李慧宇 崔彤 李詩佳 周士源 朱文娟 李靜 馬驍 吳小津

(國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心蘇州大學附屬第一醫(yī)院 江蘇省血液研究所國家衛(wèi)生健康委員會血栓與止血重點實驗室，江蘇 蘇州 215006)

急性淋巴細胞白血病(Acute lymphocytic leukemia，ALL)是1 種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以淋巴細胞惡性增殖為特點。 異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是惡性血液腫瘤的重要治療手段，接受allo-HSCT 的患者因移植前長期激素治療、免疫抑制、術后粒缺期長、留置導管等原因，易合并血流感染，以及各種病毒尤其是CMV、EBV 等的感染。 allo-HSCT 后免疫重建與臨床預后密切相關[1-2]，免疫監(jiān)測和免疫調控治療是未來的發(fā)展方向。 淋巴細胞是構成人體免疫系統(tǒng)的主要細胞，血液系統(tǒng)腫瘤患者在病程中免疫微環(huán)境發(fā)生一定變化，影響免疫細胞的產生、增殖及分化，同時異常的淋巴細胞亞群影響患者的預后，多項研究提示CD4＋T 淋巴細胞、CD8＋T 淋巴細胞、NK 細胞在allo-HSCT 后可能影響患者aGVHD、復發(fā)等治療結局[3-6]。 ALL 患者預后差，生存期短，早期、積極的監(jiān)測免疫重建情況可能有利于預測患者移植后合并癥發(fā)生情況。 我們旨在分析接受allo-HSCT 的ALL 患者移植術后早期免疫重建的情況及并發(fā)癥發(fā)生情況。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2018 年12 月至2022 年2 月本院接受allo-HSCT 的99 名ALL 患者，隨訪時長為移植后1 年。

1.2 方法

1.2.1 干細胞的動員及采集 供體接受重組人粒細胞集落刺激因子(rh G-CSF)5μg/kg bid 皮下注射，連續(xù)注射5 d，d 5在全身麻醉下采集骨髓，或接受rh G-CSF 動員5 d 后采集外周血干細胞。 光學顯微鏡計數采集物中單個核細胞數，流式細胞儀檢測采集物中CD34＋細胞數。

1.2.2 預處理方案 改良BUCY 為主的預處理:司莫司汀(Me CCNU) 250 mg/m2·d，－10 d；羥基脲(Hu) 40mg/kg，q12h，－10 d；阿糖胞苷(Ara－C) 2g/m2·d，－9，－8 d；馬利蘭(Bu) 0.8mg/kg，q6h，－7，－6，－5 d；環(huán)磷酰胺(CTX) 1.8g/m2·d，－4，－3 d；－2、－1 d 休息，0 d 回輸造血干細胞。

1.2.3 HSCT 期間移植物抗宿主病(GVHD)的預防 采用環(huán)孢素A(cyclosporin A，CSA)、麥考酚嗎乙酯(MMF)及短程甲氨喋呤(methotrexate，MTX)預防GVHD。 親緣同胞全相合HSCT 者不用MMF。 HLA 不全相合的親緣及無關供體全相合移植患者，預處理過程中加抗胸腺細胞球蛋白(ATG)、預防GVHD。

1.2.4 感染預防及治療 所有患者入倉前均備皮并予藥浴，環(huán)丙沙星腸道準備，移植預處理及造血重建前，均住百級層流病房，無菌飲食。 患者移植前予更昔洛韋預防病毒激活，入倉后密切觀察體溫等指標，發(fā)現感染征象時，立即予血培養(yǎng)，同時經驗性予抗生素治療。 發(fā)生敗血癥即血培養(yǎng)陽性者根據藥物敏感調整抗菌藥物，并定期復查轉陰。 對于既往有侵襲性真菌感染的患者，在患者血象下降時開始使用伊曲康唑針劑進行二次預防，直至血象恢復。

1.2.5 支持治療 當血小板計數＜20×109/L 時輸注血小板懸液，血紅蛋白濃度＜60 g/L 時輸注紅細胞懸液。 如供受者血型相合，則輸注同型血制品，如血型不合，則輸洗滌去白“O”型紅細胞懸液及輻照“AB”型血小板懸液。 患者預處理及造血干細胞輸注過程中，予水化堿化，注意出入量平衡，必要時予速尿利尿。

1.3 淋巴細胞亞群檢測 收集患者移植前(預處理前1 ～3周內)及移植后30 d、60 d、90 d 外周血，采用流式細胞技術分別檢測移植前，移植后30 d、60 d、90 d 的CD3＋T， CD3＋CD4＋T， CD3＋CD8＋T， CD3＋CD19＋B 細胞及CD3－CD16＋CD56＋NK 細胞比例。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 26.0 及R 語言統(tǒng)計軟件進行，圖像繪制應用prism 8.0 軟件完成。 計量資料用中位數(范圍)或中位數[P25；P75]表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗，Kaplan-Meier 用于計算總生存(overall survival，OS)率和無病生存(disease free survival，DFS)率，競爭風險模型用于計算復發(fā)率和非復發(fā)死亡率(non-relapse mortality，NRM)。 因素分析利用Cox 回歸及Logistic 回歸分析。 以P＜0.05 為有統(tǒng)計學差異，P＜0.01 為有顯著性統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 臨床特征和臨床結果 共收集99 名ALL 患者，患者臨床特征見表1。 粒系中位植入時間11(8～28)d，巨核系中位植入時間14(10～120)d。 11 例患者在移植后30 d 內發(fā)生血流感染(BSI)，累積發(fā)生率為11.10%，其中8 名感染菌種為肺炎克雷伯菌，3 名為銅綠假單胞菌。 移植后100 d 內，40 名患者感染CMV，累積發(fā)生率為40.40%。 7 名患者感染EBV，累積發(fā)生率為7.10%。 22 名患者發(fā)生急性移植物抗宿主病(aGVHD)，累積發(fā)生率22.30%。 移植后1 年內發(fā)生廣泛慢性移植物抗宿主病(cGVHD) 患者14 名，累積發(fā)生率16.20%。 13 名患者在移植后1 年內復發(fā)，1 年累積復發(fā)率13.84%。 9 名患者死亡，2 名為復發(fā)后死亡，7 名為非復發(fā)死亡，非復發(fā)死亡事件主要為器官功能衰竭(n＝5)、細菌感染(n＝2)。 所有患者1 年累積無病生存率(DFS)為80.60%，1 年總生存(OS)為90.30%。

表1 患者臨床特征 (n，%)

2.2 淋巴細胞亞群免疫重建 以我國九省健康成人淋巴細胞檢測參考區(qū)間中的中位數為對照[7]，我們比較了移植前和移植后30 d，60 d 和90 d 淋巴細胞亞群比例的變化，ALL 的患者移植前CD4＋T 淋巴細胞比例中位數33.58% [24.44%；41.46%]，顯著低于正常人群36.66% [24.01%；49.05%]，CD8＋T 淋巴細胞比例中位數46.34% [34.03%；61.86%]高于正常人群25.40% [15.71%；38.24%]，CD4＋/CD8＋比值中位數0.7294 [0.460 4；1.017 9] 低于正常人群1.531 6[1.315 3；1.760 1]，CD16＋CD56＋NK 比例中位數10.25%[5.65%；14.25%] 也低于正常人群18.37% [6.37%；34.83%]。 相對于移植前，CD4＋T 淋巴細胞比例在移植后30、60、90 d 均下降(P＜0.01)，CD8＋T 淋巴細胞比例在移植后30 d 下降(P＜0.01)，在移植后90 d 上升(P＜0.05)，移植后60 d 差異無統(tǒng)計學意義，CD4＋/CD8＋比值在移植后30、60、90 d 均下降(30 d，P＜0.05；60、90 d，P＜0.01)，CD16＋CD56＋NK 細胞比例在移植后30、60、90 d 均升高(P＜0.01)，見圖1。

圖1 患者淋巴細胞亞群變化

2.3 移植后各事件發(fā)生與淋巴細胞免疫重建 我們比較了移植后30 d，60 d，90 d 各時間點淋巴細胞亞群重建與100 d內aGVHD，CMV，EBV 等并發(fā)癥的相關性，發(fā)現CD4＋/CD8＋比值與aGVHD 的發(fā)生正相關(OR 1.21，95CI 1.01～1.45，P＜0.05)。 移植前及移植后30 d，無BSI 發(fā)生組CD16＋CD56＋NK 細胞絕對計數高于BSI 組，P＜0.05；移植后60 d 和90 d，CMV 組CD4＋T 細胞絕對計數均低于無CMV 感染組，P＜0.05。 同時，移植后90 d，CMV 組CD4＋/CD8＋T 細胞比值低于無CMV 感染組，P＜0.05。 Cox 回歸分析顯示，移植后60 d較高水平的CD4＋T 細胞是發(fā)生100 d 內CMV 感染的保護性因素(HR 0.91， 95CI 0.84～0.99，P＜0.05)。

3 討論

ALL 的發(fā)生、發(fā)展和轉歸與其患者機體的免疫功能，尤其是細胞免疫功能密切相關[8-9]。 淋巴細胞是構成人體免疫系統(tǒng)的主要細胞，根據細胞表面的標記物和功能可以分為許多不同的群體。 臨床上常用流式細胞術對外周血中的不同群體的淋巴細胞進行鑒別和計數，包括CD3＋T 淋巴細胞，CD4＋輔助/誘導T 淋巴細胞，CD8＋抑制/殺傷T 淋巴細胞，CD19＋B 淋巴細胞，CD16＋CD56＋NK 淋巴細胞等。 ALL 患者在疾病發(fā)展中，免疫微環(huán)境隨之發(fā)生一定變化，疾病的多種因素會影響免疫細胞的產生、增殖及分化，使外周血的淋巴細胞數量與功能產生異常[10]，導致免疫功能失調[11]。

Allo-HSCT 是ALL 患者重要的治療手段，目前廣泛應用于臨床。 異基因造血干細胞移植預后依賴于造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的恢復，其中免疫系統(tǒng)的恢復包括免疫細胞數量的恢復和功能的重建。 移植后粒系和巨核系容易獲得成功植入，但是移植后免疫活性細胞的重建遲于造血重建，同時受到受者基本情況、干細胞來源、預處理方案等多重因素的影響。移植后非特異性免疫細胞恢復最早，其中NK 細胞一般移植后2～3 周即可恢復[12]，而特異性免疫細胞重建相對滯后，CD8＋T 淋巴細胞一般移植后1 ～3 月逐漸恢復，CD4＋T 淋巴細胞恢復通常需1 年以上，CD19＋B 淋巴細胞移植后恢復時間不定，短至3 個月，長至1 年半以上[13]。 本研究中主要檢測了90 d 內的淋巴細胞亞群，CD19＋B 細胞在移植后90 d 內呈現持續(xù)低水平，沒有辦法做統(tǒng)計分析。

NK 細胞屬于機體固有免疫系統(tǒng)，其功能依賴活化受體和抑制受體調節(jié)活性而非抗原提呈過程，故可以早于適應性免疫發(fā)生作用。 NK 細胞是allo-HSCT 后最早恢復的細胞可能與其發(fā)育成熟依賴骨髓微環(huán)境而并非胸腺有一定關系[14]。 研究提示NK 細胞功能異常與腫瘤復發(fā)及病毒感染有關[15-16]，同時對于慢性感染患者具有保護作用[17-18]。 NK細胞與感染發(fā)生密切相關，可對于真菌、結核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、炭疽桿菌或傷寒沙門菌等革蘭陽性和革蘭陰性細菌產生直接殺傷[19-21]。 在造血干細胞移植過程中，NK 細胞移植后早期恢復有利于鞏固移植物的植入，減少GVHD，并發(fā)揮移植物抗白血病(GVL)作用[22]。 Huttunen 等[23]研究發(fā)現經allo-HSCT 治療的患者中，移植32 d NK 細胞數量達到＞120/μL 水平者在移植后3 年內具有較高的PFS、較低復發(fā)率和移植相關死亡率。 在本研究中，未發(fā)生BSI 組在移植前和移植后30 d CD16＋CD56＋NK 細胞計數高于BSI 組，P＜0.05。ALL 患者由于長期使用廣譜抗生素、移植后長時間處于粒缺期、留置多個導管等因素，移植后易合并血流感染。 作為天然免疫的重要組成部分，NK 細胞在早期防御感染方面具有重要的作用，缺乏功能性NK 細胞的患者相對于NK 細胞功能正常的患者更易于感染，如本研究所示，BSI 組患者移植前CD16＋CD56＋NK 細胞計數較未發(fā)生BSI 組顯著偏低，更低的NK 細胞水平意味著患者早期防御能力較差，提示患者移植后有更大的可能合并BSI。

T 淋巴細胞按照其表面標志的不同，可分為CD4＋輔助/誘導T 淋巴細胞，CD8＋抑制/殺傷T 淋巴細胞等亞群。 對外周血CD4＋、CD8＋T 淋巴細胞進行檢測可以反映患者免疫功能發(fā)生的改變，輔助診斷腫瘤和機會性感染等的發(fā)生。CD4＋、CD4＋/CD8＋比值減小與惡性腫瘤的發(fā)生、病毒感染有關。 ALL 患者allo-HSCT 后常常免疫功能低下，潛伏的CMV可能會重新被激活引起活動性感染，同時因非血緣造血干細胞和單倍體移植預處理中常規(guī)應用ATG，ATG 具有抑制T 淋巴細胞實現GVHD 效應的作用[24]，但同時無法避免的影響免疫功能恢復，從而導致移植后患者抗病毒感染能力減弱。CMV 在感染患者機體后通過分泌毒性物質促進抑制免疫效應性和輔助性細胞因子，一方面可阻滯調節(jié)性T 細胞增殖，促使其減弱對免疫細胞的調節(jié)作用[25]。 另一方面可間接阻滯活性因子對T 淋巴細胞CD3＋和CD4＋亞群的激活作用，導致機體T 細胞分化成熟時出現異常，促使機體CD3＋和CD4＋T 淋巴細胞亞群的水平下降，進一步導致其對機體免疫功能的效應與輔助作用減弱，減輕機體殺傷性免疫細胞對CMV的殺傷作用[26]。 本研究中移植后60 d 和90 d， CMV 組CD4＋T 細胞絕對計數均低于無CMV 感染組，差異有統(tǒng)計學意義，多因素分析移植后60 d 較高水平的CD4＋T 細胞是發(fā)生100 d 內CMV 感染的保護性因素。 因此，移植后低水平CD4＋T 細胞患者或需加強CMV 感染的預防與管理。

GVHD 是allo-HSCT 患者需要面臨的重要挑戰(zhàn)。 發(fā)生GVHD 的患者移植相關死亡率大幅上升，是否能及時判斷GVHD 的發(fā)生并能進行搶先治療大大影響移植成敗。 高炎癥狀態(tài)是GVHD 的主要特點，有學者提出具有負調控炎癥反應功能的Treg 細胞隨GVHD 等級的增加呈下降趨勢，有望成為預測急、慢性GVHD 的特異性指標[27-28]。 本研究中，根據是否合并急慢性GVHD 分組比較患者的淋巴細胞亞群，2組患者在CD4＋T、CD8＋T 及CD16＋CD56＋NK 細胞差異無明顯統(tǒng)計學意義，不排除與隨訪時間較短和病例數較少有關。此外，本研究發(fā)現，移植后30 d CD4＋/CD8＋比值與aGVHD 的發(fā)生正相關(OR 1.21，95CI 1.01～1.45，P＜0.05)，提示移植后T 淋巴細胞重建可能影響aGVHD 的發(fā)生。 CD4＋/CD8＋比值是判斷機體免疫功能的1 項重要臨床指標，既往研究已證實CD4＋T 淋巴細胞和CD8＋T 淋巴細胞參與GVHD 的發(fā)生，但細胞亞群調節(jié)的具體機制有待臨床進一步證實。

機體的免疫應答與淋巴細胞亞群之間的相互協(xié)作和相互制約關系密切。 免疫功能失調一方面可使機體發(fā)生感染，另一方面可導致自身免疫性疾病和超過敏反應。 T 淋巴細胞重建可能與移植后CMV 感染的發(fā)生相關，有助于早期識別臨床CMV 感染。 更低的NK 細胞水平意味著患者早期防御能力較差，提示患者移植后有更大的可能并發(fā)BSI。 對于欲行異基因造血干細胞移植治療的ALL 患者來說，淋巴細胞亞群水平監(jiān)測尤為重要[23，29]，動態(tài)監(jiān)測淋巴細胞亞群水平可評估患者整體免疫功能水平，有利于移植后并發(fā)癥的監(jiān)測。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。