徐世友，易中恒，張婷婷，郭濟中，張旭東，焦磊，雷清

蘭州生物制品研究所有限責任公司甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730046

培養(yǎng)基是重組工程菌株生長和目標產(chǎn)物合成的基礎(chǔ)，合理設(shè)計與優(yōu)化培養(yǎng)基組成既可實現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化過程成本最小化，還可使目標產(chǎn)物產(chǎn)量最大化［1］。目前，用于培養(yǎng)基設(shè)計與優(yōu)化的試驗設(shè)計方法有單因素對比、混料設(shè)計（mixture design，MD）、正交試驗設(shè)計、因子設(shè)計（Plackett-Burman 設(shè)計、全因子設(shè)計）、響應(yīng)曲面設(shè)計（Box-Behnken 設(shè)計、中心復合設(shè)計）、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合遺傳算法及誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法［2-11］。

大腸埃希菌（E.coli）等工程菌株培養(yǎng)過程中的影響因素較復雜，各因素之間可能存在交互作用，試驗設(shè)計考察因素與其響應(yīng)結(jié)果之間具有較強的離散性，傳統(tǒng)正交試驗設(shè)計等方法對復雜生物過程非線性關(guān)系的反映存在困難。自McCulloch-Pitts 模型報道以來，至今已開發(fā)出多種ANN 應(yīng)用工具，如感知器神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型、前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型、徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型等［12-17］；ANN 是在人類對其大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)認識的基礎(chǔ)上人為構(gòu)建能夠?qū)崿F(xiàn)某種功能的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，即一種具有分布式并行信息處理的特征抽象數(shù)學模型，模型具有并行式處理、分布式存儲、容錯性良好、自適應(yīng)、學習能力優(yōu)秀等特點［18］；ANN模型建立一般采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)類型，建立輸入層、隱藏層和輸出層，通過訓練、驗證及調(diào)優(yōu)模型參數(shù)后獲得［19-21］。ANN 可反映十分復雜的非線性關(guān)系［21-22］，適用于高度非線性并含有大量噪聲的生物模型［10，23］。本 研究基于MD 試驗結(jié)果數(shù)據(jù)建立ANN模型，對E.coli搖瓶培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，以期提高E.coli培養(yǎng)物的生物量和菌體活力。

1 材料與方法

1.1 菌種E.coliBL21（DE3）菌種由蘭州生物制品研究所有限責任公司第四研究室保存。

1.2 主要試劑及儀器E.coli增菌培養(yǎng)基及PBS（pH 7.4）均由蘭州生物制品研究所有限責任公司中試研究室制備；葡萄糖（glucose，Glu）購自國藥集團化學試劑有限公司；酵母基礎(chǔ)氮源（yeast nitrogen base，YNB）培養(yǎng)基購自美國BD公司；CM-YE系列酵母浸出物（yeast extract，YE）、酵母蛋白胨（yeast peptone，YP）及大豆蛋白胨（soy peptone，SP）均購自湖北安琪酵母股份有限公司；CCK-8試劑盒購自蘇州宇恒生物科技有限公司；可見光-紫外分光光度計購自美國GE公司。

1.3E.coli的搖瓶培養(yǎng) 取0.2 mLE.coliBL21（DE3）菌種，接種至2 mLE.coli增菌培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，獲得第1 次擴增培養(yǎng)物；取2 mL 第1次擴增培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至98 mLE.coli增菌培養(yǎng)基，37 ℃，250 r/min 培養(yǎng)24 h，獲得2 次擴增培養(yǎng)物；取1 mL第2 次擴增培養(yǎng)物，分別轉(zhuǎn)接于5 mL 后續(xù)MD 試驗或驗證試驗培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20 h，獲得第3 次擴增培養(yǎng)物。所有培養(yǎng)基均經(jīng)0.22μm除菌過濾。

1.4 MD試驗設(shè)計及ANN構(gòu)建 應(yīng)用Minitab（Version 20）軟件進行MD 試驗設(shè)計，以Glu、YE、YP、SP 和YNB 占比為MD 試驗培養(yǎng)基的混料成分，搖床培養(yǎng)20 h 后所收獲培養(yǎng)物（第3 次擴增培養(yǎng)物）菌體懸浮液A600（A1）、培養(yǎng)物濕菌重（G，g/L）和菌體活力指標值（A2，A460）為響應(yīng)值進行極端頂點設(shè)計?；炝戏至可舷孪抟姳?，線性約束條件：YP+SP ≤0.4。MD試驗表見表2，MD培養(yǎng)基總濃度為65 g/L，Glu+YE+YP+SP+YNB=100.000 0%，共設(shè)計33組試驗，通過對MD試驗數(shù)據(jù)（累計試驗序執(zhí)行1次）擬合進行MD分析。

表1 混料分量占比上下限（%）Tab.1 Upper and lower limits of mixture component proportions（%）

表2 MD試驗設(shè)計表（占比，%）Tab.2 MD test design table（proportion，%）

應(yīng)用JASP（Version 0.16.1）及JMP（Version 15）軟件構(gòu)建ANN，以MD 試驗結(jié)果（累計試驗序執(zhí)行2次）為訓練和驗證數(shù)據(jù)樣本，并選擇合適的模型參數(shù)構(gòu)建ANN 模型，輸入變量為混料分量且約束同混料分量上下限，輸出變量為MD 響應(yīng)值。通過構(gòu)建ANN獲得優(yōu)化后培養(yǎng)基配方，并考量MD模型擬合結(jié)果，使用蒙特卡洛模擬（Monte Carlo simulation，MCS）進一步調(diào)整培養(yǎng)基配方，獲得最佳E.coli搖瓶培養(yǎng)基配方和參考值（優(yōu)化與驗證）；對A1與G進行MCS時添加隨機模擬噪音，對A3進行MCS時添加加權(quán)隨機模擬噪音。

1.5 生物量測定 取E.coli培養(yǎng)物，6 000×g離心5 min，去上清，獲得濕菌泥，用等體積PBS（pH 7.4）重懸，獲得菌體懸浮液。用PBS（pH 7.4）稀釋菌體懸浮液，可見光-紫外分光光度計測定菌體懸浮液A600達0.3～0.8 時，按下式計算A1。取E.coli培養(yǎng)物，6 000×g離心8 min，獲得濕菌泥，按下式計算G。

A1=待測物A600×稀釋倍數(shù)；

G（g/L）=培養(yǎng)物濕菌泥重量（g）/培養(yǎng)物體積（L）

1.6 菌體活力測定 按1.5項方法制備菌體懸浮液，待其A600達0.95～1.05 時，加入體積分數(shù)為5%的CCK-8 試劑，充分混合，37 ℃孵育4 h；6 000×g離心8 min，取上清液，用可見光-紫外分光光度計測定A460，并按下式計算A2。

A2=待測物A460×稀釋倍數(shù)

1.7 最佳培養(yǎng)基的驗證 將1.4項中獲得的最佳E.coli搖瓶培養(yǎng)基作為驗證試驗培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)20 h，收獲培養(yǎng)物（第3 次擴增培養(yǎng)物）的A1、G 和A2 為驗證評價指標，進行連續(xù)10 次培養(yǎng)驗證試驗，通過單樣本等價檢驗分析驗證評價指標數(shù)據(jù)。

1.8 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用Minitab（Version 20）軟件進行單樣本等價檢驗，以1.4 項中獲得驗證參考值為檢驗?zāi)繕酥?，均值偏差值為參考值?5%；若單樣本等價檢驗中兩個原假設(shè)對應(yīng)兩個P均＜0.05，則認為檢驗均值與目標值等價，置信區(qū)間：95%CI。

2 結(jié)果

2.1 MD分析 A1二次項混料回歸擬合結(jié)果：S=2.15，R2=74.55%；模型擬合方差分析結(jié)果：F=3.77，P=0.005，二次項P均＞0.05。G完全立方逐步回歸擬合結(jié)果：S=12.30，R2=72.85%；模型擬合方差分析結(jié)果：F=5.90，P＜0.01，其中PYE*YNB＜0.01，PYE*YP*SP=0.002，PYE*YNB*YP= 0.008，擬合過程逐步選擇法候選項系數(shù)：Glu 59.35，YE 44.5，YNB-43.1，SP 70.3，YP 59.6。A2特殊立方項混料回歸擬合結(jié)果：S=1.52，R2=94.35%；模型擬合方差分析結(jié)果：F=5.57，P=0.008，二次項與特殊立方項P均＞0.05。

2.2 ANN優(yōu)化 ANN模型參數(shù)：模型交叉驗證為隨機K重，模型擬合為穩(wěn)健擬合，折數(shù)為7，學習率為0.05，歷程數(shù)為30。ANN 結(jié)構(gòu)見圖1。模型訓練廣義R2=0.999 9，模型驗證R2= 0.998 1。模型預測結(jié)果：當配方占比為：Glu 41.100 0%、YE 0、YP 0、SP 37.800 0%、YNB 21.00 0 0%，培 養(yǎng)20 h 獲 得 培 養(yǎng) 物 的A1 為14.243，G為77.932 g/L，A2為11.44。取A1為14、G為77 g/L 及A2 為11 為后續(xù)優(yōu)化輸出變量結(jié)果參考值。調(diào)整配方占比為：Glu 40.000 0%、YE 0、YP 0、SP 40.000 0%、YNB 20.000 0%時，MCS 10 000 次結(jié)果可獲得A1 ≥14 的批次幾率為48.33%，G ≥77g/L的批次幾率為53.03%，A2 ≥11的批次幾率為56.30%。確定E.coli搖瓶培養(yǎng)基配方為：Glu 26 g/L、SP 26 g/L、YNB 13 g/L。

圖1 ANN的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of ANN

2.3 最佳培養(yǎng)的驗證 10 個驗證組中，A1 ≥14 的批次幾率為60%、G ≥77 g/L 的批次幾率為50%、A2 ≥11的批次幾率為40%，培養(yǎng)驗證試驗數(shù)據(jù)見圖2。單樣本等價檢驗結(jié)果中，A1：P＜0.05，G：P＜0.05，A2：P＜0.05，見表3。表明1.4 項獲得的最佳E.coli搖瓶培養(yǎng)基作為第3 次擴增培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)果數(shù)據(jù)中A1、G 和A2 的數(shù)據(jù)均值與參考值均等價。

圖2 驗證數(shù)據(jù)圖Fig.2 Verification data diagram

表3 單樣本等價檢驗結(jié)果Tab.3 Results of one sample equivalence tests

3 討論

目前，為提高微生物生物轉(zhuǎn)化過程經(jīng)濟性及目標產(chǎn)物產(chǎn)量，需對微生物培養(yǎng)基進行優(yōu)化，其策略包括基于試驗的培養(yǎng)設(shè)計、適應(yīng)性實驗室進化技術(shù)和系統(tǒng)代謝工程［1，24-25］。本研究選擇MD作為提高E.coli培養(yǎng)過程中生物量與菌體活力的優(yōu)化策略。基于MD 可優(yōu)化各種混料分量比例的特點，本研究選擇可充分覆蓋設(shè)計空間中設(shè)計點的極端頂點設(shè)計，以Glu、YE、YP、SP 和YNB 占比為混料分量，A1、G 和A2 為響應(yīng)值進行極端頂點MD。A1擬合結(jié)果表明，不同混料分量無顯著交互作用（P均＞0.05）；G 擬合結(jié)果表明，YE與YNB二者具有顯著交互作用（P＜0.01），YE、YP與SP 三者具有顯著交互作用（P＜0.01），YE、YNB與YP 三者具有顯著交互作用（P＜0.01）；A2 擬合結(jié)果表明，不同混料分量無顯著交互作用（P均＞0.05）。上述MD擬合結(jié)果表明，不同混料分量對不同響應(yīng)值擬合模型的影響均不相同；應(yīng)用MD進行多響應(yīng)值優(yōu)化培養(yǎng)基時存在一定困難。

ANN 模型構(gòu)建擬合結(jié)果顯示，模型訓練廣義R2=0.999 9，模型驗證R2=0.998 1，表明該模型擬合較好；ANN模型預測結(jié)果當配方占比為：Glu 41.100 0%、YE 0、YP 0、SP 37.800 0%、YNB 21.000 0%時，獲得培養(yǎng)物的A1為14.243、G為77.932 g/L、A2為11.44。依據(jù)MD 分析結(jié)果，除了G 擬合中YE與YNB具有顯著交互作用外（P＜0.01），A1 與A2 擬合中不同混料分量無顯著交互作用（P均＞0.05），且YE 逐步選擇法候選項系數(shù)為負數(shù)，ANN 模型預測結(jié)果表明，YE 對培養(yǎng)結(jié)果無影響，因此，在后續(xù)培養(yǎng)基配方調(diào)整中剔除YE 組分；ANN 模型預測結(jié)果表明，YP 對培養(yǎng)結(jié)果無影響，因此，在后續(xù)培養(yǎng)基配方調(diào)整中剔除YP 組分。依據(jù)MCS 模擬結(jié)果，調(diào)整并確定最佳E.coli搖瓶培養(yǎng)基配方為：Glu 26 g/L、SP 26 g/L、YNB 13 g/L；同時選擇ANN 模型輸出變量預測結(jié)果為驗證試驗結(jié)果參考值，即A1為14、G為77 g/L、A2為11。連續(xù)10次培養(yǎng)驗證試驗結(jié)果為：A1 ≥14 的幾率為60%，G ≥77 g/L 的幾率為50%，A2 ≥11的幾率為40%；A1 ≥14的幾率大于MCS幾率，且驗證組A1值數(shù)據(jù)中位數(shù)接近14；G ≥77 g/L 的幾率小于MCS 幾率，差距較小，且驗證組G數(shù)據(jù)中位數(shù)接近77 g/L；A2 ≥11 的幾率小于MCS幾率，且驗證組G值數(shù)據(jù)中位數(shù)接近11，但數(shù)據(jù)分布較為離散，該結(jié)果可能與菌體活力檢測方法有關(guān)，微生物培養(yǎng)中菌體活力相關(guān)指標數(shù)據(jù)自身具有較高離散特點，需后續(xù)更多試驗數(shù)據(jù)的驗證支持。以參考值為單樣本等價檢驗?zāi)繕酥?，考慮E.coli培養(yǎng)批次間培養(yǎng)結(jié)果的不確定性和波動性，選擇均值偏差值；A1：P＜0.05，G：P＜0.05，A2：P＜0.05，A1、G 和A2 的數(shù)據(jù)均值與參考值均等價，上述培養(yǎng)驗證結(jié)果表明，最佳E.coli搖瓶培養(yǎng)基具有高生物量和菌體活力的特點，且培養(yǎng)結(jié)果具有一定的穩(wěn)健性。ANN 模型預測結(jié)果具有參考性，MD 可為ANN 模型建立提供試驗設(shè)計。

綜上所述，本研究設(shè)計培養(yǎng)基的E.coli培養(yǎng)物具有較高的生物量及菌體活力，為E.coli表達系統(tǒng)重組工程菌的培養(yǎng)及規(guī)模放大奠定了基礎(chǔ)，后續(xù)將在該培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上進行調(diào)整優(yōu)化，以適應(yīng)不同基因型E.coli表達株。