劉舒雅 陳健明 吳愛(ài)梅 柯穎標(biāo)

跌打損傷是骨傷科臨床常見(jiàn)病種，多因強(qiáng)力外襲，局部筋脈肌肉受損，脈絡(luò)不利，氣血瘀滯等所致，主要臨床表現(xiàn)為局部疼痛、腫脹青紫、關(guān)節(jié)肌肉疼痛。本病屬中醫(yī)“傷筋”范疇，主要采用活血化瘀、活絡(luò)通經(jīng)、祛風(fēng)除濕、消腫止痛等中藥予以治療。西醫(yī)主要以甾體抗炎免疫藥、非甾體抗炎免疫藥、合成類固醇等抗炎止痛藥物治療，但該類藥物副作用較大，患者耐受程度低，不宜長(zhǎng)期服用[1-2]。中醫(yī)治療跌打損傷歷史悠久，古稱“跌打損傷”為諸傷之總論。地花活絡(luò)酒由熟地黃、雞血藤、紅花等12 味中草藥組成，具有活血化瘀、祛風(fēng)除濕、快速止痛功效，可外涂或配合本院制劑金黃散和風(fēng)濕散使用，用于治療頸椎病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、骨質(zhì)增生等多種疾病。經(jīng)過(guò)幾十年的觀察地花活絡(luò)酒在骨傷的臨床治療中發(fā)揮了顯著的作用，在目前的劑量、療程范圍內(nèi)用藥安全，無(wú)毒副作用，是治療跌打損傷疼痛安全有效的藥物。然而，與大多數(shù)民族傳統(tǒng)制劑相同，地花活絡(luò)酒的制備工藝較原始，缺乏科學(xué)的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，藥理作用、有效成分、工藝條件、質(zhì)量檢測(cè)等方面均沒(méi)有進(jìn)行深入研究，極大地限制了其的發(fā)展和應(yīng)用[3-4]。因此，本研究擬采用響應(yīng)面法優(yōu)化地花活絡(luò)酒的制備工藝，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Behnken 響應(yīng)面分析法和Design-Expert 13 軟件，考察浸泡時(shí)間、攪拌次數(shù)、藥材粉碎粒度3 個(gè)因素對(duì)總固體物量的影響[5-8]，得出最佳的工藝參數(shù)，確定地花活絡(luò)酒的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料

地花活絡(luò)酒的處方組成：熟地黃12 g，桂枝4 g，獨(dú)活1 g，杜仲4 g，紅花1 g，羌活1 g，骨碎補(bǔ)4 g，五加皮8 g，雞血藤16 g。實(shí)驗(yàn)所用的中藥飲片皆來(lái)源于茂名市中醫(yī)院中藥房。

1.2 試劑與儀器

電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司，型號(hào)：FA2004B），智能數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海成順儀器儀表有限公司，型號(hào)：JC101），數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司，型號(hào)：HH-6）。

1.3 方法

1.3.1 地花活絡(luò)酒的制備流程將以上9 味藥材，置容器內(nèi)，加入50 度白酒1 000 ml，密閉浸泡15 d，濾過(guò)，即得。

1.3.2 總固體物量的測(cè)定方法分別精密吸取各樣品上清液100 ml，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，放置于水浴上蒸干，在105 ℃下干燥3 h，移置干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)1）單因素分別考察浸泡時(shí)間、攪拌次數(shù)、藥材粉碎粒度3 個(gè)因素，對(duì)總固體物量的影響。2）以總固體物量為考察指標(biāo)，依據(jù)Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，并結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Design Expert 13 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，進(jìn)行三因素三水平17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)分析，從中優(yōu)選地花活絡(luò)酒的提取工藝[9-10]。3）工藝驗(yàn)證，通過(guò)Design-Expert 13 軟件求解回歸方程得到總固體物量的最佳提取條件，結(jié)合生產(chǎn)的實(shí)際條件，計(jì)算實(shí)際總固體物量和理論預(yù)測(cè)值的誤差。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)單因素考察：與浸泡工藝相關(guān)的考察因素有多種，實(shí)驗(yàn)初期選擇了白酒濃度、浸泡時(shí)間、攪拌次數(shù)、藥材粉碎粒度作為考察因素，在實(shí)際試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)白酒濃度低于50 度時(shí)，樣品微生物限度檢測(cè)結(jié)果變化較大，質(zhì)量不可控，所以剔除白酒濃度作為單因素考察，固定白酒濃度為50 度。

1）浸泡時(shí)間考察：按處方比例稱取各藥材，加入50 度白酒1 000 ml，分別浸泡10、15、20、30、40、50 d，每10 天攪拌2 次。因此，浸泡的水平選取20、30、40 d 進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken 試驗(yàn)考察。2）藥材粉碎粒度考察：按處方比例稱取各藥材，分別將藥材飲片打粉成粗顆粒（花生粒大小，5～10 mm）、最粗粉（2 mm）、粗粉（0.85 mm）、中粉（0.25 mm），加入50 度白酒1 000 ml 浸泡15 d，每10 天攪拌2次，考察不同粉碎粒度對(duì)總固體物量的影響。藥材粉碎粒度的水平選取粗顆粒、最粗粉、粗粉進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken 試驗(yàn)考察。3）攪拌次數(shù)：按處方比例稱取各藥材，加入50 度白酒1 000 ml，浸泡15 d，每10 天分別攪拌1、2、3、4、5 次，測(cè)定總固體物量。攪拌次數(shù)的水平選取 2、3、4 進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken 試驗(yàn)考察。

1.3.5 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)選擇最佳提取條件響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取浸泡時(shí)間（A）、藥材粉碎粒度（B）、攪拌次數(shù)（C）為考察因素，以總固體物量為響應(yīng)值，運(yùn)用Design Expert 13 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，進(jìn)行三因素三水平設(shè)計(jì)。因素水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 浸泡時(shí)間對(duì)總固體物量的影響浸泡30、40、50 d 時(shí)，浸漬出的總固體物量較多，但得率相差不明顯。因此，浸泡的水平選取20、30、40 d 進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken 試驗(yàn)考察。見(jiàn)圖1。

圖1 浸泡時(shí)間對(duì)總固體物量的影響

2.1.2 藥材粉碎粒度對(duì)總固體物量的影響藥材粉碎越細(xì)，總固體物量越大，在最粗粉出現(xiàn)最大值，此后數(shù)據(jù)下降。見(jiàn)圖2。

圖2 藥材粉碎粒度對(duì)總固體物量的影響

2.1.3 攪拌次數(shù)對(duì)總固體物量的影響隨著每周攪拌次數(shù)越多，總固體物量呈上升趨勢(shì)，每10 天攪拌3 次處達(dá)到最大值，此后數(shù)據(jù)差異較小。見(jiàn)圖3。

圖3 攪拌次數(shù)對(duì)總固體物量的影響

2.2 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化地花活絡(luò)酒的制備工藝

2.2.1 響應(yīng)面模型設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果17 次試驗(yàn)中，總固體物量最小值為1.138 9，最大值為1.230 7。見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面模型建立與顯著性檢驗(yàn)通過(guò)Design-expert 13 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，見(jiàn)表3，得出回歸方程Y=1.21+0.008 4A+0.025 1B+0.015 7C+0.003 9AB+0.002 1AC-0.001 6BC-0.002 5A2-0.008 9B2-0.014 6C2，R2=0.968 7。F=24.04，P=0.000 2＜0.05，表明回歸模型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)是用來(lái)表示模型與實(shí)驗(yàn)擬合的程度，本實(shí)驗(yàn)的失擬項(xiàng)F=24.04，P=0.967 6＞0.5，表明該模型擬合良好，模型的殘差可能是隨機(jī)誤差產(chǎn)生的，模型與實(shí)際值能較好地?cái)M合。

表3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果

該模型中A、B、C、B2、C2均為顯著項(xiàng)（P＜0.05），顯著程度B＞C＞A，說(shuō)明粉碎粒度對(duì)響應(yīng)值的影響最大，攪拌次數(shù)其次，浸泡天數(shù)最末。

響應(yīng)面交互作用分析：在浸泡時(shí)間、攪拌次數(shù)、藥材粉碎粒度3 個(gè)影響因素中，取任意兩個(gè)因素分別作為X軸和Y軸，以綜合評(píng)分作為Z軸，采用Design-Expert 軟件創(chuàng)建兩因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的三維響應(yīng)面圖（圖4）。等高線的形狀可反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓表示兩因素交互作用顯著；影響因素的顯著水平和響應(yīng)面圖的曲面性狀相關(guān)聯(lián)，曲面越陡峭，說(shuō)明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大。由圖4B 可得，總固體物量隨著攪拌次數(shù)、浸泡天數(shù)的增加而升高，其響應(yīng)面圖形表現(xiàn)得相對(duì)陡峭，且等高線輪廓近似橢圓形，表明兩因素間的相互作用相對(duì)較強(qiáng)。

圖4 兩因素交互作用對(duì)總固體物量影響的三維響應(yīng)面圖和等高線圖

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)Design-Expert 13 軟件求解回歸方程得到總固體物量的最佳提取條件為浸泡時(shí)間40 d、粗粉、每10 天攪拌3.555 次，在此提取條件下所得總固體物量為1.237 g。按處方比例稱取各藥材，浸泡40 d，把藥材粉碎為粗粉，每10 天攪拌4 次。平行3 次試驗(yàn)所得總固體量為1.234 5 g、1.231 7 g、1.229 7 g，平均值1.232 0 g（RSD=0.20%），表明建立的模型和實(shí)際情況基本吻合。

3 討論

地花活絡(luò)酒由養(yǎng)陰補(bǔ)腎、活血通經(jīng)、祛瘀止痛的熟地黃和紅花作為君藥，輔助溫通經(jīng)脈、祛風(fēng)除濕的桂枝、獨(dú)活、羌活，具有活血化瘀、祛風(fēng)除濕、快速止痛的功效。響應(yīng)面分析法系采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具，進(jìn)行多因子試驗(yàn)，將各個(gè)因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用多項(xiàng)式擬合，通過(guò)軟件計(jì)算對(duì)函數(shù)的響應(yīng)面和等高線進(jìn)行分析，計(jì)算可得出因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系。響應(yīng)面分析法通過(guò)連續(xù)的試驗(yàn)方法，建立實(shí)證模型，Design-Expert 13 軟件得出的回歸方程精度高，對(duì)比其他點(diǎn)對(duì)點(diǎn)單一的優(yōu)化方法，其優(yōu)勢(shì)是能夠?qū)?yōu)化過(guò)程延伸到面的程度，呈現(xiàn)立體效果，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等多個(gè)領(lǐng)域中[11-13]。

本研究通過(guò)設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析法試驗(yàn)，得出粉碎粒度對(duì)總固體物量的影響最大，攪拌次數(shù)其次，浸泡天數(shù)最末：攪拌次數(shù)和浸泡天數(shù)這兩個(gè)因素的相互作用對(duì)結(jié)果的影響最大。最后結(jié)合生產(chǎn)的實(shí)際情況最終確定提取最佳工藝參數(shù)：浸泡時(shí)間為40 min，把藥材粉碎為粗粉，每10 天攪拌4次。按照此工藝得到的總固體物量較高，為1.232 0，實(shí)際情況和響應(yīng)面法回歸模型高度擬合，說(shuō)明該法優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可靠。該研究結(jié)果對(duì)中藥的綜合利用以及中藥制劑產(chǎn)業(yè)化具有理論指導(dǎo)意義。但地花活絡(luò)酒是純中藥制劑，其成分復(fù)雜，藥效一定條件下會(huì)互相轉(zhuǎn)化和干擾[14-15]，因此，在未來(lái)的工作中還需進(jìn)一步研究其有效物質(zhì)的理化性質(zhì)、構(gòu)效關(guān)系等，才能使民族傳統(tǒng)制劑逐步走向規(guī)范化、科學(xué)化和機(jī)械化，為人類健康做出更大貢獻(xiàn)。