劉彩霞, 李 剛, 梁玲瑜, 韓富忠, 王 正, 王慧敏, 呂 全,*

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所, 國家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點實驗室, 北京 100091;2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市烏拉特前旗森林病蟲害防治檢疫站, 巴彥淖爾 015006;3. 青海省黃南州麥秀林場, 黃南 811300; 4. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 泰安 271018)

昆蟲共生微生物是一個較為龐大的生物群體,包含細(xì)菌、真菌、古菌、病毒及小型原生生物(王渭霞等, 2021; 張娜等, 2022)。共生微生物為昆蟲的生長、發(fā)育和繁殖等提供營養(yǎng)資源(Klepzig and Wilkens, 1997; Guevara-Rozoetal., 2020),在調(diào)節(jié)昆蟲宿主化學(xué)信息交流與新陳代謝(Zhaoetal., 2019b),幫助昆蟲解毒有害物質(zhì)(Waterworthetal., 2020; Xuetal., 2022),保護(hù)其免受病原物危害(Zhouetal., 2016; Rangeretal., 2018)等方面有不可或缺的作用。小蠹蟲作為針葉林中危害較為嚴(yán)重的害蟲之一,與真菌和細(xì)菌等微生物形成了密切的共生關(guān)系(Linnakoskietal., 2012)。該類害蟲可通過體外共生的模式,如體表的特殊結(jié)構(gòu)(貯菌器) (Klepzig and Wilkens, 1997; Wangetal., 2013)或凹陷處(Kostovciketal., 2015)攜帶和傳播共生菌。如由微囊目(Microascales)和長喙殼目(Ophiostomatales)組成的長喙殼類真菌是小蠹蟲體表最主要的類群之一,該類真菌為小蠹蟲整個生活史提供發(fā)育所需的碳源、氮源和甾醇等營養(yǎng)資源(Guevara-Rozoetal., 2020),也在防御性化合物等有害物質(zhì)降解方面起重要作用(DiGuistinietal., 2011; Vanderpooletal., 2018)。除了上述體外共生菌,昆蟲腸道共生菌也可以協(xié)助宿主獲得必需的營養(yǎng)物質(zhì),從而影響小蠹蟲的生長發(fā)育,如腸道分離出的酵母可以為根大小蠹Dendroctonusrhizophagus發(fā)育提供食物來源(Briones-Robleroetal., 2017),還有一些腸道共生微生物可以產(chǎn)生降解萜烯類(Adamsetal., 2013)、酚類(Zhaoetal., 2019a)、生物堿(Ceja-Navarroetal., 2015)、纖維素和半纖維素(Briones-Robleroetal., 2017)等相關(guān)酶來解毒植物防御性化合物。因此,體表和腸道微生物均在小蠹蟲生長發(fā)育以及定殖過程發(fā)揮著不可或缺的作用。

目前,基于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、聯(lián)合基因標(biāo)記以及高通量測序技術(shù)對小蠹蟲蟲體、坑道和腸道共生微生物群落結(jié)構(gòu)與組成及物種多樣性進(jìn)行了廣泛的研究(Changetal., 2019; Chakrabortyetal., 2020a; Wangetal., 2020, 2021)。由于自然界約80%～90%的微生物無法利用傳統(tǒng)方法進(jìn)行分離培養(yǎng)(MsangoSokoetal., 2020),特別是與小蠹蟲長期協(xié)同進(jìn)化形成共生關(guān)系的微生物類群絕大多數(shù)屬于不可培養(yǎng),而共生微生物的功能研究可為微生物間的相互作用以及二者協(xié)同進(jìn)化提供深入認(rèn)知。因此,研究非可培養(yǎng)微生物群落構(gòu)成與功能是必不可少的(Hernández-Garcíaetal., 2017; 韓一多等, 2019; 王渭霞等, 2021)。目前,在中歐山松大小蠹Dendroctonusponderosae及坑道富含有降解萜烯類化合物相關(guān)的功能細(xì)菌假單胞桿菌屬Pseudomonas(Adamsetal., 2013)、咖啡果小蠹Hypothenemushampei降解咖啡因機制的功能菌假單胞菌目(Pseudomonadales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales) (Ceja-Navarroetal., 2015; Vegaetal., 2021)、紅脂大小蠹Dendroctonusvalens營養(yǎng)物質(zhì)降解的功能細(xì)菌沙雷氏菌屬Serratia和歐文氏菌屬Erwinia(Zhouetal., 2016; Liuetal., 2022)以及降解淀粉、酯酶類和木聚糖營養(yǎng)的根大小蠹D.rhizophagus功能菌假單胞菌屬、拉恩氏菌屬Rahnella和假絲酵母屬Candida(Briones-Robleroetal., 2017)等展開研究,為深入探究小蠹蟲對營養(yǎng)資源的利用、萜類等防御性有毒物質(zhì)的降解機制以及共生微生物間的互作提供潛在資源。目前,小蠹蟲關(guān)鍵微生物功能已有一定的研究,但還沒有詳細(xì)的闡明(Hernández-Garcíaetal., 2017; Mayersetal., 2020)。

光臀八齒小蠹Ipsnitidus隸屬于鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)小蠹亞科(Scolytinae)齒小蠹屬Ips,是中國特有物種,僅分布于中國青藏高原及其周邊的高海拔地區(qū)(Jaku?etal., 2010; 王正等, 2021)。該害蟲主要危害青海云杉Piceacrassifolia和川西云杉Picealikiangensisvar.balfouriana的風(fēng)倒木、衰弱木和瀕死木等,大暴發(fā)時可危害健康樹木,嚴(yán)重影響該地區(qū)森林生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和工業(yè)木材的生產(chǎn)(Liuetal., 2008; 薛永貴, 2008; Jaku?etal., 2010)。目前尚未見光臀八齒小蠹共生微生物群落組成和功能的報道。昆蟲共生微生物的研究,目前多數(shù)工作是分別對腸道和體表微生物群落開展的,很少有對二者進(jìn)行直接比較分析。本研究采用宏基因組學(xué)方法對光臀八齒小蠹的腸道和其他組織共生真菌和細(xì)菌群落進(jìn)行分析,旨在明確小蠹蟲共生菌群落組成與多樣性;通過比較腸道和其他組織共生真菌和細(xì)菌在不同分類水平和功能基因上的差異,以此確定腸道共生菌的物種和功能基因是否較其他組織更加豐富;篩選出與營養(yǎng)合成和萜烯類降解相關(guān)的功能基因以及相關(guān)酶并注釋這些基因所在物種的分類地位,以此來預(yù)測這些相關(guān)基因的功能菌;通過腸道和其他組織共生真菌和細(xì)菌的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析,以此來解析昆蟲-共生微生物間復(fù)雜的共生關(guān)系,從而為森林病蟲害防治提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

光臀八齒小蠹樣本于2020年采自青海省黃南麥秀自然保護(hù)區(qū)(35°19′39″N, 101°56′10″E),將青海云杉同一樹段剝?nèi)〕龅某上x放入透氣的2 mL無菌離心管, 液氮速凍, 蟲體共計210頭。并于-80 ℃低溫冰箱保存。上述光臀八齒小蠹樣品利用奧林巴斯體視顯微鏡(型號: SZX16)對齒的數(shù)量、額瘤和翅盤進(jìn)行形態(tài)鑒定(Cognato, 2015),并將蟲體樣本合并分為3等份(70頭/份),于體視顯微鏡下將每頭蟲體的腸道取出。3份蟲體的腸道樣本分別編號為A1, A2和A3,除腸道以外的其他組織樣本編號為B1, B2和B3,共計6個樣本。用于提取總DNA以及后續(xù)的宏基因組測序等。

表1 光臀八齒小蠹共生微生物的宏基因組測序信息Table 1 Sequencing information of metagenomes of the symbiotic microbes in Ips nitidus

1.2 文庫構(gòu)建和高通量測序

將1.1節(jié)合并后的樣本充分混勻,選取500 mg組織樣本使用CTAB法提取總DNA。待DNA檢測合格后用超聲波機械打斷,使DNA片段化,并進(jìn)行純化、末端修復(fù)、3′端加A、連接測序接頭。用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇,進(jìn)行PCR擴增形成測序文庫,建好文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢,質(zhì)檢合格(質(zhì)量滿足建庫要求,總量滿足2次及以上常規(guī)量建庫)的文庫采用Illumina NovaSeq6000(產(chǎn)地San Diego,試劑盒NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit)進(jìn)行上機測序(北京百邁客生物科技有限公司)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Fastp軟件對原始讀段進(jìn)行質(zhì)量控制并過濾,得到高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)。使用Bowtie2同宿主中歐山松大小蠹參考基因組(GenBank登錄號: GCA_020466585.1)序列比對,去除宿主序列獲得光臀八齒小蠹腸道和其他組織共生菌基因組測序有效讀段。使用軟件MEGAHIT進(jìn)行宏基因組組裝,過濾短于300 bp的contig序列(Lietal., 2015)。采用QUAST軟件對組裝結(jié)果進(jìn)行評估(Gurevichetal., 2013)。采用MetaGeneMark軟件Version 3.26 (http:∥exon.gatech.edu/meta_gmhmmp.cgi)的默認(rèn)參數(shù)識別基因組中編碼區(qū)域進(jìn)行基因預(yù)測(Zhuetal., 2010)。利用MMseqs2軟件Version 12-113e3 (https:∥github.com/soedinglab/mmseqs2)進(jìn)行基因去冗余,相似性和覆蓋度閾值分別為95%和90% (Steinegger and S?ding, 2017)。該宏基因組數(shù)據(jù)的生物項目數(shù)據(jù)庫號(BioProject ID)為PRJNA956988;生物樣品號(Biosample ID)分別為SAMN34209768, SAMN34209769, SAMN34209770, SAMN34209771, SAMN34209772和SAMN34209773;序列片段歸檔號(Sequence ReadArchive, SRA)分別為SRR24210639, SRR24210638, SRR24210637, SRR24210636, SRR24210635和SRR24210634。

利用非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(non-redundant protein sequence database, NR)對光臀八齒小蠹腸道和其他組織共生菌群落物種分類進(jìn)行注釋(鄧泱泱等, 2006),并采用KEGG數(shù)據(jù)庫對基因功能進(jìn)行注釋,以此篩選出真菌和細(xì)菌功能差異的基因以及與營養(yǎng)合成和萜烯解毒代謝相關(guān)的功能基因。基于百邁客平臺(https:∥international.biocloud.net/)分析共生菌群落構(gòu)成?；赗(version 3.6.3)中的igraph包或聯(lián)川生物平臺(https:∥www.omicstudio.cn/tool.)根據(jù)Spearman算法篩選正相關(guān)性閾值≥0.5,負(fù)相關(guān)性閾值≤-0.5,且P<0.05,物種數(shù)80的數(shù)據(jù)組進(jìn)行相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)分析。宏基因組的基因相對豐度的計算公式(Qinetal., 2012)如下:

ai表示i基因的相對豐度;Li和Lj表示i和j基因的長度;xi和xj表示i和j基因出現(xiàn)的次數(shù);n表示總基因的數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

結(jié)果顯示,光臀八齒小蠹3份腸道樣本和3份其他組織樣本共6個樣品的測序量呈上升趨勢,最后漸進(jìn)平緩,表明光臀八齒小蠹共生微生物基因組測序深度充足。在去除宿主基因組后共生微生物宏基因組組裝的大小范圍為15.84～18.08 Mb,注釋到的共生微生物基因數(shù)目為111 009～157 486個,平均每個樣本的基因數(shù)目為130 213個,測序與組裝的百分比在96.10%以上,說明光臀八齒小蠹共生微生物宏基因組數(shù)據(jù)的質(zhì)量較高(表1)。

2.2 共生微生物群落組成

比對NR數(shù)據(jù)庫鑒定到3 520種共生微生物,隸屬于細(xì)菌界(Bacteria)、真菌界(Fungi)、古菌界(Archaea)、病毒界(Viruses)等。細(xì)菌和真菌的多樣性最高,分別占所有共生微生物物種數(shù)的69.01%和23.21%。盡管未匹配和未分類物種多樣性較低,但平均相對豐度達(dá)79.93%;其次為細(xì)菌和真菌的平均相對豐度,分別為13.79%和9.69%。毛霉門(Mucoromycota)、子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和捕蟲霉門(Zoopagomycota)為主要真菌優(yōu)勢門,在其他組織中的相對豐度較腸道更高;變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)和厚壁菌門(Firmicutes)是細(xì)菌中的優(yōu)勢菌門,僅放線菌門的相對豐度在腸道較其他組織中高(表2)。

表2 光臀八齒小蠹共生微生物門水平的相對豐度(%)Table 2 Relative abundance (%) of the symbiotic microbes at the phylum level in Ips nitidus

共鑒定到共生真菌9門40綱93目217科403屬743種,未分類74個(表3)。子囊菌門多樣性和平均相對豐度均最高,該類真菌多樣性和平均相對豐度分別為61.20%和32.06%(圖1: A和表3)。多樣性較高的菌門依次為擔(dān)子菌門、毛霉門和微孢子門(Microsporidia)(表3),其平均相對豐度占整個真菌平均相對豐度的比例依次為9.09%, 29.34%和3.93%,且在其他組織中較在腸道中的相對豐度更高(圖1: A)。子囊菌門和毛霉門均都占所有共生真菌平均相對豐度的60%以上。芽枝霉門(Blastocladiomycota)和隱真菌門(Cryptomycota)在腸道中的相對豐度高于在其他組織中的;從子囊菌目水平來看,白粉菌目(Erysiphales)、酵母菌目(Saccharomycetales)、散囊菌目(Eurotiales)和肉座菌目(Hypocreales)為真菌優(yōu)勢目,酵母菌目在腸道中的相對豐度略高于在其他組織中的,平均相對豐度占子囊菌門真菌的9.27%,而白粉菌目平均相對豐度最高,占子囊菌的63.66%(圖1: B)。白粉菌屬Erysiphe、叢枝菌根屬Rhizophagus、蛙糞霉屬Basidiobolus、根霉屬Rhizopus、Spizellomyces、羅茲菌屬Rozella、蛙壺菌屬Batrachochytrium、被孢霉菌屬Mortierella、橫梗霉屬Lichtheimia和柄銹菌屬Puccinia等是相對豐度較高的優(yōu)勢真菌屬。白粉菌屬和叢枝菌根屬均是腸道和其他組織的核心屬。共注釋到長喙殼類真菌微囊目和長喙殼目6屬16種(參考物種),在其他組織和腸道中的平均相對豐度分別為0.016%和0.013%,其中,Grosmannia1種、Ophiostoma5種、Sporothrix3種、Ceratocystis3種、Leptographium2種、Esteya1種和1個未分類物種,在其他組織中的相對豐度較在腸道中的更高,Esteya僅出現(xiàn)在他組織中(圖1: C)。

表3 不同分類水平下光臀八齒小蠹共生真菌群落Table 3 Symbiotic fungal communities at different classification levels in Ips nitidus

共鑒定到共生細(xì)菌35門69綱142目308科826屬2 275種,未分類154個(表4)。變形菌門是優(yōu)勢菌門,其物種多樣性和平均相對豐度約分別占整個共生細(xì)菌的45.82%和57.80%,其在其他組織中的相對豐度較在腸道中的更高,厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門多樣性較高,其平均相對豐度占整個細(xì)菌群落的比例分別為4.46%, 10.06%和4.64%,放線菌門在腸道中的相對豐度高于在其他組織中的(圖2: A)。γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)、α-變形桿菌綱(α-Proteobacteria)、β-變形菌綱(β-Proteobacteria)、鞘脂桿菌綱 (Sphingobacteriia)在其他組織中相對豐度較腸道中的相對豐度更高。腸桿菌目(Enterobacterales)、鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)和立克次體目(Rickettsiales)相對豐度較高,分別為23.53%, 6.79%和6.40%,在其他組織中相對豐度較腸道中的更高(圖2: B)。鏈霉菌屬Streptomyces、芽孢桿菌屬Bacillus、假單胞桿菌Pseudomonas和泛菌屬Pantoea的多樣性較高,分別占細(xì)菌群落多樣性的1.81%, 1.56%, 1.40%和1.32%,其中鏈霉菌屬和泛菌屬在其他組織中的相對豐度較腸道中的更高;芽孢桿菌屬和假單胞桿菌屬在腸道相對豐度較在其他組織中的更高。腸桿菌屬Enterobacter、魚立克次體屬Piscirickettsia、沃爾巴克氏體屬Wolbachia的相對豐度依次較高,分別為18.93%, 3.01%和2.71%,在其他組織中的相對豐度較腸道中的更高,且腸桿菌屬和沃爾巴克氏體屬均為腸道和其他組織的核心屬(圖2: C)。

圖2 光臀八齒小蠹共生細(xì)菌在門(A)、目(B)和屬(C)水平的相對豐度Fig. 2 Relative abundance of symbiotic bacteria in Ips nitidus at the levels of phylum (A), order (B) and genus (C)

表4 不同分類水平下光臀八齒小蠹共生細(xì)菌群落Table 4 Symbiotic bacterial communities at different classification levels in Ips nitidus

2.3 共生微生物的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)

網(wǎng)絡(luò)分析顯示,在腸道和其他組織中共生真菌和細(xì)菌間的正相關(guān)性P(互惠共生或共棲)均大于負(fù)相關(guān)性N(拮抗或抑制作用)(腸道:P=69,N=31; 其他組織:P=64,N=36),證明光臀八齒小蠹共生菌間存在較強的互惠共生或共棲關(guān)系。而且腸道和其他組織中在屬水平相互作用的真菌的數(shù)量高于細(xì)菌的數(shù)量(腸道: 45屬真菌,35屬細(xì)菌;其他組織: 32屬真菌,25屬細(xì)菌),可能真菌和光臀八齒小蠹的共生關(guān)系較細(xì)菌和光臀八齒小蠹的共生關(guān)系更為緊密。在腸道,優(yōu)勢白粉菌屬(腸道:P=34,N=9; 其他組織:P=12,N=9)和沃爾巴克氏菌屬(腸道:P=18,N=5; 其他組織:P=7,N=5)的連接數(shù)高于其他組織中的,且正相關(guān)性高于負(fù)相關(guān)性,暗示了白粉菌屬和沃爾巴克氏菌屬在腸道比在其他組織中可能存在更為復(fù)雜的互惠共生相互作用(圖3: A)。在其他組織中,叢枝菌根屬(腸道:P=11,N=8; 其他組織:P=22,N=11)和腸桿菌屬(腸道:P=6,N=9; 其他組織:P=23,N=11)的連接數(shù)均高于腸道的,表明這2個優(yōu)勢屬在其他組織中較在腸道中存在更重要的相互作用(圖3: B)。其他組織中優(yōu)勢腸桿菌屬的正相關(guān)性高于負(fù)相關(guān)性(P=23,N=11),而在腸道表現(xiàn)相反(P=6,N=9)。一些優(yōu)勢菌屬如海源菌屬Idiomarina、產(chǎn)水菌屬Aquifex、申氏桿菌屬Shinella、假絲酵母屬Candida和巨孢囊霉屬Gigaspora等在腸道中呈現(xiàn)正相關(guān)性,在其他組織中呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性;不動桿菌屬Acinetobacter、假單胞菌屬Pseudomonas、微桿菌屬Microbacterium、脫硫弧菌屬Desulfovibrio、雙珠霉屬Dimargaris和內(nèi)囊霉屬Endogone在腸道中呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性,在其他組織中呈現(xiàn)正相關(guān)性。這些優(yōu)勢菌屬與白粉菌屬、叢枝菌根屬和腸桿菌屬相互聯(lián)系,可能在光臀八齒小蠹共生菌間的相互作用有著重要的功能。

圖3 光臀八齒小蠹腸道(A)和其他組織(B)中共生菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)Fig. 3 Correlation network of the symbionts in the gut (A) and other tissues (B) of Ips nitidus

2.4 共生菌功能基因注釋

KEGG注釋到了14 826個功能基因,包括共生真菌7 010個功能基因,細(xì)菌6 483個功能基因(圖4)。這些功能基因均參與細(xì)胞過程(cellular processes)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)和代謝(metabolism)。從真菌和細(xì)菌功能基因來看,真菌功能基因在KEGG一級水平遺傳信息處理的全部通路以及細(xì)胞生長與死亡(cell growth and death)、運輸和分解代謝(transport and catabolism)、信號傳導(dǎo)(signal transduction)、多糖生物合成和代謝(glycan biosynthesis and metabolism)、核苷酸代謝(nucleotide metabolism)二級水平5個通路中較細(xì)菌基因豐富。真菌中沒有注釋到細(xì)胞過程中的細(xì)胞運動(cell motility)相關(guān)的功能基因,表明真菌可能沒有參與到這一過程(圖4: A)。細(xì)菌功能基因在全局和概述圖譜(global and overview maps)、碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、能量代謝(energy metabolism)和氨基酸代謝(amino acid metabolism)等數(shù)量高于真菌的,特別是與異源性物質(zhì)生物降解和代謝(xenobiotics biodegradation and metabolism)相關(guān)的細(xì)菌功能基因明顯高于真菌(真菌0.08%,細(xì)菌1.01%)(圖4: B)。15條通路(代謝13條,遺傳信息處理2條)在腸道和其他組織間細(xì)菌和真菌存在顯著功能性差異。mRNA監(jiān)測通路(mRNA surveillance pathway)、 丙酸代謝(propanoate metabolism)、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解(ubiquitin-mediated proteolysis)、核黃素代謝(riboflavin metabolism)、嘧啶代謝(pyrimidine metabolism)、丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝(alanine, aspartate and glutamate metabolism)、N-聚糖的生物合成(N-glycan biosynthesis)、脂肪酸降解(fatty acid degradation)、酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)、脂肪酸代謝(fatty acid metabolism)和多型N-聚糖生物合成(various types of N-glycan biosynthesis)在腸道較在其他組織的細(xì)菌和真菌基因的平均相對豐度高,表明可能光臀八齒小蠹共生菌這些通路在腸道較在其他組織的代謝作用更強(圖4: C)。

圖4 光臀八齒小蠹共生真菌(A)和細(xì)菌(B)的功能基因的KEGG通路以及腸道和其他組織間功能基因的差異KEGG通路(C)Fig. 4 KEGG pathways of the functional genes of the symbiotic fungi (A) and bacteria (B), and differential KEGG pathways of the functional genes between gut and other tissues (C) of Ips nitidus

KEGG注釋到與異源性物質(zhì)生物降解和代謝的細(xì)菌功能基因98個,真菌功能基因8個。參與到氯烷和氯烯降解(chloroalkane and chloroalkene degradation, ko00625)、苯甲酸酯降解(benzoate degradation, ko00362)、氨基苯甲酸酯降解(aminobenzoate degradation, ko00627)、己內(nèi)酰胺降解(caprolactam degradation, ko00930)、萘降解(naphthalene degradation, ko00626)、苯乙烯降解(styrene degradation, ko00643)、氟苯甲酸酯降解(fluorobenzoate degradation, ko00364)、氯環(huán)己烷和氯苯降解(chlorocyclohexane and chlorobenzene degradation, ko00361)、硝基甲苯降解(nitrotoluene degradation, ko00633)、甲苯降解(toluene degradation, ko00623)、阿特拉津降解(atrazine degradation, ko00791)、類固醇降解(steroid degradation, ko00984)和二甲苯降解(xylene degradation, ko00622)13個通路,與細(xì)胞色素P450外源性物質(zhì)代謝(metabolism of xenobiotics by cytochrome P450, ko00980)、細(xì)胞色素P450-藥物代謝(drug metabolism-cytochrome P450, ko00982)以及藥物代謝-其他酶(drug metabolism-other enzymes, ko00983)相關(guān)通路沒有發(fā)現(xiàn),猜測可能光臀八齒小蠹共生真菌和細(xì)菌不存在與細(xì)胞色素P450代謝的相關(guān)機制。氯烷和氯烯降解通路的功能基因最多(55個),其次為苯甲酸酯降解通路的功能基因(30個)。細(xì)菌基因主要分布于歐文氏菌屬Erwinia、海源菌屬Idiomarina、伯克霍爾德菌屬Burkholderia、嗜鹽單胞菌屬Halomonas、假單胞菌屬Pseudomonas、泛菌屬Pantoea、沙雷氏菌屬Serratia、巨型球菌屬Macrococcus、芽胞桿菌屬Bacillus等,真菌功能基因主要分布于球梳霉屬Linderina、彈球菌屬Sphaerobolus、異水霉屬Allomyces等。

對于萜烯類降解的相關(guān)KEGG通路,僅注釋到檸檬烯降解(limonene degradation, Ko00903)通路。6個真菌功能基因在腸道和其他組織中均有發(fā)現(xiàn)(表5),分布于Lobosporangium、Hesseltinella、巨孢囊霉屬Gigaspora、Sugiyamaella、彈球菌屬Sphaerobolus和異水霉屬Allomyces。細(xì)菌功能基因57個,腸道細(xì)菌功能基因46個,其他組織細(xì)菌功能基因50個,主要分布于芽桿菌目巨型球菌屬Macrococcus、海源菌屬Idiomarina和假單胞菌屬Pseudomonas等類群。此外,還發(fā)現(xiàn)甾醇合成 (steroid biosynthesis, Ko00100)通路,真菌功能基因11個,腸道中有12個,其他組織中有14個,主要分布于毛霉門根霉屬Rhizopus和毛霉屬Mucor、子囊菌門的裂殖酵母屬Schizosaccharomyce和擬魏克酵母屬Wickerhamomyces;擔(dān)子菌門的串擔(dān)革菌屬Botryobasidium;芽枝霉門異水霉屬Allomyces等以及分布于細(xì)菌變形菌門(Enhygromyxa)和甲基微菌屬Methylomicrobium。

表5 注釋到與單萜類檸檬烯降解和甾醇生物合成相關(guān)KEGG通路的光臀八齒小蠹共生真菌和細(xì)菌功能基因Table 5 Functional genes of the symbiotic fungi and bacteria in Ips nitidus annotated to KEGG pathways relatedto monoterpene limonene degradation and steroid biosynthesis

2.5 長喙殼類真菌相關(guān)功能基因

長喙殼類真菌6屬16種共注釋到功能基因74個,分布于Ophiostoma(腸道18個,其他組織27個)、Ceratocystis(腸道11個,其他組織15個)、Grosmannia(腸道8個,其他組織6個)、Sporothrix(腸道7個,其他組織9個)、Leptographium(腸道1個,其他組織2個)、Esteya(腸道0個,其他組織1個)和長喙殼科未分類種(ophiostomataceae unclassified)(腸道1個,其他組織2個)。這些基因主要參與到氧化磷酸化反應(yīng)、代謝通路、氨基酸代謝、碳代謝等過程。Esteya僅在其他組織中被發(fā)現(xiàn)。碳代謝能力僅在Sporothrix、Ceratocystis和Grosmannia中發(fā)現(xiàn),且Grosmannia在其他組織中較在腸道中的碳代謝能力更強,Leptographium參與到淀粉與蔗糖代謝,且在腸道中較在其他組織中的代謝能力更強。Sporothrix、Ophiostoma和1個長喙殼科未分類物種主要參與氧化磷酸化。

3 討論

本研究采用宏基因組技術(shù)對光臀八齒小蠹腸道和其他組織的共生微生物群落組成與多樣性以及功能基因進(jìn)行分析,結(jié)果表明,未匹配和未分類物種的相對豐度最高,達(dá)79.93%,這可能與非可培養(yǎng)微生物無法利用傳統(tǒng)方法分離獲得有關(guān),這與MsangoSoko等 (2020) 和Zhu等(2022)研究結(jié)果相一致。真菌中子囊菌門的物種多樣性和相對豐度最高。光臀八齒小蠹腸道和其他組織中均有酵母菌目、肉座菌目、微囊目和散囊菌目等(圖1: B)。該小蠹酵母目的物種多樣性最高,約占全部真菌的12.21%。而白粉菌目的相對豐度最高,但在材小蠹Megaplatypusmutatus和華山松大小蠹Dendroctonusarmandi共生菌群落組成的研究中,發(fā)現(xiàn)酵母目的相對豐度最高(Huetal., 2015; Ceriani-Nakamurakareetal., 2018)。此外,擔(dān)子菌門也是較為豐富的,這與Megaplatypusmutatus伴生真菌群落組成的研究相一致。白粉菌目在其他組織中較在腸道中表現(xiàn)出更高的相對豐度,而酵母目相反,即在腸道中較其他組織中具有更高的相對豐度。在長喙殼類真菌群落中,發(fā)現(xiàn)16種(參考物種),包含長喙殼目5屬13種和微囊目1屬3種。該類群的相對豐度較低,且在其他組織的相對豐度較腸道更高(圖1: C),在其他齒小蠹類群中發(fā)現(xiàn)長喙殼科(Ophiostomataceae)和Ceratocystidaceae兩個科是小蠹亞科腸道的核心菌(Chakrabortyetal., 2020b)。盡管該類群的相對豐度較低,但在小蠹蟲營養(yǎng)來源(Guevara-Rozoetal., 2020)、化學(xué)信息交流(Zhaoetal., 2019a)、寄主防御性化合物降解(DiGuistinietal., 2011; Briones-Robleroetal., 2017)方面發(fā)揮著重要的作用。

從共生細(xì)菌來看,變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門等細(xì)菌群落的物種多樣性和相對豐度均較高(圖2: A)。先前對于中歐山松大小蠹(Adamsetal., 2013)和紅脂大小蠹(Morales-Jiménezetal., 2009; Chengetal., 2018)的研究發(fā)現(xiàn)α-變形桿菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱和放線菌綱等存在于所有樣本中,這與本研究的結(jié)果相一致。從屬水平來看,光臀八齒小蠹共生細(xì)菌相對豐度較高的依次為腸桿菌屬、魚立克次體屬、沃爾巴克氏體屬、微粒孢子蟲屬Anaplasma和不動桿菌屬Acinetobacter等,且其他組織中的相對豐度較腸道中的更高(圖2: C)。而鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和泛菌屬多樣性較高,均存在于光臀八齒小蠹腸道和其他組織。而紅脂大小蠹(Zhouetal., 2016)和根大小蠹等一些大小蠹物種(Briones-Robleroetal., 2017; Hernández-Garcíaetal., 2017; Ceriani-Nakamurakareetal., 2018)也存在這些細(xì)菌物種,并證明該類群與萜烯類、纖維類等防御性化合物的降解相關(guān)。但在本研究發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬和泛菌屬的相對豐度在其他組織中更高,而芽孢桿菌屬和假單胞桿菌相對豐度在腸道較其他組織中更高。腸桿菌屬作為共生細(xì)菌中一個豐度最高的類群,目前在咖啡果小蠹等其他小蠹物種(Hernández-Garcíaetal., 2017; Vegaetal., 2021)和山茶象Curculiochinensis等(Zhangetal., 2020)鞘翅目昆蟲表現(xiàn)出較高的相對豐度,且為核心菌,該類群在解毒植物防御化合物過程中發(fā)揮著重要的作用。此外,腸桿菌屬在鱗翅目的Samiaricini中也有發(fā)現(xiàn),可以幫助調(diào)節(jié)腸道的pH而提高堿性環(huán)境,在單寧的降解中起重要的作用(MsangoSokoetal., 2020)。因此,腸道共生菌對昆蟲的生長發(fā)育和宿主難利用物質(zhì)降解有著重要的意義(Briones-Robleroetal., 2017)。而小蠹蟲共生細(xì)菌群落組成可能受蟲體本身的影響,也可能與蟲體不同發(fā)育階段相關(guān),如紅脂大小蠹腸道共生細(xì)菌Pseudomonasputida僅出現(xiàn)在的幼蟲時期,Acinetobacterlwoffii可以在幼蟲和羽化成蟲前時存在,但Arthrobacteroxidans僅在幼嫩成蟲時出現(xiàn)(Briones-Robleroetal., 2017)。與此同時,還可能因腸道分離部位以及采樣地理區(qū)域不同從而導(dǎo)致腸道共生細(xì)菌群落組成和多樣性存在差異(Chakrabortyetal., 2020b; Guevara-Rozoetal., 2020; MsangoSokoetal., 2020)。

此外,本研究分析了腸道和其他組織共生真菌和細(xì)菌群落間的相互作用。在腸道和其他組織共生真菌和細(xì)菌間的正相關(guān)相互作用(互惠共生或共棲)均高于負(fù)相關(guān)相互作用(拮抗或抑制)(圖3: A和B)。表明小蠹蟲共生菌間存在密切的互惠共生關(guān)系。而Zhu等(2022)在擬果蠅Drosophilasimulans和黃粉鹿角花金龜Dicranocephaluswallichiibowringi腸道真菌和細(xì)菌群落組裝中,發(fā)現(xiàn)腸道微生物間可能存在更復(fù)雜的互惠共生作用。本研究還發(fā)現(xiàn)一些優(yōu)勢菌群海源菌屬、產(chǎn)水菌屬和申氏桿菌屬等在腸道和其他組織中與白粉菌屬、叢枝菌根屬和腸桿菌屬呈現(xiàn)相反的作用,如海源菌屬、產(chǎn)水菌屬、申氏桿菌屬、假絲酵母屬和巨孢囊霉屬等在腸道呈現(xiàn)正相關(guān)作用,在其他組織中呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)作用;不動桿菌屬、假單胞菌屬、微桿菌屬、脫硫弧菌屬、雙珠霉屬和內(nèi)囊霉屬在腸道呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性,在其他組織中呈現(xiàn)正相關(guān)作用。

在功能基因方面,發(fā)現(xiàn)光臀八齒小蠹共生真菌功能基因7 010個,細(xì)菌功能基因6 483個。真菌功能基因沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞運動(cell motility)相關(guān)的,在細(xì)菌功能基因中,發(fā)現(xiàn)異源性物質(zhì)生物降解和代謝的基因明顯高于真菌,主要分布于歐文氏菌屬、海源菌屬、伯克霍爾德菌屬、嗜鹽單胞菌屬等類群。由于檸檬烯是一種重要的單萜類化合物,可以抑制小蠹和共生菌的存活。目前已有研究表明小蠹蟲共生菌及其代謝產(chǎn)物能夠協(xié)助宿主降解植物防御性化合物(DiGuistinietal, 2011; Ceja-Navarroetal., 2015; Xuetal., 2016)。本研究發(fā)現(xiàn)與萜烯類檸檬烯降解通路ko00903主要存在于巨型球菌屬、海源菌屬和假單胞菌屬等類群。與此同時,發(fā)現(xiàn)的相關(guān)酶與Adams等(2013)對中歐山松大小蠹萜烯類降解的酶類相一致。但中歐山松大小蠹與萜烯類降解相關(guān)的功能基因主要分布于假單胞菌屬和拉恩氏菌屬等(Adamsetal., 2013),與本研究結(jié)果略有差異。

由于共生真菌可以為小蠹蟲和寄主樹木提供自身無法合成但生長發(fā)育必需的甾醇(Bentz and Six, 2006)。如中歐山松大小蠹可以直接從長喙殼類真菌共生體中獲取麥角甾醇(Guevara-Rozoetal, 2020)。本研究發(fā)現(xiàn)與甾醇合成通路ko00100,其他組織和腸道的基因數(shù)分別為14個和12個(表5),表明其他組織較腸道可能為小蠹提供更多的營養(yǎng)來源。先前研究證明大小蠹的長喙殼類真菌中麥角甾醇是小蠹蟲卵、幼蟲和蛹生長發(fā)育必需的營養(yǎng),但本研究未在長喙殼類真菌中發(fā)現(xiàn)。這些與萜烯降解和甾醇合成相關(guān)的異水霉屬、海源菌屬、假單胞菌屬和毛霉屬等是真菌和細(xì)菌群落的優(yōu)勢屬,且與核心菌屬叢枝菌根屬、白粉菌屬和腸桿菌屬相互聯(lián)系,表明相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)中的3個優(yōu)勢菌屬可能在降解植物化合物和營養(yǎng)資源方面有著間接的作用。此外,DiGuistini等(2011)還發(fā)現(xiàn)長喙殼真菌Grosmanniaclavigera具有降解萜烯類有毒物質(zhì)的基因。但在本研究中暫未在長喙殼類真菌發(fā)現(xiàn)可以降解寄主防御性化合物的功能基因。可能與小蠹蟲共生菌群落特征和小蠹的分布有關(guān)相關(guān)(Bentz and Six, 2006; Guevara-Rozoetal., 2020)。但對于小蠹蟲密切相關(guān)的伴生菌長喙殼類真菌Grosmannia、Ophiostoma和Ceratocystis的74個功能基因參與到氧化磷酸化、碳和能量代謝通路,且Ophiostoma是腸道和其他組織中功能基因最豐富的類群(Behmer and Nes, 2003)。

作為中國特有物種光臀八齒小蠹,該小蠹具有豐富的共生微生物,特別是細(xì)菌和真菌。共生子囊菌門的酵母菌和白粉菌是真菌的兩個重要類群,分別在其他組織有著最高的物種多樣性和相對豐度。在共生細(xì)菌群落組成中,證明變形菌門是其他組織中物種多樣性和相對豐度最高的一個類群,特別是核心菌腸桿菌屬,該類群是細(xì)菌群落中最為豐富的類群,且在其他組織的相對豐度較腸道更高,該類群在大小蠹等鞘翅目昆蟲對于防御性化合物降解方面均有一定的研究,未來可對該類群的功能基因進(jìn)行深入探討,為研究防御性化合物降解提供新的思路。與此同時,小蠹蟲共生菌在腸道和其他組織存在密切的互惠共生作用。此外,對于長喙殼類真菌的功能基因主要參與到了氧化磷酸化和氨基酸等代謝過程中。研究還發(fā)現(xiàn)單萜檸檬烯降解通路ko00903和甾醇生物合成通路ko00100。本研究為后續(xù)小蠹蟲和共生菌間的共生機制和協(xié)同進(jìn)化關(guān)系的深入探究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。