陳小兵 黃麗蕓 周沛潤 許 軍 鐘衛(wèi)津

羊耳蒜屬為蘭科多年生草本植物，全世界約有428 種，我國約有52 種，廣泛分布于我國西南部各省份和地區(qū)[1]。其中約有20 種羊耳蒜屬植物作為藥用植物，有著比較久遠的民間用藥歷史記載。該植物屬歷代記載中具有清熱解毒、涼血止血、消腫止痛等功效，可用于治療產(chǎn)后腹痛、外傷、炎癥等[2-4]。

關(guān)于黃花羊耳蒜醇提物及不同極性溶劑萃取物對人慢性髓原白血病細胞（K562）、人乳腺癌細胞（MCF-7）、人肺癌細胞（A549）3 種細胞增殖的影響尚未見報道。本研究制備了黃花羊耳蒜醇提物以及3 個不同極性溶劑萃取物和水溶性部位，通過實驗考察不同極性溶劑萃取物對體外培養(yǎng)A549、MCF-7 和K562 增殖情況的影響。

1 材料與方法

1.1 藥材

黃花羊耳蒜全草于2019年8月采自贛南地區(qū)，作為標本的全草性狀及特征依照有關(guān)文獻的描述，經(jīng)國家二級技師顏干明博士鑒定為黃花羊耳蒜。憑證樣品保存在贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院中藥標本室。

1.2 黃花羊耳蒜醇提取物的制備

取黃花羊耳蒜全草2 kg，用90%乙醇浸泡24 h，萃取3 次，合并3 次浸泡液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾乙醇，制備得到濃縮物并通過冷凍干燥，得黃花羊耳蒜醇提物180 g，保存于干燥器皿中。

1.3 黃花羊耳蒜不同極性溶劑萃取物及其水溶性部位的制備

稱取適量黃花羊耳蒜醇提取物，加入雙蒸水將提取物溶解，制備濃度為1 mg/ml 的液體備用。然后依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3 種溶劑分別萃取3 次，將萃取液減壓蒸餾有機溶劑后制備得到濃縮物并通過冷凍干燥，制備得到3 個不同極性溶劑萃取物。黃花羊耳蒜的提取液經(jīng)萃取后的水層部位，通過減壓濃縮、冷凍干燥，制備得到水溶性部位。

1.4 樣品液的制備

稱取制備好的黃花羊耳蒜醇提物、水溶性部位成分，用適量Ham's F-12 營養(yǎng)混合物溶解；稱取黃花羊耳蒜3 個不同極性溶劑萃取物，用適量濃度為含0.1%二甲基亞砜的Ham's F-12 營養(yǎng)混合物溶解，制備作用于細胞的各種樣品液的最終濃度為1、0.5、0.25、0.125、0.075 mg/ml 5 個梯度的備用液。

1.5 細胞株

A549、MCF-7、K562 3 種腫瘤細胞購買于美國ATCC 公司。

1.6 試劑及儀器

MTT（德國默克有限公司），Ham's F-12 營養(yǎng)混合物、胎牛血清、胰蛋白酶（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

真空冷凍式燥機（上海舜制儀器制造有限公司），RV-0005 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（儀生儀世（上海）生物科技有限公司），MR-96A 酶標儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），MI52-N 型倒置顯微鏡（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（山東博科干細胞應(yīng)用研究院有限公司）。

1.7 細胞培養(yǎng)

A549、MCF-7、K562 腫瘤細胞在含有10%胎牛血清和10% Ham's F-12 營養(yǎng)混合物的培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持環(huán)境濕潤，取對數(shù)生長期細胞用于本實驗中。

1.8 抗腫瘤活性的研究

按照MTT 法[5]，取對數(shù)生長期的A549、MCF-7、K562 細胞用含Ham's F-12 營養(yǎng)混合物的培養(yǎng)基稀釋至105mg/ml，將A549、MCF-7、K562 細胞分別接種在96 孔培養(yǎng)板中，每孔0.1 ml，24 h 后將培養(yǎng)液除掉，在每個孔中加入樣品0.1 ml，每組均設(shè)置4 個復(fù)孔。同時設(shè)置空白組（加Ham's F-12 營養(yǎng)混合物0.1 ml）以及陽性對照組，各組均設(shè)置8 個復(fù)孔。其中用于黃花羊耳蒜石油醚、正丁醇、乙酸乙酯萃取物實驗的空白組每孔加入含有0.5% Ham's F-12 營養(yǎng)混合物的培養(yǎng)基0.1 ml。于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持環(huán)境濕潤，培養(yǎng)72 h 以后，每孔加入0.01 ml、濃度為3 mg/ml 的MTT，然后放置在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h 后吸取每孔中的溶液，將二甲基亞砜0.15 ml 加入其中，最后在水平搖床上將培養(yǎng)板緩慢振搖20 min，將培養(yǎng)板置于酶標儀上，并檢測其吸光度值（A），于波長495 nm 處檢測。最后按照公式，細胞抑制率（%）=（1-樣品組的A 值/對照組的A 值）×100%[5]，計算得到細胞抑制率。同時計算細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2 結(jié)果

黃花羊耳蒜醇提物的不同極性萃取部位對腫瘤細胞增殖的影響見表1。實驗顯示，黃花羊耳蒜醇提物對A549 細胞增殖有明顯的抑制作用，且與濃度的增加有明顯關(guān)聯(lián)，對其他兩種細胞增殖無明顯影響。黃花羊耳蒜醇提物的石油醚和乙酸乙酯萃取部位濃度高時對A549 腫瘤細胞增殖有一定抑制作用。黃花羊耳蒜醇提物的正丁醇萃取部位濃度高時對A549、K562 和MCF-7 腫瘤細胞增殖均有一定抑制作用。黃花羊耳蒜醇提物的水溶性部位對A549、K562 和MCF-7 腫瘤細胞的增殖無明顯作用。

表1 黃花羊耳蒜醇提物及不同極性溶劑萃取物對腫瘤細胞增殖的抑制率

3 討論

本研究對黃花羊耳蒜醇提物進行了不同極性部位的成分富集，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3 種溶劑分別萃取，得到黃花羊耳蒜醇提物的3 種不同溶劑萃取物以及水溶性部位，并進行了體外抗腫瘤活性實驗。研究表明，黃花羊耳蒜醇提物對體外培養(yǎng)的A549、MCF-7 兩種腫瘤細胞增殖有明顯抑制作用。黃花羊耳蒜石油醚萃取物，在高濃度時對A549 和MCF-7 兩種腫瘤細胞增殖也有一定抑制作用，提示黃花羊耳蒜的抗腫瘤活性成分有可能存在于該部位；黃花羊耳蒜乙酸乙酯萃取物對A549 和K562 增殖有明顯抑制作用，且與濃度有直接關(guān)系；黃花羊耳蒜正丁醇萃取物高濃度時對A549、K562和MCF-7 增殖均有一定的抑制作用，提示黃花羊耳蒜的抗腫瘤活性成分也有可能存在于該部位。