宋 陽, 范琳琳, 申屠旭萍, 俞曉平

(中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310018)

昆蟲腸道組織作為昆蟲與外界環(huán)境的交界面,微生物組成和所處環(huán)境在不斷發(fā)生變化。在長期進(jìn)化過程中,昆蟲腸道中的大量共生微生物形成一個(gè)復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng),為宿主提供營養(yǎng)物質(zhì),參與有害物質(zhì)降解,促進(jìn)宿主生長發(fā)育和繁殖,協(xié)助宿主免疫系統(tǒng)的形成和成熟 (Weissetal., 2011),保護(hù)宿主免受寄生蟲和病原體侵害等(Kalappaetal., 2018; Suetal., 2019)。因此,維持腸道微生物群落穩(wěn)態(tài)、對(duì)抗和消滅外來病原體對(duì)于昆蟲的生存發(fā)育尤為重要。然而,腸道作為與外界相通的組織,昆蟲取食會(huì)帶來包括病原微生物在內(nèi)的復(fù)雜多樣的外來微生物,當(dāng)腸道上皮細(xì)胞被病原微生物或機(jī)會(huì)性病原體侵襲時(shí),會(huì)迅速激活宿主腸道的免疫防御反應(yīng),以此來抵抗和消除外來病原體。因此,昆蟲腸道免疫反應(yīng)在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的同時(shí)也極大地影響腸道微生物群落結(jié)構(gòu)(Haetal., 2005; Paredesetal., 2011; Bosco-Drayonetal., 2012; Bonnayetal., 2013; Leeetal., 2015)。同時(shí),腸道內(nèi)微生物的胞外代謝產(chǎn)物也會(huì)引起自身及其他種類的微生物種群數(shù)量的變化,腸道內(nèi)部的微生物物種間的交流和種群密度調(diào)節(jié)也是影響腸道微生物群落的關(guān)鍵因素。在多種條件刺激下,腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和群落多樣性隨之不斷變化,以維持腸道微生物穩(wěn)態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡(Wu and Luo, 2021)。由于造成腸道微生物群落穩(wěn)態(tài)失衡的因素復(fù)雜多樣,因此,昆蟲進(jìn)化出多種防御機(jī)制來維持腸道微生物穩(wěn)態(tài),主要有物理屏障、免疫調(diào)控通路產(chǎn)生抗菌肽、抗菌活性氧(reactive oxygen species, ROS)以及群體感應(yīng)(quorum sensing, QS)實(shí)現(xiàn)微生物間的調(diào)節(jié)(圖1)。本綜述將從腸道的物理防御作用、免疫調(diào)控作用包括免疫缺陷(immunodeficiency, Imd)、雙重氧化酶-活性氧(dual oxidase-reactive oxygen species, Duox-ROS)和Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)通路、腸道共生微生物間的群體響應(yīng)效應(yīng)等幾個(gè)方面綜述維持昆蟲腸道微生物群穩(wěn)定的作用機(jī)制。

1 物理屏障在昆蟲腸道抵御外來病原體中的作用

昆蟲消化道是從口腔延伸到肛門的連續(xù)管狀器官(Buchonetal., 2009),包括前腸、中腸和后腸。前腸的主要作用是消化和貯存食物。昆蟲前腸與中腸的連接處稱為賁門,具有多種形態(tài),主要是將食物分解并且調(diào)節(jié)食物進(jìn)入中腸(Buchonetal., 2013b),同時(shí)能夠發(fā)揮免疫防御作用,例如在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Tzouetal., 2000)和采采蠅(tsetse fly) (Vallet-Gelyetal., 2008)中賁門可以有效地防止大于0.2 μm的細(xì)菌和顆粒進(jìn)入中腸和后腸。中腸表面具有一層圍食膜(peritrophic membrane, PM),能夠充當(dāng)屏障隔絕中腸上皮細(xì)胞與腸道管腔(Vallet-Gelyetal., 2008),該結(jié)構(gòu)將腸上皮細(xì)胞與腸腔內(nèi)容物分隔開來,當(dāng)食物以及微生物進(jìn)入中腸腔后,圍食膜能夠隔絕病原微生物進(jìn)入腸道上皮細(xì)胞,進(jìn)而對(duì)宿主提供了物理防御作用。

對(duì)于不同昆蟲物種的研究表明,圍食膜除了可以防止細(xì)菌直接與腸上皮接觸外,還限制了細(xì)菌毒素、食物顆粒與中腸上皮之間的接觸(Hegedusetal., 2009)。通過對(duì)意大利蜜蜂Apismelliferaligustica腸道研究發(fā)現(xiàn),飼喂有效微生物后中腸圍食膜厚度和致密度有一定的增加(金湯東等, 2009)。在粉紋夜蛾Trichoplusiani圍食膜中發(fā)現(xiàn)了一種高O-糖基化的粘蛋白,被稱為昆蟲腸粘蛋白(insect intestinal mucin, IIM)。IIM通過二硫鍵與圍食膜幾丁質(zhì)網(wǎng)狀基質(zhì)緊密聯(lián)結(jié),可大大增強(qiáng)其物理強(qiáng)度發(fā)揮防御等功能(史晉絨等, 2010)。并且圍食膜的厚度和強(qiáng)度與腸道對(duì)病原體的敏感性相關(guān)聯(lián),圍食膜厚度大的較厚度小的昆蟲腸道抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)的表達(dá)水平高(Buchonetal., 2013a),這表明圍食膜可能介導(dǎo)腸道免疫激活,并在抵御病原體方面發(fā)揮重要作用。此外,昆蟲圍食膜還可結(jié)合植物毒性化合物,以抑制植株的某些次生代謝物和中腸微絨毛表面及中腸表面的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白融合,進(jìn)而發(fā)揮對(duì)中腸上皮細(xì)胞的防護(hù)效果。例如對(duì)沙漠蝗Sehistoceragregaria圍食膜保護(hù)作用的研究表明,30%的有毒物質(zhì)——單寧(一種酚類物質(zhì))附著到圍食膜上,并伴隨沙漠蝗每次蛻皮的過程,隨圍食膜一起排出體外(相靜波等, 2004)。同時(shí),圍食膜具有抗氧化作用的圍食膜基質(zhì)(perigoretic membrane matrix, PMM)和海藻糖(trehalose)對(duì)昆蟲食物中潛在的有毒物質(zhì)進(jìn)行降解,降低其對(duì)蟲體腸道的毒害作用(胡小龍和吳小鋒, 2012)。因此,圍食膜的組成結(jié)構(gòu)、圍食膜的厚度變化都會(huì)影響腸道細(xì)胞對(duì)微生物的敏感性和免疫特性,進(jìn)而導(dǎo)致腸道微生物組成的變化。此外,腸道干細(xì)胞(intestinal stem cells, ISC)在腸道免疫中也是至關(guān)重要的,只有當(dāng)腸道免疫防御系統(tǒng)和腸道組織更新二者的相互協(xié)調(diào),才能有效防御病原微生物(Zengetal., 2022)。

2 Imd信號(hào)通路在昆蟲腸道微生物穩(wěn)態(tài)中的調(diào)控

病原微生物進(jìn)入昆蟲體內(nèi)后,會(huì)激活昆蟲腸道內(nèi)的免疫代謝通路,進(jìn)而產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來殺死病原微生物。在腸道免疫中,AMPs的產(chǎn)生很大程度上依賴于Imd信號(hào)通路(Ryuetal., 2006; Buchonetal., 2009)。Imd通路主要通過兩種受體分子,主要是模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor, PGRP)家族的跨膜蛋白受體PGRP-LC和細(xì)胞質(zhì)識(shí)別受體PGRP-LE,識(shí)別革蘭氏陰性細(xì)菌和芽孢桿菌屬Bacillus物種細(xì)胞壁的二氨基庚二酸(diaminopimelate, DAP)型肽聚糖(peptidoglycan, PGN),并與細(xì)菌的細(xì)胞壁成分相結(jié)合,激活核苷酸轉(zhuǎn)錄因子Relish介導(dǎo)抗菌物質(zhì)AMP基因的表達(dá)(Hultmark, 2003; Kamareddineetal., 2018)。此外,在PGRP-LC上游的肽聚糖識(shí)別蛋白PGRP-SD能夠增強(qiáng)DAP型肽聚糖在細(xì)胞跨膜受體PGRP-LC上的結(jié)合信號(hào),也是激活I(lǐng)md通路所必需的成分(Lananetal., 2016)(圖1)。

然而,腸道中除了病原微生物外還有大量的共生微生物,這些微生物均具有細(xì)胞壁的成分,若是沒有抑制Imd通路的機(jī)制將導(dǎo)致Imd通路產(chǎn)生大量的AMPs,對(duì)腸道菌群穩(wěn)態(tài)的維持造成不利影響。因此,昆蟲腸道需要多種機(jī)制來保證Imd通路的適當(dāng)反應(yīng),以保證腸道在維持共生微生物存在的條件下也能實(shí)現(xiàn)對(duì)病原微生物的免疫防御作用。常見的調(diào)節(jié)路徑有3種:(1)由微生物在腸道內(nèi)的不同生長繁殖活力來區(qū)分病原微生物和共生微生物;病原微生物在進(jìn)入宿主體內(nèi)后會(huì)大量增殖,在細(xì)胞分裂過程中肽聚糖會(huì)大量合成,導(dǎo)致Imd通路被激活;而正常條件下,共生微生物的生長繁殖速度較低,盡管共生微生物可以激活I(lǐng)md通路,但它們不會(huì)觸發(fā)該通路中抗菌物質(zhì)AMP基因的表達(dá)(Ryuetal., 2008; Buchonetal., 2013a),也不會(huì)引起腸道內(nèi)Imd通路過度激活而對(duì)自身造成威脅。(2)宿主采用負(fù)調(diào)控機(jī)制來調(diào)節(jié)Imd信號(hào)通路,通過表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)因子來實(shí)現(xiàn)Imd通路的抑制作用(Liuetal., 2019)。這些負(fù)調(diào)節(jié)因子屬于一類具有酰胺酶活性的PGRP家族蛋白(PGRP-LB, PGRP-SB1, PGRP-SB2, PGRP-SC1a, PGRP-SC1b和PGRP-SC2),它們通過切割肽聚糖而減少腸道免疫刺激物,以此從根本上防止免疫通路的過度激活(Bischoffetal., 2006; Zaidman-Rémyetal., 2006; Paredesetal., 2011)(圖1)。(3)腸道AMPs特定區(qū)域的局部表達(dá)限制Imd通路的激活作用。使用綠色熒光蛋白報(bào)告基因來檢測AMPs的局部表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)除了果蠅菌素Drosocin (Dro)之外,其余每種AMPs都可在消化系統(tǒng)的特定區(qū)域表達(dá),以響應(yīng)局部感染(Tzouetal., 2000; Davis and Engstr?m, 2012)。此外,細(xì)胞核中具有多種功能因子改變Relish轉(zhuǎn)錄水平,選擇性地抑制AMP基因的表達(dá)(Zhaietal., 2018),阻礙腸尾側(cè)區(qū)域中AMP基因的轉(zhuǎn)錄(Ryuetal., 2004; Claytonetal., 2013) (圖1)。因此,Imd通路在腸道不同區(qū)域的負(fù)調(diào)控模式,會(huì)保證AMPs在腸道特定區(qū)域內(nèi)正常合成,而不會(huì)過度反應(yīng)傷害宿主。

Imd通路在昆蟲腸道共生微生物穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮巨大作用,例如,果蠅腸道的Imd信號(hào)通路感知并中和革蘭氏陰性細(xì)菌,并隨病原微生物的密度變化產(chǎn)生不同程度的免疫反應(yīng),此舉不僅使宿主在防止病原微生物感染的同時(shí)耐受有益的腸道微生物群(Kounatidisetal., 2017)。如果Imd信號(hào)通路的過度激活會(huì)導(dǎo)致腸道共生微生物生態(tài)失調(diào),進(jìn)一步加重腸道病理損傷(Kounatidisetal., 2017),同時(shí)會(huì)縮短宿主壽命(Neyenetal., 2016; Kounatidisetal., 2017),嚴(yán)重情況下甚至?xí)滤馈Ｒ虼?腸道微生物群內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)需要對(duì)免疫反應(yīng)的定位、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間都需要加以嚴(yán)密調(diào)控。機(jī)體依賴多個(gè)負(fù)反饋回路進(jìn)行調(diào)節(jié)Imd信號(hào)通路(Zhaietal., 2018),以確保在適當(dāng)時(shí)間和可調(diào)整范圍內(nèi)進(jìn)行免疫應(yīng)答(Kleino and Silverman, 2014)。例如通過PGRPs的負(fù)調(diào)控作用(Royet and Dziarski, 2007),在埃及伊蚊Aedesaegypti體內(nèi)RNAi干擾PGRP-LB和PGRP-SC基因證明PGRP-LB和PGRP-SC對(duì)Imd通路的負(fù)調(diào)節(jié)作用(Wang and Beerntsen, 2015),并且PGRP-SCs高表達(dá)導(dǎo)致AMPs的積累(Costechareyreetal., 2016)。除了PGRP-LB和PGRP-SCs之外,PGRP-LF也是Imd信號(hào)通路的特異性負(fù)調(diào)節(jié)因子,但PGRP-LF與PGRP-LB不同,PGRP-LF不是酰胺酶而是一種跨膜蛋白質(zhì)(Perssonetal., 2007; Basbousetal., 2011)。干擾PGRP-LE基因的表達(dá)能夠?qū)е略撌荏w對(duì)肽聚糖的識(shí)別能力降低,進(jìn)而抑制Imd通路,PGRP-LE對(duì)病原微生物的識(shí)別效率變差會(huì)致使昆蟲在革蘭氏陰性細(xì)菌感染后死亡率增大。此外,把與AMP合成密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Relish基因突變后發(fā)現(xiàn),昆蟲腸道菌群負(fù)荷增加,宿主清除病原微生物的能力顯著降低(Brodericketal., 2014; Xiaoetal., 2022)。綜上所述,抑制Imd通路的相關(guān)受體的識(shí)別效率或關(guān)鍵免疫基因的突變會(huì)導(dǎo)致腸道對(duì)病原微生物的防御能力變差,使得致病菌過度繁殖,從而造成了腸道菌群的失調(diào),最終危害宿主的正常生理健康。Imd信號(hào)通路在昆蟲腸道微生物群的諸多方面擔(dān)任中介作用,例如,研究發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊體內(nèi)的Imd通路的激活可能對(duì)中腸微生物群水平有一定的控制作用(Brodericketal., 2014)。另外,還有研究闡述了Imd通路產(chǎn)生的AMPs抵抗病原微生物的作用機(jī)制。以上研究揭示了Imd信號(hào)通路與腸道微生物群之間的關(guān)系,由此可見,Imd信號(hào)通路對(duì)昆蟲腸道微生物群的穩(wěn)態(tài)維持及昆蟲的生理和健康關(guān)系密切。

3 Duox-ROS信號(hào)通路在昆蟲腸道微生物穩(wěn)態(tài)中的調(diào)控

研究中發(fā)現(xiàn),缺乏Imd信號(hào)通路且無法在腸道中產(chǎn)生AMPs的昆蟲仍然可以在病原細(xì)菌感染中存活,這表明昆蟲腸道中存在有效的互補(bǔ)免疫機(jī)制(Haetal., 2005)。一種具有重要免疫反應(yīng)功能的通路:Duox-ROS通路,它可以被腸道共生微生物和病原體激活并調(diào)節(jié)昆蟲腸道微生物穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn),致病細(xì)菌可通過腸腔尿苷的核苷分解代謝產(chǎn)生尿嘧啶和核糖,這不僅觸發(fā)宿主防御,還觸發(fā)宿主腸道細(xì)菌間的交流和發(fā)病機(jī)制。尿苷衍生的尿嘧啶會(huì)觸發(fā)雙氧化酶依賴性活性氧的生成,而核糖會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌群體感應(yīng)和毒力基因的表達(dá)。與核苷酸代謝有關(guān)的基因存在于病原體中,而共生細(xì)菌不具有核苷代謝功能(Baietal., 2021)。因此,共生細(xì)菌缺乏功能性核苷分解代謝,這是腸道微生物實(shí)現(xiàn)共生所必需的,但腸道共生微生物可以通過啟用核苷分解代謝而發(fā)展為病原微生物(尤指條件致病微生物)。此發(fā)現(xiàn)揭示了在宿主-微生物相互作用的不同背景下,控制共生體向病原體轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制(Kimetal., 2020)。

研究表明,大多數(shù)共生細(xì)菌不會(huì)激活Duox活性,由于細(xì)菌肽聚糖只可以啟動(dòng)Duox基因表達(dá)通道,但無法啟動(dòng)Duox活化通道,從而無法形成ROS。而細(xì)菌代謝產(chǎn)生的尿嘧啶則是激活Duox酶活性的關(guān)鍵。由于共生細(xì)菌釋放很少尿嘧啶(Kimetal., 2020),而致病菌會(huì)釋放大量尿嘧啶,所以Duox-ROS能夠很好地區(qū)分腸道共生菌和腸道致病菌,有利于宿主抵抗病原體感染和維持腸道微生物穩(wěn)態(tài)(Yaoetal., 2016)(圖1)。Duox-ROS通路在無病原菌感染時(shí),共生菌可以激發(fā)基本量的ROS,降低共生菌的增殖速度,進(jìn)而限制共生菌數(shù)量。而有病原細(xì)菌感染時(shí),腸道內(nèi)細(xì)菌的負(fù)荷增加,不僅Duox蛋白表達(dá)水平和Duox活性顯著增加,ROS水平也顯著增加。但是由于ROS具有較高的細(xì)胞毒性,它也會(huì)破壞重要的細(xì)胞成分,例如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。這種破壞會(huì)導(dǎo)致腸道菌群穩(wěn)態(tài)的喪失和宿主疾病的發(fā)展,包括腸道細(xì)胞凋亡,并最終導(dǎo)致宿主死亡(付超然等, 2021)。Duox-ROS通路在腸道微生物維穩(wěn)作用中至關(guān)重要,將甜菜夜蛾Spodopteraexigua的Duox基因沉默后,腸道微生物群總體密度較含正常Duox功能的甜菜夜蛾的菌群密度要高得多,其中,蒙氏腸球菌Enterococcusmundtii密度顯著降低,而蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus密度有所上調(diào),所以Duox在調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)中也發(fā)揮重要作用(付超然等, 2021)。另外,在埃及伊蚊和黑腹果蠅中,當(dāng)腸道被感染時(shí),p38因子被激活產(chǎn)生更多的Duox以增加ROS的產(chǎn)生(圖1)。但是過量的ROS也會(huì)導(dǎo)致腸道細(xì)胞凋亡,為了保護(hù)昆蟲宿主免受過度氧化損傷,誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)的過氧化氫酶的表達(dá)可以從腸道中去除過多的ROS(Haetal., 2005),過氧化氫酶能夠?qū)⑦^氧化氫水解為水和O2,從而調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的氧化平衡(Volkertetal., 2000)。除了抗菌作用外,Duox依賴性ROS(如HOCl)還可以作為反應(yīng)性化學(xué)受體TrpA1的配體,進(jìn)而促進(jìn)病原微生物從腸道排泄,從而最大限度地減少病原微生物在宿主腸道適應(yīng)的機(jī)會(huì),防止病原體在宿主的防御系統(tǒng)中幸存下來(Duetal., 2016)?？傊?Duox-ROS信號(hào)通路在清除昆蟲腸道病原微生物和維持局部微生物的穩(wěn)態(tài)中起重要作用(Haetal., 2005)。

除了Duox-ROS信號(hào)通路的基因參與ROS的產(chǎn)生外,參與果蠅發(fā)育過程和細(xì)胞分化的Hedgehog(Hh)信號(hào)通路,在特定條件下會(huì)被尿嘧啶誘導(dǎo)激活調(diào)節(jié)Duox-Ros通路中Duox(雙氧化酶)的活化,尿嘧啶誘導(dǎo)下Hh信號(hào)的傳導(dǎo)對(duì)于鈣依賴性細(xì)胞粘附分子鈣粘蛋白99C(Cad99C)在腸道中的表達(dá)和隨后的鈣依賴性內(nèi)體的形成是必要的(Lee and Lee, 2018)(圖1)。這些內(nèi)體可用作Duox活性通路的激活信號(hào),該通路在尿嘧啶誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生中起重要作用(圖1)。Hh信號(hào)通路受損的動(dòng)物顯示Duox活性降低,這導(dǎo)致腸道感染期間的動(dòng)物高死亡率(Leeetal., 2015; Lee and Lee, 2018)。Hh信號(hào)功能恢復(fù)后,Duox活化和宿主正常存活得以恢復(fù),說明Hh信號(hào)通路在宿主抗腸道感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Leeetal., 2015)。

4 JAK/STAT信號(hào)通路在昆蟲腸道微生物穩(wěn)態(tài)中的調(diào)控

JAK/STAT信號(hào)通路在先天免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用(Renetal., 2015)。JAK是一類非受體酪氨酸激酶家族,它的底物為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子,N端具有SH2結(jié)構(gòu)域和核定位信號(hào)(nuclear localization signal, NLS),中間為DNA結(jié)合域,C端具有保守的酪氨酸殘基,對(duì)其活化至關(guān)重要。STAT被JAK磷酸化后產(chǎn)生二聚物,進(jìn)而穿透核膜進(jìn)入核中調(diào)節(jié)有關(guān)基因的表達(dá),這條信號(hào)通道叫做JAK/STAT通路。與哺乳動(dòng)物中JAK/STAT通路的成分相比(Owenetal., 2019),果蠅中該通路的組成結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單,包括酪氨酸JAK激酶hopscotch (Hop)、單向跨膜受體Domeless (Dome)、轉(zhuǎn)錄因子STAT92E以及3種不同的細(xì)胞因子,稱為Unpaired (Upd, Upd2和Upd3),即未配對(duì)的受體分子。以上3種Upd配體分子通過多個(gè)步驟嚴(yán)格控制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),并決定表達(dá)的抗菌肽的種類(圖1)。豌豆蚜Acyrthosiphonpisum具有JAK/STAT通路所有核心基因的同源物,包括編碼細(xì)胞因子受體無結(jié)構(gòu)域、JAK酪氨酸激酶和STAT92E轉(zhuǎn)錄因子的基因等(Gerardoetal., 2010)。該通路也存在一些負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子,包括Socs36E和Ptp61F下調(diào)JAK/STAT信號(hào)通路,以免該通路的過度激活(Renetal., 2015)。

盡管大多數(shù)AMPs受Imd通路的控制,但少數(shù)AMPs也受JAK/STAT通路的調(diào)節(jié),例如果蠅霉素樣肽(這些AMPs無抗細(xì)菌活性,卻具有抗真菌活性)(Buchonetal., 2009)。攝入導(dǎo)致細(xì)胞受損的化學(xué)試劑(例如十二烷基硫酸鈉或百草枯),可以誘導(dǎo)腸道中JAK/STAT和Upd3的表達(dá)水平(Buchonetal., 2009),并表達(dá)類果蠅霉素樣肽,所表達(dá)的抗菌肽種類取決于腸上皮細(xì)胞損傷后釋放的JAK/STAT通路相關(guān)配體Upd2和Upd3。JAK/STAT通路也具有維持腸道微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)的功能。常規(guī)情況下腸道與微生物相互作用會(huì)產(chǎn)生基礎(chǔ)量的Upd-JAK-STAT活性,而感染性和致病性的作用下會(huì)引起腸道組織損傷進(jìn)而增強(qiáng)Upd-JAK-STAT的活性(Hegedusetal., 2009)。Upd-JAK-STAT活性能夠提高腸道的免疫力,例如蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis侵染小菜蛾P(guān)lutellaxylostella腸道造成其腸道損傷后,JAK-STAT通路可以促進(jìn)小菜蛾中腸上皮細(xì)胞的修復(fù)(Linetal., 2020)。而干擾該通路會(huì)加劇微生物感染,例如從果蠅JAK/STAT通路中敲除轉(zhuǎn)錄因子Stat92E基因會(huì)增加初始感染的數(shù)量并降低致病菌的清除效率(Wangetal., 2019a)。除此之外,在其他模式昆蟲中,例如岡比亞按蚊Anophelesgambiae被細(xì)菌感染后體內(nèi)JAK/STAT免疫通路中的轉(zhuǎn)錄因子STAT92E會(huì)發(fā)生磷酸化和易位,也會(huì)激活JAK/STAT免疫通路(Hawveretal., 2016)。此外,最近的研究發(fā)現(xiàn),JAK/STAT通路在宿主防御病毒感染中也起著至關(guān)重要的作用(Wangetal., 2019b)。因此,腸道微生物群的負(fù)荷量受到JAK/STAT通路的調(diào)節(jié),進(jìn)而在某種程度上實(shí)現(xiàn)了腸道微生物穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。

5 群體響應(yīng)及免疫抵抗反應(yīng)在腸道微生物穩(wěn)態(tài)中的作用

越來越多的研究表明,除了腸道免疫調(diào)控作用能夠影響微生物群落外,共生微生物之間也會(huì)存在群體響應(yīng)(QS)調(diào)控機(jī)制來影響宿主腸道微生物的穩(wěn)態(tài)。QS依賴于細(xì)菌釋放的小分子(自誘導(dǎo)物),這些小分子根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞密度在環(huán)境中積累。這些分子不僅被微生物群落感知,而且與宿主細(xì)胞相互作用,有助于腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)。目前,有研究已經(jīng)證實(shí)腸上皮細(xì)胞可以識(shí)別細(xì)菌QS分子(Xiaoetal., 2022)。因此,對(duì)腸道細(xì)菌QS系統(tǒng)的進(jìn)一步研究應(yīng)有助于更全面、更深入地了解宿主與微生物群之間的共生關(guān)系。QS回路(quorum sensing circuit)是細(xì)菌QS系統(tǒng)的核心,也是調(diào)節(jié)細(xì)菌QS的關(guān)鍵,細(xì)菌也可以通過QS回路調(diào)節(jié)其種群活動(dòng)(Yangetal., 2022)。微生物通過分泌信號(hào)分子進(jìn)行種內(nèi)、種間甚至不同菌屬之間的相關(guān)毒力基因和致病基因的表達(dá)調(diào)控,這有利于微生物在宿主中的定殖,這為通過QS來實(shí)現(xiàn)生物害蟲防治提供了新思路 (Coquantetal., 2020)。因此,探索腸道菌群QS回路有助于影響病原體感染,重塑功能失調(diào)的腸道菌群。但是,在全面準(zhǔn)確地了解腸道細(xì)菌QS之前,必須解決許多問題。首先,需要廣泛而深入地探索共生細(xì)菌的QS,而不僅僅是病原微生物的QS。其次,應(yīng)進(jìn)一步研究疾病狀態(tài)下腸道菌群的QS變化,如QS分子種類和濃度以及QS相關(guān)基因的表達(dá)。最后,盡管已經(jīng)確定了對(duì)腸道菌群QS的宿主干預(yù),但尚不清楚該干預(yù)如何改變局部菌群的結(jié)構(gòu)和功能。由于腸道內(nèi)的化學(xué)環(huán)境非常復(fù)雜,而其他化學(xué)信號(hào)可以掩蓋來自細(xì)菌的微弱的QS信號(hào),使得腸道菌群的QS信號(hào)很難探索到(Wu and Luo, 2021)。

群體響應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)是細(xì)菌通過胞內(nèi)代謝通路分泌QS信號(hào)因子,調(diào)節(jié)菌體的代謝通路和代謝產(chǎn)物合成。常見的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌QS信號(hào)因子分別是?；呓z氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactone, AHL)和自誘導(dǎo)肽(autoinducing peptide, AIP),革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的AHLs具有多種基于不同酰基側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)。基本上,每個(gè)產(chǎn)生AHL的微生物都采用LuxI型合酶和LuxR型受體這兩個(gè)蛋白質(zhì)家族來激活QS回路(Caseetal., 2008)。革蘭氏陰性細(xì)菌的AHL的合成過程和響應(yīng)過程存在多重交互的影響,多個(gè)信號(hào)分子可以共同作用來調(diào)節(jié)細(xì)菌中QS相關(guān)基因的表達(dá),形成QS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。例如,哈維弧菌能夠響應(yīng)哈維弧菌AI-1(HAI-1)、霍亂弧菌AI-1(CAI-1)和AI-2 3種信號(hào)分子來調(diào)節(jié)QS靶向基因的表達(dá)(Yangetal., 2022)。在銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa中,N-(3-氧代十二烷?；?高絲氨酸內(nèi)酯(N-3-oxododecanoyl homoserine lactone, OdDHL)、N-丁酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-butyryl homoserine lactone, BHL)、2-(2-羥基苯基)-噻唑-4-碳醛(IQS)和2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮(2-2-hydroxyphenyl-thiazole-4-carbonaldehyde, IQS) 4種不同的QS信號(hào)分子能夠激活相互連接的las, rhl, iqs和pqs系統(tǒng),并且las系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)另外3個(gè)系統(tǒng)的受體和合酶基因的表達(dá)(Montagut and Marco, 2021),形成分層調(diào)節(jié)作用。與單一特定QS系統(tǒng)相比,復(fù)雜的QS相互作用網(wǎng)絡(luò)可以讓細(xì)菌減少來自其他物種的信號(hào)干擾,從而更好地適應(yīng)腸道環(huán)境(Hawveretal., 2016)。

群體響應(yīng)在腸道生理功能中發(fā)揮著重要作用,包括屏障功能、免疫調(diào)節(jié)、物質(zhì)代謝、細(xì)菌定殖和病原微生物感染(Adiliaghdametal., 2019)。最常見的功能就是影響病原微生物在腸道內(nèi)定殖和病原微生物感染過程。在宿主腸道中,定殖對(duì)于病原微生物發(fā)揮致病性非常重要。QS可以調(diào)節(jié)細(xì)菌生物膜的形成,有助于霍亂弧菌在腸道中的定殖并引起霍亂疾病。N-十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯可以增強(qiáng)沙門氏菌模型中的PT4菌株的毒力基因的表達(dá),導(dǎo)致大蠟螟Galleriamellonella腸道中的細(xì)胞凋亡(caspase-3)和自噬(LC3)相關(guān)基因的表達(dá)顯著增加(de Freitasetal., 2021)。除病原微生物外,昆蟲體內(nèi)的共生微生物也會(huì)通過QS來實(shí)現(xiàn)在宿主體內(nèi)的定殖,例如,名為Sodalispraecaptivus的共生細(xì)菌,能夠通過群體感應(yīng)在象鼻蟲內(nèi)定殖,群體感應(yīng)將毒性殺蟲基因的表達(dá)限制在僅感染的初始階段,從而通過獲得對(duì)宿主組織和細(xì)胞侵染來實(shí)現(xiàn)種群增長和持久性(Medina Munozetal., 2020),這些研究結(jié)果為昆蟲腸道微生物群體感應(yīng)對(duì)宿主生理的影響提供了新思路。還有研究表明,微生物在食草昆蟲幼蟲的腸道中競爭營養(yǎng)和生存空間,如草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda,它們的生理活性和它們的組織通常由“自誘導(dǎo)物”如AHLs控制或同步。由于昆蟲腸道中的強(qiáng)堿性環(huán)境,AHLs的內(nèi)酯環(huán)迅速且自發(fā)地打開,然后通過昆蟲腸道中的微生物N-?；被崴饷?N-acylamino acid hydrolase, AAH)和相關(guān)酶活性實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步降解為非活性組分高絲氨酸和酰基部分(Funkeetal., 2008)。因此昆蟲腸道的pH調(diào)節(jié)極有可能實(shí)現(xiàn)調(diào)控QS信號(hào)分子含量的重要因素,因?yàn)镼S發(fā)揮菌群調(diào)控功能的前提是QS效應(yīng)因子的濃度要達(dá)到閾值,因此,腸道環(huán)境pH的變化亦或者QS效應(yīng)因子濃度變化,都可能是實(shí)現(xiàn)菌群調(diào)節(jié)的途徑。已有相關(guān)研究表明,家禽腸道pH可通過飲食物種類或成分的不同而發(fā)生改變,從而影響微生物群結(jié)構(gòu)和數(shù)量改變,因此腸道內(nèi)的pH環(huán)境有可能是影響腸道微生物群群體感應(yīng)的因素之一,也有可能是昆蟲維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種策略(Blaaketal., 2020)。另外,有相關(guān)研究表明,有些真核生物或宿主體內(nèi)原核微生物能夠表達(dá)致使群體感應(yīng)猝滅的降解酶,用于解決病原微生物在宿主內(nèi)的過度繁殖的問題。已知病原微生物通過群體感應(yīng)分泌相應(yīng)的信號(hào)分子,以調(diào)控微生物產(chǎn)生毒力因子或激活致病基因,從而導(dǎo)致宿主患病甚至死亡。群體感應(yīng)降解酶的存在,會(huì)減少或終止QS導(dǎo)致的致病或致死行為的發(fā)生。例如,有研究表明,編碼群體感應(yīng)淬滅酶的主要基因來源于革蘭氏陽性菌芽孢桿菌Bacillussp. 240B1中克隆得到的aiiA基因片段,后來的研究表明該基因編碼一個(gè)擁有250個(gè)氨基酸的AHL水解酶。該酶同樣能夠發(fā)揮終止群體感應(yīng)的功能,當(dāng)前已報(bào)道了將近10種能夠產(chǎn)生群體感應(yīng)猝滅酶的菌種,其中大多數(shù)的猝滅酶基因(AHL降解酶基因)已被克隆并加以研究,同時(shí)也有相關(guān)研究表明了編碼該類AHL降解酶的基因在原核生物中廣泛存在。這對(duì)于昆蟲腸道中群體感應(yīng)猝滅機(jī)制對(duì)腸道微生物穩(wěn)態(tài)的調(diào)控研究提供了重要的前提條件(韓翔鵬等, 2022)。然而,群體感應(yīng)猝滅酶及其猝滅機(jī)制的研究大多集中在原核微生物和哺乳動(dòng)物領(lǐng)域,該方向的研究在昆蟲領(lǐng)域研究較少,尤其在昆蟲腸道微生物或腸道本身的猝滅機(jī)制的探索,仍需要進(jìn)一步的研究。

6 小結(jié)與展望

迄今為止,大多數(shù)關(guān)于腸道微生物穩(wěn)態(tài)的研究都集中在雙翅目和鞘翅目物種中(Xiaoetal., 2019),但在其他昆蟲目中仍然缺乏關(guān)于腸道穩(wěn)態(tài)機(jī)制的探索。而當(dāng)前亟待解決的問題主要是打破研究對(duì)象的物種局限性,因?yàn)?現(xiàn)已報(bào)道的研究大多集中于模式昆蟲(如黑腹果蠅、埃及伊蚊等)。所以,我們需要拓寬對(duì)其他昆蟲目物種的研究,以獲得更全面的科學(xué)依據(jù)。此外,該領(lǐng)域的最新研究揭示了腸道調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)細(xì)菌的影響,但腸道調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)真菌、病毒和原生動(dòng)物的作用仍有待進(jìn)一步研究。

在雙翅目中,物理防御和Imd, Duox-ROS和JAK/STAT信號(hào)通路在調(diào)節(jié)腸道微生物穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。然而,昆蟲腸道中微生物穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)機(jī)制是極其復(fù)雜的,無論是有益還是有害的微生物,每條信號(hào)通路似乎都是獨(dú)立運(yùn)作的,但尚不清楚它們是否相互作用或與其他免疫信號(hào)通路有任何相互作用,未來還需我們繼續(xù)探索腸道免疫與腸道微生物群穩(wěn)態(tài)之間的具體聯(lián)系及各免疫通路之間是否存在級(jí)聯(lián)機(jī)制。在代謝通路激活效應(yīng)物方面,細(xì)菌來源的尿嘧啶和DAP-PGN已顯示分別激活Duox-ROS和Imd信號(hào)通路,然而,是否存在其他因素來激活這兩種信號(hào)通路仍然尚未明確,因此關(guān)于腸道微生物與宿主的互作關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究。

除了本文所述的昆蟲腸道免疫和腸道菌QS調(diào)控腸道微生物群穩(wěn)態(tài)外,也不能忽視了宿主腸道本身的貢獻(xiàn),腸道上皮對(duì)微生物的反應(yīng)是復(fù)雜和多樣的。但是由于昆蟲種類多樣,上述免疫信號(hào)通路的激活機(jī)制在各昆蟲目腸道研究中尚未有明確解析,在之后的研究中需要我們進(jìn)一步的探索。未來的研究熱潮將會(huì)是致力于揭示昆蟲腸道與其自身腸道微生物群的互作,探索腸道共生微生物及病原微生物與腸道免疫通路的相互作用機(jī)制以及腸道微生物的群體感應(yīng)以誘發(fā)相關(guān)毒力基因的表達(dá)的具體機(jī)制和靶標(biāo)基因的研究等,這些研究均具有科學(xué)價(jià)值。

目前關(guān)于昆蟲腸道微生物的研究大多集中在昆蟲腸道微生物群的群落組成結(jié)構(gòu)及其對(duì)宿主生理的影響機(jī)制,但是對(duì)于通過昆蟲腸道微生物群的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)害蟲防治的研究相對(duì)較少,目前對(duì)于如何打破宿主腸道微生物群穩(wěn)態(tài)以實(shí)現(xiàn)害蟲防治的研究已成熱點(diǎn)。另外有眾多的研究通過QS抑制病原微生物QS而實(shí)現(xiàn)了相關(guān)疾病的預(yù)防,但通過QS信號(hào)分子過度激活腸道致病微生物或者共生微生物QS的情況下,能否以此打破昆蟲腸道微生物群的穩(wěn)態(tài)而實(shí)現(xiàn)害蟲防治的目的我們尚未可知,本文中腸道微生物QS互作的相關(guān)案例,為研究QS調(diào)節(jié)腸道微生物群穩(wěn)態(tài)機(jī)制,提供了新思路。