入標(biāo)準(zhǔn):1)存在母嬰血型不合,生后出現(xiàn)高膽紅素血癥,溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果判定為陽(yáng)性;2)存在母嬰血型不合,溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果判定為陰性,但生后出現(xiàn)高膽紅素血癥和(或)溶血性貧血等臨床表現(xiàn),排除其他原因引起的溶血病或肝膽疾病[8-10]。 選取無(wú)母嬰血型不合,但有黃疸表現(xiàn)而未達(dá)高膽紅素血癥光療標(biāo)準(zhǔn)、溶血三項(xiàng)試驗(yàn)判定為陰性、血清不規(guī)則抗體陰性、臨床排除HDFN 的患兒作為對(duì)照組。 排除標(biāo)準(zhǔn):1)非出生后首次就診;2)合并紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥(G-6-PD 缺乏癥)、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥等特殊類型溶血;3)有宮內(nèi)窘迫、產(chǎn)時(shí)窒息史,或異常出血(如顱內(nèi)出血、頭皮血腫、腎上腺出血)等影響血總膽紅素值的因素;4)入院時(shí)首次動(dòng)脈血?dú)夥治龃嬖诿黠@酸堿平衡紊亂。 本研究通過(guò)本院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(醫(yī)研倫審第202222-77 號(hào))。
1.2 方法 回顧性收集研究期間符合納入標(biāo)準(zhǔn)患兒的臨床及實(shí)驗(yàn)室資料,調(diào)查表內(nèi)容包括:1)一般臨床資料:患兒性別、胎齡、入院日齡、出生體重、喂養(yǎng)方式等;2)實(shí)驗(yàn)室資料:患兒血清總膽紅素(total serum bilirubin,TSB)、血紅蛋白(heamoglobin,Hb)、網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocyte,Ret)、COHb 等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(以上均為入院首日采集)、溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果,患兒及母親ABO、Rh 血型鑒定、Rh 血型分型、不規(guī)則抗體篩查結(jié)果。 COHb 通過(guò)血?dú)夥治鰞x(cobasb 221-6 型,德國(guó)羅氏診斷有限公司)檢測(cè)獲得。
1.3 研究中所用的定義 新生兒高膽紅素血癥[11]:對(duì)于胎齡≥35 周的新生兒,采用美國(guó)兒科學(xué)會(huì)推薦的小時(shí)膽紅素列線圖及光療/換血參考曲線作為診斷或干預(yù)標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)膽紅素水平超過(guò)第95 百分位時(shí)定義為高膽紅素血癥。
溶血三項(xiàng)試驗(yàn)判定HDFN[8]:僅釋放試驗(yàn)陽(yáng)性或任意2 項(xiàng)以上陽(yáng)性判為“可確診HDFN”;DAT 或游離試驗(yàn)單項(xiàng)陽(yáng)性判為“可疑HDFN”;DAT、游離試驗(yàn)和釋放試驗(yàn)3 項(xiàng)都陰性判為“不可證實(shí)為HDFN”。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 27.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料符合非正態(tài)分布的以M(P25,P75)表示,組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。 計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。 使用卡方趨勢(shì)檢驗(yàn)判斷變量之間是否有線性變化。 使用Spearman 相關(guān)檢驗(yàn)分析變量之間的相關(guān)性。 采用受試者工作(receiver operator characteristic,ROC)曲線分析各個(gè)及多項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷價(jià)值,通過(guò)控制混雜因素,建立logistic 回歸模型,形成聯(lián)合預(yù)測(cè)因子,再繪制ROC曲線,確定曲線下面積(area under the curve,AUC),分析最佳截?cái)嘀档撵`敏度、特異度,使用Delong 檢驗(yàn)比較不同指標(biāo)間AUC 差異。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 一般臨床資料 本研究溶血組共納入378 例臨床診斷HDFN 患兒,對(duì)照組共納入217 例排除HDFN 患兒。 依據(jù)患兒臨床表現(xiàn)及血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果,溶血組中有354 例(93.7%)確診為ABO-HDFN,24 例(6.3%)確診為Rh-HDFN,非ABOHDFN 不規(guī)則抗體篩查陽(yáng)性中,均未檢測(cè)出Rh 系統(tǒng)以外的特異性抗體。 溶血組及對(duì)照組在胎齡、出生體重、入院日齡、入院時(shí)TSB、Hb 水平、COHb、Ret 所占百分比方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),在男女性別構(gòu)成、順產(chǎn)、母乳喂養(yǎng)所占比例方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具體見(jiàn)表1。
表1 2 組患兒一般臨床資料比較
溶血組以足月兒為主,早產(chǎn)兒僅30 例(7.9%),無(wú)28 周以下早產(chǎn)兒,354 例(93.7%)為母嬰ABO 血型不合,24 例(6.3%)為Rh 血型不合。 溶血組全部接受了藍(lán)光治療,其中23 例(6%)接受了換血治療,47 例(12.4%)接受了靜注人免疫球蛋白治療。
2.2 溶血組溶血三項(xiàng)試驗(yàn)陽(yáng)性率與日齡的關(guān)系 在378 例臨床診斷HDFN 患兒中,日齡1 d 以內(nèi)的新生兒,溶血三項(xiàng)試驗(yàn)陽(yáng)性(僅釋放試驗(yàn)陽(yáng)性或任意2 項(xiàng)以上陽(yáng)性)檢出率最高,為88.5%(54/61),隨日齡增大,陽(yáng)性率也隨之降低,超過(guò)7 d時(shí)陽(yáng)性率最低,為44.4%(24/54)。 卡方趨勢(shì)檢驗(yàn)結(jié)果顯示日齡與溶血三項(xiàng)試驗(yàn)陽(yáng)性率之間存在線性相關(guān)性(χ2=26.921,P<0.001)。 見(jiàn)表2。
表2 不同日齡與溶血三項(xiàng)試驗(yàn)陽(yáng)性率
2.3 溶血組日齡與COHb 之間的關(guān)系 溶血組日齡與COHb 之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系,Spearman 相關(guān)系數(shù)rs=-0.434,P<0.001,表明隨著日齡的增加,COHb 值逐漸下降。 如圖1。
圖1 COHb 值隨日齡變化趨勢(shì)
2.4 溶血組患兒溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果 依據(jù)溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果,溶血組“確診”、“可疑”及“不能證實(shí)”的病例分別為264例(69.8%)、11 例(2.9%)、103 例(27.2%)。 溶血三項(xiàng)試驗(yàn)判定為可疑及不能證實(shí)的病例由臨床醫(yī)師依據(jù)臨床表現(xiàn)及排除其它潛在溶血因素后最終診斷。 DAT、游離試驗(yàn)、釋放試驗(yàn)單項(xiàng)陽(yáng)性率分別為36.0%(136/378)、55.6%(210/378)、69.0%(261/378),見(jiàn)表3。 對(duì)照組217 例患兒溶血三項(xiàng)試驗(yàn)及不規(guī)則抗體檢測(cè)結(jié)果均陰性,判定為非HDFN。
表3 378 例患兒溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果判斷
2.5 繪制ROC 曲線評(píng)估溶血三項(xiàng)、COHb 及二者聯(lián)合診斷HDFN 的價(jià)值 用SPSS 27.0 軟件繪制溶血三項(xiàng)、COHb 及二者聯(lián)合診斷HDFN 的ROC 曲線,賦值:臨床診斷為HDFN 以1 表示,非HDFN 以0 表示;溶血三項(xiàng)結(jié)果判定為“確診”用2表示,“可疑”用1 表示,“不能證實(shí)”用0 表示。 分別構(gòu)建溶血三項(xiàng)、COHb 及二者聯(lián)合的檢測(cè)因子模型,在用logostic 回歸構(gòu)造三種聯(lián)合因子時(shí),已把基線分析時(shí)有顯著差異的胎齡、出生體重、入院日齡等變量作為混雜因素加以控制,再進(jìn)行繪制ROC 曲線,分別確定溶血三項(xiàng)、COHb 及二者聯(lián)合檢測(cè)的AUC、最佳截?cái)嘀祵?duì)應(yīng)的靈敏度及特異度。 見(jiàn)圖2 及表4。
圖2 溶血三項(xiàng)、COHb 及二者聯(lián)合診斷HDFN 的ROC 曲線
表4 溶血三項(xiàng)、COHb 及二者聯(lián)合對(duì)HDFN 的診斷效能
取COHb 的ROC 曲線中最靠近左上角的一點(diǎn)(COHb≥1.15%)為最佳截?cái)嘀?,其靈敏度、特異度均低于溶血三項(xiàng)試驗(yàn),Delong 檢驗(yàn)比較溶血三項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)的AUC,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.727,P>0.05),提示COHb 與溶血三項(xiàng)試驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)并未顯著增加后者對(duì)HDFN 的診斷效能(表4)。
HDFN 是早期新生兒發(fā)生重度高膽紅素血癥最常見(jiàn)的因素[12],如未能早期及時(shí)的診斷和治療,可能引起膽紅素腦病,影響患兒遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后。 溶血三項(xiàng)試驗(yàn)是臨床常用的診斷試驗(yàn),但評(píng)估新型溶血指標(biāo)診斷價(jià)值的研究仍在不斷開(kāi)展[13]。 本研究通過(guò)對(duì)疑似溶血病患兒進(jìn)行回顧性分析,評(píng)估溶血三項(xiàng)試驗(yàn)、COHb 及二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于HDFN 的診斷價(jià)值,以提高診斷準(zhǔn)確性。
溶血診斷試驗(yàn)的送檢時(shí)間。 關(guān)于溶血三項(xiàng)試驗(yàn)的檢測(cè)時(shí)間,文獻(xiàn)中并未做統(tǒng)一推薦,國(guó)內(nèi)多數(shù)機(jī)構(gòu)會(huì)在新生兒出現(xiàn)黃疸癥狀后才去送檢。 本研究發(fā)現(xiàn)在納入的HDFN 患兒中,送檢日齡越早,溶血三項(xiàng)試驗(yàn)陽(yáng)性檢出率越高,提示送檢時(shí)間晚可能是溶血三項(xiàng)試驗(yàn)出現(xiàn)假陰性結(jié)果的原因之一。由于隨著生后日齡的延長(zhǎng),致敏的紅細(xì)胞在肝臟和脾臟中逐漸被破壞,游離的IgG 抗體逐漸消失,其他IgG 抗體則以抗原抗體復(fù)合物形式存在,失去反應(yīng)原性而可能出現(xiàn)陰性結(jié)果[14]。 何柏霖等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律,在2 208 例疑似溶血病患兒中2 d 內(nèi)的陽(yáng)性檢出率達(dá)60%以上,隨著送檢日齡增加,陽(yáng)性檢出率逐漸下降,在7 d以后降至27.79%。國(guó)內(nèi)有學(xué)者[16]通過(guò)對(duì)800 余例高膽紅素血癥新生兒的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)COHb 值隨日齡增加而逐漸下降,本研究也發(fā)現(xiàn)COHb 與生后日齡呈負(fù)相關(guān)。 提示對(duì)于存在溶血風(fēng)險(xiǎn)的患兒,無(wú)論黃疸程度如何,生后應(yīng)盡早送檢溶血三項(xiàng)試驗(yàn)和/或COHb 檢測(cè),以提高診斷準(zhǔn)確性,及時(shí)給予干預(yù)。 在美國(guó)兒科學(xué)會(huì)2022 年頒布的新生兒高膽紅素血癥管理指南中也推薦對(duì)于母親孕期未做抗體篩查和抗體篩查陽(yáng)性的新生兒生后應(yīng)盡早完善DAT 和血型檢測(cè)[11]。
溶血三項(xiàng)試驗(yàn)的檢測(cè)意義。 DAT 和釋放試驗(yàn)均是檢測(cè)致敏紅細(xì)胞上的血型抗體相關(guān)試驗(yàn),游離試驗(yàn)則是檢測(cè)血漿中的血型抗體。 游離試驗(yàn)陽(yáng)性說(shuō)明病情可能會(huì)持續(xù),對(duì)溶血病確診和疾病嚴(yán)重程度的判斷有輔助作用[17]。 在國(guó)外,DAT被認(rèn)為是識(shí)別疑似HDFN 的重要試驗(yàn),在溶血病的診斷檢查中起著核心作用[18]。 通常來(lái)講DAT 陽(yáng)性程度越強(qiáng),意味著病情越重。 但文獻(xiàn)[9]提出DAT 陽(yáng)性不能完全診斷HDFN,釋放試驗(yàn)才是HDFN 診斷的重要依據(jù),且因使用的標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞試劑事先經(jīng)過(guò)加酶處理,吸附抗體能力增強(qiáng),因此靈敏度會(huì)更高[19]。 本研究也發(fā)現(xiàn)溶血病例中釋放試驗(yàn)陽(yáng)性率最高,達(dá)69.0%,顯著高于DAT 陽(yáng)性率(36.0%),溶血三項(xiàng)結(jié)果中大多是釋放試驗(yàn)陽(yáng)性伴DAT 和(或)游離試驗(yàn)陽(yáng)性,而僅DAT 和(或)游離試驗(yàn)陽(yáng)性而釋放試驗(yàn)陰性的情況很少。 出現(xiàn)這種情況時(shí)臨床醫(yī)師需要和檢驗(yàn)科醫(yī)師溝通,必要時(shí)需要重復(fù)檢測(cè),以防止因受實(shí)驗(yàn)室操作因素而出現(xiàn)釋放試驗(yàn)假陰性的情況。
本研究中,有部分溶血三項(xiàng)試驗(yàn)均為陰性患兒臨床醫(yī)生也將其診斷為HDFN。 可能的原因包括:1)送檢時(shí)間過(guò)于晚,溶血病輕癥患兒可能僅表現(xiàn)輕度黃疸,易被歸為生理性黃疸,有些則僅表現(xiàn)為晚期貧血,錯(cuò)過(guò)最佳檢測(cè)時(shí)機(jī);2)采血困難,采血不順利或未采集足量靜脈血;3)與檢測(cè)方法有關(guān),微柱凝膠卡和固相測(cè)試分析優(yōu)于常規(guī)試管法,此外人工操作、離心速度、時(shí)間控制不佳、標(biāo)本存放環(huán)境影響等也可導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陰性。 因此HDFN 診斷最終應(yīng)綜合臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果[9]。 對(duì)于有母嬰血型不合且溶血三項(xiàng)試驗(yàn)均陰性的患兒,在出現(xiàn)明顯黃疸時(shí),臨床醫(yī)生需甄別有無(wú)同種免疫性溶血病以外的原因,如G-6-PD 缺乏、紅細(xì)胞膜缺陷,或與基因缺陷相關(guān)的Gilbert 綜合征等。 籠統(tǒng)將存在血型不合和黃疸的患兒診斷為HDFN 容易漏掉真正的病因。
根據(jù)人體溶血機(jī)制,衰老的紅細(xì)胞破壞產(chǎn)生血紅素,以等摩爾比轉(zhuǎn)化為膽綠素和CO。 膽綠素在還原酶作用下進(jìn)一步還原為膽紅素。 在此過(guò)程中產(chǎn)生的CO 與血紅蛋白結(jié)合形成COHb,經(jīng)血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)到肺,隨后通過(guò)呼吸排出[20]。 根據(jù)2022 年美國(guó)兒科學(xué)會(huì)最新指南,推薦通過(guò)測(cè)量ETCO 來(lái)進(jìn)行溶血的識(shí)別[11]。 ETCO 檢測(cè)既往不易在臨床廣泛使用,近年來(lái)美國(guó)Capnia 公司研發(fā)出1 種通過(guò)鼻導(dǎo)管測(cè)量的新型儀器,小巧便捷,可應(yīng)用于臨床[21],但因耗材價(jià)格較昂貴,尚未廣泛普及。 血液COHb 測(cè)定方法相對(duì)較多,包括CO-血氧分析法、氣相色譜法、分光光度計(jì)法等。 血?dú)夥治鰞x測(cè)定血液COHb 操作簡(jiǎn)單快速,對(duì)于住院新生兒,可作為呼出氣CO 含量的替代方法[22]。 本研究中,溶血組COHb 值高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 以COHb≥1.15%為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn),診斷靈敏度優(yōu)于單項(xiàng)DAT,但低于溶血三項(xiàng)試驗(yàn),且聯(lián)合檢測(cè)并未顯著增加后者的診斷效能。 說(shuō)明COHb 對(duì)HDFN 有一定診斷價(jià)值,但仍應(yīng)以溶血三項(xiàng)試驗(yàn)作為主要診斷方法,僅在醫(yī)療機(jī)構(gòu)不能開(kāi)展溶血試驗(yàn)或ETCO 檢查情況下,才適于將COHb 作為HDFN 的1 個(gè)早期篩查及輔助診斷指標(biāo)。
本研究系回顧性研究,未能收集到母親產(chǎn)前血清抗體效價(jià)檢測(cè)率及水平,不能分析其與生后溶血發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系;研究期間送檢血清學(xué)檢測(cè)的患兒中,診斷HDFN 者偏多,對(duì)照組例數(shù)偏少,本研究中并未觀察到溶血組HGB 水平較對(duì)照組減低,可能與此有關(guān)。 可進(jìn)一步擴(kuò)大及匹配2 組標(biāo)本量,提高數(shù)據(jù)代表性。
綜上所述,溶血三項(xiàng)試驗(yàn)對(duì)HDFN 的診斷有重要價(jià)值,其中釋放試驗(yàn)靈敏度最高。 COHb 對(duì)HDFN 有一定診斷價(jià)值,診斷靈敏度高于單項(xiàng)DAT,但聯(lián)合檢測(cè)并未顯著增加溶血三項(xiàng)試驗(yàn)的診斷效能。 在不能開(kāi)展溶血三項(xiàng)試驗(yàn)和ETCO的機(jī)構(gòu),COHb 可作為早期篩查和輔助診斷的1 個(gè)指標(biāo)。 無(wú)論是溶血三項(xiàng)試驗(yàn)還是COHb,對(duì)于有溶血風(fēng)險(xiǎn)的新生兒,均應(yīng)早期送檢以提高診斷準(zhǔn)確性。
利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。