王渭霞, 朱廷恒, 賴?guó)P香, 魏 琪, 萬品俊, 何佳春, 傅 強(qiáng),*

(1. 中國(guó)水稻研究所, 水稻生物育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 311401; 2. 浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院, 杭州 310014)

絕大多數(shù)昆蟲體內(nèi)都含有共生細(xì)菌,參與和調(diào)控宿主昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)代謝、生殖、抵御不良環(huán)境等基本生命過程,是宿主昆蟲不可或缺的“重要器官”(Razaetal., 2020; 王渭霞等, 2021)。研究昆蟲共生微生物不僅利于了解昆蟲-植物協(xié)同進(jìn)化和互作關(guān)系,也有助于開發(fā)利用昆蟲資源和害蟲防治。然而,大部分的共生菌只能生活于昆蟲體內(nèi),不能獨(dú)立生存,難以離體培養(yǎng)。近年來,隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和基因組學(xué)等的進(jìn)步和發(fā)展,促進(jìn)了昆蟲與共生菌共生機(jī)制的研究,為從微觀角度研究昆蟲種群形成和擴(kuò)散提供了便利(楊義婷等, 2014)。傳統(tǒng)微生物分離和培養(yǎng)是最為直觀的方法,采用此法,人們從家蠶、蜜蜂和果蠅等昆蟲腸道分離培養(yǎng)出了多種微生物(Douglas, 2015),為進(jìn)一步研究功能奠定了基礎(chǔ)。

表1 本研究從褐飛虱中分離的共生菌編號(hào)、科名、菌落形態(tài)和來源種群Table 1 ID, family name, colonial morphology and source population of symbionts isolatedfrom Nilaparvata lugens in this study

褐飛虱Nilaparvatalugens是一種取食水稻韌皮部汁液的寡食性水稻害蟲,具有繁殖力強(qiáng)、致害性易變化、遠(yuǎn)距離遷飛和傳播病毒等特征,是我國(guó)和許多亞洲國(guó)家當(dāng)前水稻上的首要害蟲。當(dāng)蟲量大、受害重時(shí)可引起稻株失水枯死,導(dǎo)致嚴(yán)重的減產(chǎn)或失收(Bottrell and Schoenly, 2012)。褐飛虱體內(nèi)共生微生物與其致害性變化和抗藥性形成的相關(guān)性研究也有一些零星的報(bào)道。其中類酵母共生菌(yeast-like symbiont, YLS)參與了尿素循環(huán),為褐飛虱提供不平衡食物中所缺乏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(王國(guó)超等, 2005; Xueetal., 2014; Bao and Zhang, 2019)。褐飛虱共生解脂假絲酵母Yarrowialipolytica和Arsenophonus與對(duì)吡蟲啉的抗性有關(guān)(李娜等, 2010, 2011; Pangetal., 2018)。不動(dòng)桿菌Acinetobactersoli和粘質(zhì)沙雷氏菌Serratiamarcescens可誘導(dǎo)水稻合成稻殼酮、抗毒素等防御物質(zhì),參與調(diào)控水稻的防御反應(yīng)(Warietal., 2019a, 2019b)。這些研究表明褐飛虱體內(nèi)共生菌與其致害性以及對(duì)殺蟲劑的抗性密切相關(guān)。

由于共生菌的離體培養(yǎng)以及無菌褐飛虱的實(shí)驗(yàn)材料不易獲得,無法為其功能研究提供直接的證據(jù)。本研究利用離體培養(yǎng)法從褐飛虱兩種不同致害性種群中獲得了9個(gè)屬的15株不同的共生細(xì)菌;從利用原位雜交技術(shù)分析了其在褐飛虱體內(nèi)的分布;通過飼喂和顯微注射的方式回補(bǔ)添加共生芽孢桿菌考察其功能,為研究共生菌-褐飛虱-水稻互作提供了直接的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲源和水稻

2010年從浙江富陽(yáng)中國(guó)水稻研究所試驗(yàn)田收集褐飛虱種群分別飼養(yǎng)于感蟲水稻臺(tái)中1號(hào)(TN1)和含有bph3基因的抗性水稻IR56上。飼養(yǎng)條件為溫度(27±2) ℃和光周期16L∶8D。連續(xù)飼養(yǎng)130代后獲得兩個(gè)穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室種群TN1和IR56種群。

1.2 共生菌的分離和特性分析

分別取TN1和IR56種群不同齡期的褐飛虱混合樣本共計(jì)50頭,每個(gè)齡期(包括初羽化雌雄成蟲)約5～7頭,75%酒精中處理10 min,用無菌水清洗3次,每次5 min。在0.8%無菌生理鹽水中將樣本研磨,勻漿液在7 000 r/min離心5 min。上清稀釋不同倍數(shù)后,取100 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃過夜培養(yǎng)。選取形態(tài)以及顏色不一樣的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)于4 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)9 h后,取500 μL與等體積50%滅菌甘油混合后,-80 ℃保存,剩余菌液7 000 r/min離心5 min,利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302-02, 天根生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA,利用16S rDNA通用引物27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′; 1492R: 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物回收后送浙江尚亞生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。獲得序列在NCBI中進(jìn)行比對(duì)和分類定位。利用Mega 7.0基于鄰接法對(duì)分離獲得的共生菌以及NCBI庫(kù)中其他細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行聚類分析。

LB培養(yǎng)基中分別添加終濃度為氨芐青霉素100 mg/L,四環(huán)素50 mg/L,鏈霉素100 mg/L,利福平50 mg/L和卡那霉素50 mg/L的抗生素,劃線接種不同共生細(xì)菌,37 ℃培養(yǎng)24 h觀察共生菌的生長(zhǎng)。

從平板上挑取單個(gè)菌落接種于4 mL LB液體培養(yǎng)基中, 37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)3和6 h后取500 μL菌液測(cè)定OD600值,并稀釋103和106倍后,取100 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基,過夜培養(yǎng),統(tǒng)計(jì)平板菌落數(shù)即cfu/mL。cfu/mL是菌落形成單位,表示每毫升含有細(xì)菌群落的總數(shù)。

1.3 共生菌的分布

以培養(yǎng)所得的BPH-S36的共生細(xì)菌DNA為模板,用16S-338F: 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和16S-806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′為引物擴(kuò)增16S rDNA的V3-V4區(qū)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收后,測(cè)定濃度,依據(jù)PCR-Dig Labelling Kit試劑盒說明對(duì)模板DNA進(jìn)行地高辛標(biāo)記。以地高辛標(biāo)記的DNA探針與組織中的RNA雜交。

顯微鏡下分離褐飛虱成蟲不同組織包括唾液腺、腸道、雌蟲內(nèi)生殖器、雄蟲內(nèi)生殖器等,利用多聚甲醛固定組織、結(jié)合地高辛標(biāo)記的16S rDNA通用探針雜交和NBT/NBCT顯色技術(shù),根據(jù)生成的藍(lán)色或紫藍(lán)色反應(yīng)確定共生菌的分布情況。結(jié)果顯示,共生細(xì)菌在褐飛虱腸道(圖3: A)、唾液腺(圖3: B)、卵巢(圖3: C)和卵(圖3: D)中均有分布,在雄蟲內(nèi)生殖器中無明顯分布(圖3: E)。

探討完翻轉(zhuǎn)課堂的狹義和廣義的定義之后，我們就可以把翻轉(zhuǎn)課堂定義為由以下兩部分組成的教育技術(shù)：課內(nèi)的互動(dòng)式小組學(xué)習(xí)活動(dòng)和課后的以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的個(gè)人輔導(dǎo)。形象的定義表述見圖1。我們對(duì)這一定義進(jìn)行了嚴(yán)格限制，排除了那些在課外活動(dòng)中沒有使用視頻的研究設(shè)計(jì)。盡管翻轉(zhuǎn)課堂的廣義定義可能對(duì)我們有幫助，但如果定義過廣，也就意味著單純的課外布置閱讀任務(wù)和課內(nèi)討論就構(gòu)成了所謂的翻轉(zhuǎn)課堂，這種誤解也是我們所要避免的。

1.4 共生菌的抗生素減菌飼喂和芽孢桿菌的回補(bǔ)飼喂

將40頭饑餓處理6 h的TN1種群2齡末若蟲飼養(yǎng)于含利福平(50 mg/L)的人工飼料上飼養(yǎng)2 d,2 d后利用添加共生菌BPH-S36或BPH-S33的培養(yǎng)液(菌液濃度為OD600為0.8左右時(shí),按50×稀釋添加)的人工飼料繼續(xù)飼養(yǎng)2 d。由于共生菌在人工飼料中的不斷繁殖,期間需更換1次人工飼料。抗生素處理組為抗生素飼喂 2 d后用不含抗生素的人工飼料繼續(xù)飼養(yǎng)2 d。對(duì)照為不添加抗生素的人工飼料持續(xù)飼養(yǎng)4 d, 2 d時(shí)更換1次飼料。4 d后將褐飛虱轉(zhuǎn)接到苗齡為25-30 d的TN1水稻上,用籠罩罩住水稻。每個(gè)處理接30頭蟲。人工飼料的配制和飼養(yǎng)方法參照Fu等(2001)。分別在飼養(yǎng)第6 和10天時(shí)統(tǒng)計(jì)活蟲數(shù)。每個(gè)處理3～4次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 共生菌的飼喂和顯微注射

蘇州托克斯沖壓設(shè)備有限公司是德國(guó)TOX PRESSOTECHNIK GmbH& CO.KG在中國(guó)的全資子公司，主要生產(chǎn)TOX氣液增力缸、TOX電子壓力機(jī)、TOX板件沖壓連接技術(shù)及各類專用沖壓設(shè)備和生產(chǎn)線，產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外汽車工業(yè)、家電工業(yè)和工業(yè)電器等行業(yè)。目前為止，該公司已在國(guó)內(nèi)外銷售了6 000多臺(tái)套各式通用、專用沖壓設(shè)備及專用生產(chǎn)線，成為TOX產(chǎn)品亞洲銷售、生產(chǎn)基地。

1.6 褐飛虱DNA的提取和qPCR分析

利用Mega 7.0對(duì)分離獲得的3株芽孢桿菌類共生菌以及NCBI庫(kù)中其他芽孢桿菌類細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行比較。以大腸桿菌Escherichiacoli為外群,用Mega 7.0軟件包中的Maximum Composite Likelihood模型計(jì)算進(jìn)化距離,用鄰接法自展檢驗(yàn)值(Bootstrap) 1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn),源于IR56種群的兩株共生菌(BPH-S33和BPH-S36)聚類在一個(gè)分枝上,而源于TN1種群的BPH-S47為另一分枝(圖2)。

15株芽孢桿菌菌株在含利福平的培養(yǎng)基中均不能生長(zhǎng),而在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中均能正常生長(zhǎng)。其中BPH-S36可在添加氨芐青霉素、鏈霉素、四環(huán)素的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),而在添加利福平和卡那霉素的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。BPH-S33僅在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基上可正常生長(zhǎng)。對(duì)這兩株僅從IR56種群中獲得的芽孢桿菌進(jìn)一步開展了功能研究。在擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.8時(shí)BPH-S33和BPH-S36的菌落數(shù)量分別為10.3×107和10.4×108cfu/mL。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism(版本8.0.0, GraphPad Software, www.graphpad.com)進(jìn)行繪圖,利用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t測(cè)驗(yàn)。

將40頭饑餓處理6 h的TN1種群3齡若蟲飼養(yǎng)于添加芽孢桿菌BPH-S36或BPH-S33菌液的人工飼料中飼養(yǎng)2 d。菌液濃度為OD600為0.8左右時(shí)按50×和100×稀釋添加。期間更換人工飼料1次。2 d 后將其接到 IR56 水稻苗上; 利用顯微注射法給褐飛虱TN1種群的3齡若蟲注射用無菌水稀釋50×和100×的菌液,每頭蟲注射0.1 μL。注射后褐飛虱集中飼養(yǎng)與TN1苗上恢復(fù)24 h。24 h挑取活蟲接到苗齡為25-30 d的IR56水稻上,用籠罩罩住水稻。每籠接蟲約40頭。其中未處理的TN1種群若蟲作為陰性對(duì)照,未處理的IR56種群若蟲作為陽(yáng)性對(duì)照。在IR56上飼養(yǎng)10 d后統(tǒng)計(jì)活蟲數(shù)。并收取各處理不同重復(fù)的褐飛虱用于DNA提取。另取各處理雌若蟲2頭,研磨于600 μL無菌水中。分別稀釋100和1 000倍后,取100 μL涂板于LB培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h,統(tǒng)計(jì)各平板菌落數(shù)量。每個(gè)重復(fù)涂3個(gè)平板,每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 褐飛虱可培養(yǎng)共生菌的分類地位和生物學(xué)特性分析

利用離體培養(yǎng)技術(shù)從褐飛虱兩種種群中共獲得15株菌株,包括不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter、沙雷氏菌屬Serratia、節(jié)桿菌屬Arthrobacter、金黃桿菌屬Chryseobacterium、微球菌屬M(fèi)icrococcus、葡萄球菌屬Staphylococcus、氣單胞菌屬Aeromonas、歐文菌屬Erwinia和泛菌屬Pantoea等。其中從IR56種群中分離獲得兩株芽孢桿菌類共生菌BPH-S33和BPH-S36,TN1種群獲得1株BPH-S47。所分離菌株的編號(hào)、菌落形態(tài)和16S rDNA序列blast一致性在98%以上的結(jié)果見表1。各種共生菌在LB培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)見圖1。

3.培訓(xùn)需求預(yù)測(cè)分析的核心在于確認(rèn)差距。其核心是通過對(duì)被培訓(xùn)者現(xiàn)有狀況和理想狀況的調(diào)查與分析，確定二者的差距，為確定是否需要培訓(xùn)及需要培訓(xùn)的內(nèi)容提供依據(jù)。

圖1 LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的分離于兩種褐飛虱種群中的共生細(xì)菌Fig. 1 Symbiotic bacteria isolated from two different populations of Nilaparvata lugens grown on LB mediumA: BPH-S1; B: BPH-S2; C: BPH-S5; D: BPH-S14; E: BPH-S16; F: BPH-S17; G: BPH-S18; H:BPG-S20; I: BPH-S28; J: BPH-S32; K: H-S33; L: BPH-S34; M: BPH-S36; N: BPH-S42; O: BPH-S47. 菌種編號(hào)和菌落形態(tài)描述見表1。下同。See Table 1 for bacterial no. and description of colonial morphology. The same below.

褐飛虱DNA的提取和qPCR分析所用引物和方法均參照(Wang等, 2015)。

1.2.5 盆栽實(shí)驗(yàn) 種子在超凈臺(tái)中處理，用75%的酒精浸泡種子3 min，用無菌濾紙吸干，然后用1%的次氯酸鈉浸泡3 min，用無菌濾紙吸干，用75%的酒精沖洗種子30 s，最后用無菌水沖洗3遍，用無菌濾紙吸干，待種子徹底干燥后，用發(fā)酵4 d的生防菌原液浸泡30 min[7]。

圖2 應(yīng)用鄰接法構(gòu)建的基于16S rDNA序列的褐飛虱芽孢桿菌類共生菌和其他芽孢桿菌的聚類分析Fig. 2 Cluster analysis of the Bacillus spp. from Nilaparvatalugens and other Bacillus sp. based on 16S rDNAsequence using neighbor-joining method標(biāo)尺示每個(gè)核苷酸位置的替換率為0.02; 本研究獲得的芽孢桿菌類共生菌以三角形標(biāo)記。The scale bar indicates 0.02 substitutions per nucleotide position. The symbiotic Bacillus spp. isolated in this study are marked by triangle.

采用SPSS19.0的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 共生菌在褐飛虱體內(nèi)的分布

共生菌分布的檢測(cè)參照王渭霞等(2022)。顯微鏡下分離解剖褐飛虱成蟲各組織置于4%多聚甲醛中,6 ℃固定16 h。經(jīng)超聲和蛋白酶K處理后,PBS緩沖液清洗。用雜交緩沖液清洗3次后,加入含有探針(終濃度為300 μg/L)的雜交液,37 ℃過夜雜交。吸出雜交液,清洗3次后,在偶聯(lián)堿性磷酸酯酶的抗地高辛抗體溶液中孵育2 h。PBS清洗數(shù)次后,用BCIP/NBT顯色劑對(duì)雜交后樣本進(jìn)行顯色。甲醇除去背景色后,加入PBS并在顯微鏡下觀察拍照。

5.勞動(dòng)力流出嚴(yán)重。由于各個(gè)因素導(dǎo)致農(nóng)村經(jīng)濟(jì)收入較低，年輕勞動(dòng)力被迫外出他鄉(xiāng)。有的父母為了子女的教育問題不得不帶上自己的子女，甚至舉家搬遷到條件較好的地區(qū)安家落戶。因?yàn)閯趧?dòng)力的流出從而導(dǎo)致田地荒蕪、消費(fèi)流出、空巢老人，空巢子女等一系列問題。這一列問題導(dǎo)致了生產(chǎn)力的下降，從而影響了經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

圖3 16S rDNA通用探針檢測(cè)共生細(xì)菌在褐飛虱成蟲組織中的原位雜交定位Fig. 3 Localization of symbiotic bacteria in adult tissues of Nilaparvata lugens by in situ hybridization with 16S rDNA universal probeA: 腸道Gut; B: 唾液腺Salivary gland; C: 卵巢和脂肪體Ovary and fat body; D: 卵Egg; E: 雄蟲內(nèi)生殖器Male internal genitalia.

2.3 抗生素處理和回補(bǔ)芽孢桿菌對(duì)褐飛虱存活率以及共生菌含量的影響

結(jié)果表明,飼喂抗生素后,褐飛虱若蟲在TN1水稻上飼養(yǎng)3和6 d時(shí)的存活率分別為37.4%±6.0%和14.5%±4.0%,顯著低于對(duì)照組(分別為85.0%±4.1%和76.3%±4.3%)。回補(bǔ)稀釋50×的OD600為0.8時(shí)的芽孢桿菌菌株BPH-36(2.1×107cfu/mL)可顯著提高褐飛虱在TN1水稻上3和6 d時(shí)的存活率,其存活率分別上升至66.7%±6.0%和63.3%±1.7%;回補(bǔ)稀釋50×的OD600為0.8時(shí)的BPH-S33(2.1×106cfu/mL)可使存活率分別上升至64.5%±7.0%和52.5%±2.5%(圖4)。研究結(jié)果提示,抗生素的處理可以顯著降低褐飛虱的存活率,而芽孢桿菌的回補(bǔ)有助于恢復(fù)褐飛虱的存活率。

圖4 芽孢桿菌的飼喂對(duì)抗生素利福平處理褐飛虱若蟲存活率的影響Fig. 4 Effects of feeding with Bacillus spp. on the survival rate of Nilaparvata lugens nymphs after treatment with the antibiotic Rif3 d: 為褐飛虱在人工飼料飼養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至水稻飼養(yǎng)3 d時(shí)的若蟲存活率Survival rate of nymphs when transferred to rice TN1 for 3 d after being fed on artificial diet; 6 d: 為褐飛虱在人工飼料飼養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至水稻TN1飼養(yǎng)6 d時(shí)的若蟲存活率Survival rate of nymphs when transferred to rice TN1 for 6 d after being fed on artificial diet. TN1: TN1種群的若蟲在人工飼料持續(xù)飼養(yǎng)4 d Nymphs of TN1 population were fed on artificial diet for 4 d; TN1+Rif: TN1種群若蟲在添加利福平的人工飼料飼養(yǎng)2 d后用正常飼料繼續(xù)飼養(yǎng)2 d Nymphs of TN1 population were fed on the artificial diet supplemented with Rif for 2 d and then fed on the normal diet for 2 d; TN1+Rif+S36: TN1種群若蟲在添加利福平的人工飼料飼養(yǎng)2 d后,用添加BPH-S36菌液(OD600為0.8,50×稀釋)的人工飼料繼續(xù)飼養(yǎng)2 d Nymphs of TN1 population were fed on the artificial diet supplemented with Rif for 2 d, and then fed on the artificial diet supplemented with BPH-S36 bacterial suspension (OD600=0.8, diluted 50×) for 2 d]; TN1+Rif+S33: TN1種群若蟲在添加利福平的人工飼料飼養(yǎng)2 d后,用添加BPH-S33菌液(OD600為0.8, 50×稀釋)的人工飼料繼續(xù)飼養(yǎng)2 d Nymphs of TN1 population were fed on the artificial diet supplemented with Rif for 2 d, and then fed on the artificial diet supplemented with BPH-S33 bacterial suspension (OD600=0.8, diluted 50×) for 2 d. 圖5同。The same for Fig.5. 所有起始蟲均為經(jīng)6 h饑餓處理的TN1種群2齡末若蟲。All the initial nymphs were the late 2nd instar nymphs of TN1 population and starved for 6 h. 柱上不同字母示經(jīng)Tukey氏多重比較檢驗(yàn)在0.05水平上有顯著差異。圖5和8(D)同。Different letters above bars indicate significant difference at the 0.05 level (Tukey’s multiple comparisons). The same for Figs.5 and 8(D).

取抗生素處理2 d和稻苗上飼養(yǎng)6 d的褐飛虱,提取DNA。利用qPCR方法分析不同樣本中共生菌總相對(duì)豐度以及腸桿菌科、芽孢桿菌和YLS相對(duì)豐度?？股靥幚? d可以使褐飛虱體內(nèi)共生菌總相對(duì)豐度以及腸桿菌科和芽孢桿菌相對(duì)豐度分別顯著降低77.3%, 73.8%和70.2%(共生菌:P=0.003; 腸桿菌科:P=0.004; 芽孢桿菌:P=0.013)(圖5: A-C),但對(duì)YLS相對(duì)豐度無顯著影響(P>0.05)(圖5: D)。抗生素減菌處理2 d的褐飛虱回補(bǔ)飼喂含芽孢桿菌BPH-S33和BPH-S36的飼料2 d,并在稻株上飼養(yǎng)至6 d時(shí),抗生素處理后共生菌BPH-S36和BPH-S33的回補(bǔ)飼喂沒有顯著增加共生菌總相對(duì)豐度和腸桿菌科相對(duì)豐度(圖5: A, C)(P>0.05),但使芽孢桿菌相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照抗生素處理組(BPH-S36:P=0.001; BPH-S33:P=0.003)(增加了16～18倍)(圖5: B)。

圖5 抗生素和芽孢桿菌的飼喂對(duì)褐飛虱共生菌相對(duì)豐度的影響Fig. 5 Effects of feeding with antibiotic and Bacillus spp. on the relative abundance of symbionts in Nilaparvata lugensA: 共生菌總相對(duì)豐度Total relative abundance of symbionts; B: 芽孢桿菌相對(duì)豐度Relative abundance of Bacillus spp.; C: 腸桿菌科相對(duì)豐度Relative abundance of Enterobacteriaceae; D: YLS相對(duì)豐度Relative abundance of YLS. YLS: 類酵母共生菌Yeast-like symbiont. 圖7和10同。The same for Figs. 7 and 10. 2 d: 樣品取自于抗生素處理2 d的褐飛虱Sample was from N. lugens treated with antibiotic for 2 d; 6 d: 樣品取自于水稻上飼養(yǎng)6 d的褐飛虱 Sample was from N. lugens raised on rice for 6 d.

2.4 芽孢桿菌的飼喂對(duì)褐飛虱致害力以及共生菌豐度的影響

上述實(shí)驗(yàn)表明芽孢桿菌BPH-S36和BPH-S33的回補(bǔ)對(duì)抗生素處理后褐飛虱的生長(zhǎng)發(fā)育有利,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步給敏感種群TN1額外添加該共生菌驗(yàn)證是否會(huì)提高其致害力。為此,將饑餓處理6 h的TN1種群的3齡若蟲分別飼養(yǎng)在添加稀釋50×和100×的共生菌BPH-S36和BPH-S33的人工飼料中,連續(xù)飼養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)接至抗蟲水稻IR56上。其中在正常飼料飼養(yǎng)2 d的TN1種群若蟲作為陰性對(duì)照,飼養(yǎng)2 d的IR56種群若蟲作為陽(yáng)性對(duì)照。所有處理用飼料飼喂2 d后轉(zhuǎn)至IR56水稻上繼續(xù)飼養(yǎng)10 d后計(jì)算存活率。結(jié)果表明: IR56種群若蟲在IR56水稻上的存活率(70.6%±4.2%)顯著高于TN1種群的(52.1%±1.5%)(P=0.002)。BPH-S36的添加有助于提高褐飛虱TN1種群在IR56水稻上的存活率,用稀釋50×和100×的BPH-S36菌液飼喂后其存活率顯著提高(50×:P=0.023; 100×:P=0.046),分別達(dá)到64.2%±3.0% (P=0.023)和62.5%±2.6%(P=0.046)(圖6)。BPH-S33的添加對(duì)TN1種群若蟲在IR56水稻的存活率無顯著提高作用(P>0.05)。

圖6 芽孢桿菌的飼喂對(duì)褐飛虱TN1種群若蟲在IR56水稻上存活率的影響Fig. 6 Effects of feeding with Bacillus spp. on the survival rate of nymphs from TN1 population of Nilaparvata lugens reared on IR56 riceTN1-CK-: 正常人工飼料飼喂的若蟲,為陰性對(duì)照Nymphs fed on the normal artificial diet as the negative control; TN1+ S36 50×: 添加稀釋50×的BPH-S36菌液的人工飼料飼喂的若蟲Nymphs fed on the artificial diet added with BPH-S36 bacterial suspension in 50-fold dilution; TN1+ S36 100×: 添加稀釋100×的BPH-S36菌液的人工飼料飼喂的若蟲Nymphs fed on the artificial diet added with BPH-S36 bacterial suspension in 100-fold dilution; TN1+ S33 50×: 添加稀釋50×的BPH-S33菌液的人工飼料飼喂的若蟲Nymphs fed on the artificial diet added with BPH-S33 bacterial suspension in 50-fold dilution; TN1+ S33 100×: 稀釋100×的BPH-S33菌液的人工飼料飼喂的若蟲Nymphs fed on the artificial diet added with BPH-S33 bacterial suspension in 100-fold dilution; IR56-CK+: 饑餓6 h的IR56種群3齡若蟲,作為陽(yáng)性對(duì)照3rd instar nymphs from IR56 population starved for 6 h, as the positive control. 除陽(yáng)性對(duì)照樣品為饑餓處理6 h的IR56種群3齡若蟲外,其余處理的蟲源均為饑餓處理6 h的來源于TN1種群的3齡若蟲。在不同的人工飼料上飼養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)接在IR56水稻持續(xù)飼養(yǎng)10 d時(shí)統(tǒng)計(jì)存活率。每個(gè)重復(fù)的初始若蟲數(shù)量為40頭,每個(gè)處理重復(fù)3次。圖中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;柱上星號(hào)和雙星號(hào)分別表示與陰性對(duì)照相比在P<0.05和P<0.01水平上有顯著和極顯著差異(Student氏t檢驗(yàn))。The sample in the positive control was the 3rd instar nymph from IR56 population after 6 h starvation, while those in other treatments were the 3rd instar nymphs from TN1 population after 6 h starvation. After N. lugens nymphs were fed with different artificial diets for 2 d and then transferred to IR56 rice, the survival rate was calculated when reared for 10 d. The initial number of nymphs per repeat was 40 and each treatment was repeated for 3 times. Data in the figure are mean±SE. Asterisk and double asterisk above bars indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively, from the negative control based on Student’s t-test. 圖7同。The same for Fig.7.

“十一五”開始，我國(guó)以剛性約束手段對(duì)大氣主要污染物實(shí)行總量控制，在全國(guó)范圍內(nèi)開展了SO2總量減排實(shí)踐，“十二五”在SO2基礎(chǔ)上增加了NOx減排指標(biāo)，“十三五”已將大氣環(huán)境質(zhì)量改善目標(biāo)作為減排考核中心[14]。而火電行業(yè)作為大氣污染物的重點(diǎn)排放源，是總量控制重點(diǎn)監(jiān)管的領(lǐng)域。2006年國(guó)家環(huán)保部頒布的《二氧化硫總量分配指導(dǎo)意見》中加強(qiáng)和規(guī)范了SO2總量分配的落實(shí)工作，按照區(qū)域和時(shí)段(《火電廠大氣污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》)劃分，統(tǒng)一規(guī)定排放績(jī)效值，將排放績(jī)效引入電力行業(yè)的二氧化硫總量分配中，其中東部地區(qū)第Ⅲ時(shí)段機(jī)組SO2排放績(jī)效為0.7 g/kWh，詳見圖1。

利用qPCR方法檢測(cè)了BPH-S36和BPH-S33的飼喂對(duì)褐飛虱TN1種群若蟲體內(nèi)共生菌相對(duì)豐度的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):50×稀釋的BPH-S36和BPH-S33的飼喂可使褐飛虱共生菌總相對(duì)豐度分別顯著提高(24.6±0.7)和(7.3±0.0)倍(BPH-S36:P=0.014; BPH-S33:P=0.023)(圖7: A),使芽孢桿菌相對(duì)豐度分別顯著提高(23.2±33.0)和(24.5±2.6)倍(BPH-S36:P=0.0417; BPH-S33:P=0.0001)(圖7: B),使腸桿菌科相對(duì)豐度分別提高(18.7±8.6)和(7.2±1.0)倍(BPH-S36:P=0.016; BPH-S33:P=0.001)(圖7: C),使YLS相對(duì)豐度也分別顯著上升(12.0±8.0)和(5.6±2.3)倍(BPH-S36:P=0.005; BPH-S33:P=0.027)(圖7: D);而100×稀釋的BPH-S36和BPH-S33的飼喂沒有提高褐飛虱TN1種群若蟲體內(nèi)芽孢桿菌相對(duì)豐度(圖7: B)。結(jié)果表明高濃度的芽孢桿菌的引入改變了褐飛虱體內(nèi)共生微生物的相對(duì)豐度。

圖7 芽孢桿菌的飼喂對(duì)褐飛虱TN1種群若蟲中中共生菌豐度的影響Fig. 7 Effects of feeding with Baccillus spp. on the abundance of symbionts in nymphs of TN1 population of Nilaparvata lugens

利用LB梯度稀釋培養(yǎng)的方法對(duì)源于TN1種群、IR56種群和飼喂共生芽孢桿菌后TN1種群雌成蟲體內(nèi)可培養(yǎng)共生菌進(jìn)行了菌落數(shù)量的比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IR56種群體內(nèi)可培養(yǎng)共生菌的數(shù)量(6.4×105cfu/雌)要顯著高于TN1種群體內(nèi)的(2.7×105cfu/雌)(圖8: A, D)。引入稀釋50×和100×的BPH-S36后,可使褐飛虱雌成蟲體內(nèi)可培養(yǎng)共生菌的數(shù)量從2.7×105cfu/雌分別增加到11.5×105和6.0×105cfu/雌(圖8: B, D)。而BPH-S33的引入未顯著改變可培養(yǎng)共生菌的數(shù)量(圖8: C, D)。

2.5 褐飛虱若蟲顯微注射芽孢桿菌對(duì)其致害力和共生菌豐度的影響

通過顯微注射的方法,將不同含量的共生菌BPH-S36和BPH-S33注入褐飛虱TN1種群若蟲體內(nèi)。相當(dāng)于每蟲注射細(xì)菌數(shù)量BPH-S36為2.1×104或1.0×103cfu, BPH-S33為2.1×103或1.0×102cfu。統(tǒng)計(jì)5 d時(shí)的存活率,結(jié)果表明:IR56種群在IR56水稻上5 d時(shí)的若蟲存活率(80.7%±0.7%)顯著高于TN1種群若蟲在IR56水稻上的存活率(57.3%±5.5%)(P=0.0162)。顯微注射兩種共生菌菌液后并沒有顯著提升TN1種群若蟲在IR56水稻上的存活率(P>0.05)(圖9)。qPCR檢測(cè)結(jié)果表明,通過顯微注射的方法BPHS36和BPH-S33對(duì)褐飛虱共生菌總相對(duì)豐度(圖10: A)、芽孢桿菌相對(duì)豐度(圖10: B)、腸桿菌科細(xì)菌相對(duì)豐度(圖10: C)均沒有顯著影響(P>0.05),但高濃度芽孢桿菌BPH-S33的注射可使褐飛虱YLS相對(duì)豐度有顯著的上升(P<0.05)(圖10: D)。

圖9 芽孢桿菌的顯微注射對(duì)褐飛虱TN1種群若蟲在IR56水稻上存活率的影響Fig. 9 Effects of microinjection of Bacillus spp. on the survival rate of nymphs from TN1 population of Nilaparvata lugens on IR56 riceIR56-CK+: IR56種群3齡若蟲被注射水,作為陽(yáng)性對(duì)照3rd instar nymphs from IR56 population injected with water, as the positive control; TN1-CK-: TN1種群3齡若蟲被注射水,作為陰性對(duì)照3rd instar nymphs from TN1 population injected with water, as the negative control; TN1+S36 50×: TN1種群3齡若蟲注射稀釋50×的BPH-S36菌液3rd instar nymphs from TN1 population injected with BPH-S36 bacterial suspension in 50-fold dilution; TN1+ S36 100×: TN1種群3齡若蟲注射稀釋100×的BPH-S36菌液3rd instar nymphs from TN1 population injected with BPH-S36 bacterial suspension in 100-fold dilution; TN1+ S33 50×: TN1種群3齡若蟲注射稀釋50×的BPH-S33菌液3rd instar nymphs from TN1 population injected with BPH-S33 bacterial suspension in 50-fold dilution; TN1+ S33 100×: TN1種群3齡若蟲注射稀釋100×的BPH-S33菌液 3rd instar nymphs from TN1 population injected with BPH-S33 bacterial suspension in 100-fold dilution. 每個(gè)處理重復(fù)3次,每個(gè)重復(fù)40頭。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤; 柱上雙星號(hào)表示與陰性對(duì)照相比在P<0.01水平上有顯著差異(Student氏t測(cè)驗(yàn))。Each treatment has 3 replicates, each with 40 individuals. Data in the figure are mean±SE. Double asterisk above bars indicate significant difference (P<0.01) from the negative control based on Student’s t-test. 圖10同。The same for Fig. 10.

圖10 芽孢桿菌的顯微注射對(duì)褐飛虱TN1種群共生菌豐度的影響Fig. 10 Effects of microinjection of Baccillus spp. on the abundance of symbionts in TN1 population of Nilipavata lugens芽孢桿菌注射后在IR56水稻上飼養(yǎng)5 d時(shí)的活若蟲為采集樣本。Samples were collected from live nymphs reared on IR56 rice for 5 d after injection of Baccillus spp.

3 討論

從褐飛虱兩種不同致害性種群中分離培養(yǎng)出9個(gè)屬的15株不同共生細(xì)菌。以其中1株芽孢桿菌的DNA為模板合成探針用于檢測(cè)以芽孢桿菌為主的共生細(xì)菌的分布,發(fā)現(xiàn)共生細(xì)菌在褐飛虱的唾液腺、脂肪體、腸道和雌蟲生殖器中均有分布(圖3),這與前人報(bào)道的結(jié)果(Zhangetal., 2018, 2019)一致?？股氐鹊奶幚頃?huì)使昆蟲體內(nèi)共生菌的豐度或組成發(fā)生變化,這種微生態(tài)的變化會(huì)進(jìn)而影響其生存和繁殖(Zhangetal., 2020)。當(dāng)褐飛虱取食噴施了豐加霉素、戊唑醇和中生霉素的水稻時(shí),其死亡率分別達(dá)到35.5%, 33.1% 和 19.4%。不同抗生素處理對(duì)不同屬的共生菌豐度的影響也不完全一致(Shietal., 2021; Songetal., 2021)。在蜜蜂中抗生素處理會(huì)對(duì)腸道微生物組的大小和組成產(chǎn)生持久影響,進(jìn)而導(dǎo)致存活率的降低(Raymannetal., 2017)。我們通過人工飼料的方式給褐飛虱若蟲飼喂抗生素利福平,發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)共生菌的總相對(duì)豐度顯著降低,而對(duì)YLS相對(duì)豐度沒有顯著影響(圖5);褐飛虱表現(xiàn)為若蟲存活率下降(圖4);通過飼喂回補(bǔ)共生細(xì)菌,發(fā)現(xiàn)共生芽孢桿菌有助于恢復(fù)抗生素處理后褐飛虱的存活率(圖4)。這些結(jié)果直接證明了共生芽孢桿菌在褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育中具有的重要作用。

費(fèi)里斯州立大學(xué)西密歇根英語語言學(xué)院的強(qiáng)化英語課程分為初級(jí)(Beginning Level)、一級(jí)(Level 1)、二級(jí)(Level 2)和三級(jí)(Level 3)，共四個(gè)水平等級(jí)。所有強(qiáng)化英語課程的新生在學(xué)期開始之前必須參加入學(xué)英語能力考試。學(xué)生將根據(jù)考試成績(jī)分配到不同等級(jí)水平的班級(jí)。通過強(qiáng)化英語課程的學(xué)習(xí)，學(xué)生通過考試達(dá)到學(xué)院的語言要求可在下一學(xué)期轉(zhuǎn)入專業(yè)學(xué)習(xí)。一般中國(guó)學(xué)生需要一至兩個(gè)學(xué)期的時(shí)間達(dá)到專業(yè)學(xué)習(xí)的語言要求。學(xué)院還開設(shè)過渡期英語課程（Academic Bridge Course）。滿足專業(yè)學(xué)院語言能力要求的學(xué)生可以同時(shí)選修強(qiáng)化語言課程與專業(yè)課程。

褐飛虱IR56種群具備較強(qiáng)的致害抗性水稻IR56的能力,能夠在IR56上正常生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖,可以通過若蟲發(fā)育歷期、初羽化雌雄蟲體重、蜜露量以及成蟲壽命、單雌產(chǎn)卵量等指標(biāo)與敏感的TN1種群進(jìn)行明顯區(qū)分(鄭瑜等, 2016)。通過飼喂的方式將源于褐飛虱致害性強(qiáng)的IR56種群體內(nèi)的共生芽孢桿菌引入敏感種群TN1,不僅改變了TN1種群的共生菌的數(shù)量及組成,同時(shí)提高了敏感種群取食抗性水稻IR56的能力。本研究發(fā)現(xiàn)在TN1種群中飼喂引入稀釋100× BPH-S36,在抗蟲水稻IR56上飼養(yǎng)10 d后芽孢桿菌的數(shù)量未顯著增加(圖7: B),但其對(duì)IR56水稻的致害力卻有顯著增加(圖6)。這種對(duì)抗性水稻致害力的變化可能源于共生芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物,也可能源于共生芽孢桿菌與體內(nèi)其他共生菌互作。有研究表明在褐飛虱中引入共生菌Cardinium后會(huì)提高中腸中不動(dòng)桿菌屬的相對(duì)密度,從而引起褐飛虱主要微生物功能的變化(Lietal., 2020)。本研究發(fā)現(xiàn)在TN1種群中飼喂引入稀釋50× BPH-S36或50× BPH-S33,在抗蟲水稻IR56上飼養(yǎng)10 d后qPCR檢測(cè)顯示芽孢桿菌、總共生菌、腸桿菌科以及YLS的相對(duì)豐度都有顯著增加(圖7)。我們推測(cè),芽孢桿菌的增加引起的整個(gè)微生態(tài)的重塑和褐飛虱的轉(zhuǎn)錄組變化,進(jìn)而導(dǎo)致了與抗性水稻IR56互作的變化,這有待進(jìn)一步深入研究。有研究者通過顯微胚胎注射的方式給褐飛虱成功引入了外源共生細(xì)菌Cardinium(Lietal., 2020)。本實(shí)驗(yàn)通過顯微注射若蟲的方法來引入外源共生菌,結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯微注射共生菌的方式不能夠改變褐飛虱體內(nèi)共生菌的豐度。

本研究從褐飛虱強(qiáng)致害性種群IR56中分離獲得了兩株芽孢桿菌,對(duì)褐飛虱致害能力的影響從目前數(shù)據(jù)看表現(xiàn)不完全一致,其中BPH-S36的增加可以提高TN1種群在IR56水稻上的存活率,而BPH-S33的增加并沒有顯著提升其在IR56水稻上的存活率(圖6)。這可能與菌株差異有關(guān),也有可能與引入密度不同有關(guān)。其中BPH-S33表現(xiàn)為菌落大、扁平,在培養(yǎng)至OD600同樣濃度的時(shí)候,其細(xì)胞數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于BPH-S36。因此,在同樣稀釋倍數(shù)后的引入可能導(dǎo)致BPH-S33的數(shù)量不足以引起褐飛虱體內(nèi)整個(gè)微生態(tài)平衡的重大重塑。定量PCR結(jié)果顯示BPH-S33和BPH-S36的增加可使褐飛虱若蟲體內(nèi)共生細(xì)菌的總相對(duì)豐度,腸桿菌科和YLS的相對(duì)豐度發(fā)生顯著上升(圖7);同時(shí)BPH-S36的增加還可以顯著提高褐飛虱若蟲體內(nèi)可培養(yǎng)共生菌的相對(duì)豐度(圖8)。由此可見,兩種不同的芽孢桿菌的引入對(duì)褐飛虱體內(nèi)微生態(tài)的影響在豐度和種類方面有所不同。

目前,對(duì)褐飛虱共生菌的研究以YLS的研究居多,該菌的功能主要表現(xiàn)為提供必需氨基酸和尿素的循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)與取食感蟲品種水稻TN1的褐飛虱相比,連續(xù)取食IR26(含Bph1抗性基因)二代后褐飛虱體內(nèi)YLS豐度顯著降低,第3代后蟲體內(nèi)共生菌豐度又有所回升(陳發(fā)軍等, 2006)。Horgen和Ferrater(2017)的研究結(jié)果表明,YLS豐度的變化在褐飛虱的抗性水稻適應(yīng)和宿主植物轉(zhuǎn)換過程中幾乎沒有作用。本研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)飼養(yǎng)百代以上適應(yīng)了抗蟲水稻IR56的種群(IR56種群)中YLS的豐度顯著高于TN1種群,通過飼喂稀釋50×的BPH-S36和BPH-S33后可使褐飛虱體內(nèi)YLS的豐度也顯著增加。高濃度芽孢桿菌的顯微注入同樣使YLS的豐度顯著上升,但對(duì)IR56水稻的致害力的改變不盡一致。這表明YLS豐度的增加與褐飛虱對(duì)IR56水稻的致害力的增加之間無相關(guān)性。

本研究為進(jìn)一步深入研究褐飛虱共生微生物的生理功能及其與宿主的互作機(jī)制、充分利用共生微生物來調(diào)控其生長(zhǎng)發(fā)育提供參考。