趙芳圓，杜瑞曉，李世慧

北京生物制品研究所有限責(zé)任公司細(xì)菌類疫苗研究室，北京 100176

百日咳是由百日咳博德特菌引起的一種具有高度傳染性的呼吸道疾?。?］，未研發(fā)出相關(guān)疫苗前，嬰幼兒百日咳的發(fā)病率和死亡率高于脊髓灰質(zhì)炎和麻疹的總和［2］。百日咳是全球最常見的疫苗可預(yù)防疾病之一［3］，對(duì)適齡兒童接種無細(xì)胞百白破疫苗可預(yù)防百日咳等相關(guān)疾病。

無細(xì)胞百日咳疫苗按照百日咳原液生產(chǎn)純化工藝不同分為高速蔗糖離心共純化疫苗和柱層析組分疫苗［4］，組分百日咳疫苗由百日咳的相關(guān)抗原組成，包括絲狀血凝素（filamentous hemagglutinin，F(xiàn)HA）、百日咳毒素（pertussis toxin，PT）、百日咳黏著素（pertactin，PRN）等，其成分配比更加明確，不良反應(yīng)率更低。由于組分百日咳疫苗采用柱層析純化，工藝較為復(fù)雜，其中引入甘油、尿素、Triton-X100，后續(xù)脫毒工藝引入甘油、戊二醛、甲醛等諸多物質(zhì)，對(duì)Lowry1法測(cè)定蛋白含量存在較大干擾，國內(nèi)外也有相關(guān)研究報(bào)道［5-6］。因此，急需一種可以準(zhǔn)確測(cè)定組分百日咳疫苗各步驟中間品蛋白含量的方法，在不同干擾物質(zhì)存在及樣品顏色影響的情況下，蛋白定量均不受干擾。Lowry2 法［《中國藥典》三部（2020 版）福林酚法-第二法］是在Lowry1 法的基礎(chǔ)上通過脫氧膽酸鹽-三氯乙酸沉淀進(jìn)行預(yù)處理，可在最大程度上消除干擾物質(zhì)的影響［4，7］。為評(píng)價(jià)Lowry2 法檢測(cè)組分百日咳疫苗中間產(chǎn)品蛋白含量的準(zhǔn)確性，本研究以各步驟中間產(chǎn)品背景緩沖液作為其指示樣品，驗(yàn)證Lowry2法檢測(cè)組分百日咳疫苗中間產(chǎn)品蛋白含量的準(zhǔn)確性，并采用該方法檢測(cè)3 批組分百日咳疫苗中間產(chǎn)品的蛋白含量。

1 材料與方法

1.1 樣品 純化后FHA、PRN、PT 抗原及其所用背景緩沖液和脫毒后FHA、PRN、PT抗原及其背景緩沖液由北京生物制品研究所有限責(zé)任公司菌苗室及細(xì)菌類疫苗研究室提供。

1.2 主要試劑及儀器 蛋白含量測(cè)定國家標(biāo)準(zhǔn)品由中國食品藥品檢定研究院提供（270009-201107）；氫氧化鈉購自北京化工廠；碳酸鈉、三氯乙酸、硫酸銅購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二水合酒石酸二鈉、去氧膽酸鈉、福林酚試劑和離習(xí)機(jī)（SG3K30）購自美國Sigma公司；紫外分光光度計(jì)購自日本島津公司（UV-1800）。

1.3 檢測(cè)方法 按《中國藥典》三部（2020 版）蛋白含量測(cè)定方法（Lowry2 法）的要求配制試劑。A 液：氫氧化鈉-碳酸鈉；B 液：酒石酸二鈉-硫酸銅、去氧膽酸鈉試液、72%三氯醋酸；C 液：A 液與B 液按照50∶1混合。將標(biāo)準(zhǔn)品逐級(jí)稀釋至蛋白濃度為0、10、20、30、40、50 μg/mL，精密量取各標(biāo)準(zhǔn)品與樣品溶液1.0 mL，分別置于15 mL離心管中，加入去氧膽酸鈉溶液0.1 mL，渦旋混勻，室溫放置10 min；加入72%三氯醋酸溶液0.1 mL，渦旋混勻，3 000×g離心30 min，棄上清，沉淀用1 mL C 液復(fù)溶后，再加入C 液5 mL，混勻，室溫放置10 min；加入2 倍稀釋的福林酚試劑0.5 mL，立即混勻，室溫放置30 min，750 nm 波長處測(cè)定吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度-吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)（R2）應(yīng)≥0.98。測(cè)定結(jié)果需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.4 Lowry1與Lowry2法檢測(cè)的比較 分別使用脫毒及純化樣品背景緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白至50μg/mL，并同時(shí)測(cè)定兩種背景緩沖液（不含蛋白），采用Lowry1 和Lowry2 法檢測(cè)后，在扣除背景緩沖液的測(cè)定值后，得到兩種方法蛋白測(cè)定的實(shí)際數(shù)值，并計(jì)算回收率。

1.5 Lowry2法的驗(yàn)證

由于組分百日咳疫苗中的PT、FHA、PRN抗原所使用的純化、脫毒背景緩沖液均不相同，Lowry2法檢測(cè)蛋白含量的驗(yàn)證需單獨(dú)進(jìn)行。

1.5.1 專屬性 采用Lowry2 法檢測(cè)脫毒及純化樣品背景緩沖液和超純水，設(shè)2個(gè)平行，分別測(cè)定3次，與超純水檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

1.5.2 線性范圍 精密量取超純水稀釋的0、10、20、30、40、50 μg/mL 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用Lowry2法測(cè)定3次，計(jì)算3次測(cè)定結(jié)果的R2，應(yīng)≥0.98。

1.5.3 準(zhǔn)確性 用脫毒及純化樣品背景緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品蛋白至40、50、60 μg/mL 作為供試品，設(shè)2個(gè)平行，分別測(cè)定3 次，并按下式計(jì)算回收率，應(yīng)在（100±10）%。

回收率（%）=測(cè)定濃度/理論濃度×100%

1.5.4 精密性

1.5.4.1 重復(fù)性 將脫毒及純化FHA、PRN、PT 作為供試品，取同一濃度的供試品，由同一名實(shí)驗(yàn)員重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算RSD，應(yīng)≤3%。

1.5.4.2 中間精密性 將脫毒樣品及純化FHA、PRN、PT 作為供試品，取同一濃度的供試品，由2名不同實(shí)驗(yàn)員分別測(cè)定6次，并計(jì)算RSD，應(yīng)≤3%。

1.6 方法的應(yīng)用 取3 批組分百日咳疫苗中間產(chǎn)品（S01、S02、S03），每批包括純化和脫毒后PT、FHA、PRN抗原，采用Lowry2法測(cè)定蛋白含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 7.04 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若兩組數(shù)據(jù)不滿足方差齊性，采用Welch校正。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lowry1 與Lowry2 法檢測(cè)結(jié)果的比較 單獨(dú)測(cè)定背景空白時(shí)，Lowry1 法測(cè)定的數(shù)值已嚴(yán)重偏離理論值，Lowry2法未受影響；扣除背景緩沖液的測(cè)定值后，兩種方法的蛋白測(cè)定結(jié)果均接近理論值，具有一致性。見表1。表明兩種背景緩沖液中添加的甘油、尿素等物質(zhì)會(huì)對(duì)Lowry1 法測(cè)定造成干擾，Lowry2 法未受影響，并能反應(yīng)出蛋白的真實(shí)測(cè)定值。

表1 Lowry1與Lowry2法檢測(cè)脫毒和純化樣品背景緩沖液的結(jié)果Tab.1 Detection of background buffers of detoxified and purified samples by Lowry1 and Lowry2 methods

2.2 Lowry2法的驗(yàn)證

2.2.1 專屬性Lowry2 法測(cè)定脫毒及純化樣品背景緩沖液蛋白含量與超純水比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見表2。說明組分百日咳疫苗各步驟中間產(chǎn)品背景液對(duì)Lowry2法檢測(cè)無干擾。

表2 Lowry2法測(cè)定各背景緩沖液與超純水蛋白含量的比較Tab.2 Comparison of protein content in background buffer and ultrapure water detected by Lowry2 method

2.2.2 線性范圍 3 次標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定結(jié)果R2均大于0.98，見表3。表明蛋白濃度在0 ～50μg/mL 之間標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

表3 Lowry2法線性范圍的重復(fù)性驗(yàn)證Tab.3 Repeatability verification of linear range of Lowry2 method

2.2.3 準(zhǔn)確性 脫毒及純化樣品背景緩沖液的加標(biāo)回收率均在90% ～110%之間，見表4。表明Lowry2法測(cè)定組分百日咳疫苗中間產(chǎn)品蛋白含量準(zhǔn)確性良好。

表4 Lowry2法測(cè)定各背景緩沖液的準(zhǔn)確性驗(yàn)證Tab.4 Accuracy verification of Lowry 2 method in detection of background buffers

2.2.4 精密性

2.2.4.1 重復(fù)性 同一名實(shí)驗(yàn)員連續(xù)測(cè)定6 次同一批脫毒及純化后PT、FHA、PRN 樣品的RSD均＜3%，見表5。表明Lowry2 法檢測(cè)組分百日咳疫苗中間產(chǎn)品蛋白含量的重復(fù)性良好。

表5 Lowry2法測(cè)定組分百日咳疫苗中間產(chǎn)品的重復(fù)性驗(yàn)證（μg/mL）Tab.5 Repeatability verification of Lowry 2 method for detection of component pertussis vaccine intermediate products（μg/mL）

2.2.4.2 中間精密性 2名實(shí)驗(yàn)員連續(xù)測(cè)定6次同一脫毒及純化PT、FHA、PRN 樣品的RSD均＜3%，見表6。表明Lowry2 法檢測(cè)組分百日咳疫苗中間產(chǎn)品蛋白含量的中間精密性良好。

表6 Lowry2法測(cè)定組分百日咳疫苗中間產(chǎn)品的中間精密性驗(yàn)證（μg/mL）Tab.6 Intermediate precision verification of Lowry2 method for detection of component pertussis vaccine intermediate products（μg/mL）

2.3 方法的應(yīng)用 檢測(cè)結(jié)果顯示，3批組分百日咳疫苗純化及脫毒后PT、FHA、PRN樣品的蛋白測(cè)定結(jié)果均符合企業(yè)內(nèi)部《制造與檢定規(guī)程》要求，見表7。

表7 3批組分百日咳疫苗中間產(chǎn)品蛋白測(cè)定結(jié)果（μg/mL）Tab.7 Protein detection results of intermediate products of three batches of component pertussis vaccine（μg/mL）

3 討 論

蛋白質(zhì)樣品的濃度測(cè)定通常通過測(cè)定280 nm波長處的紫外吸收率或蛋白質(zhì)與染料/金屬離子間的定量反應(yīng)（Bradford、Lowry 或BCA 分析）來完成。紫外吸收檢測(cè)快速方便，但只適合純度高、成分單一且無顏色干擾的樣品。Bradford 分析法靈敏度相對(duì)較高，方法簡單，試劑穩(wěn)定，但由于染料結(jié)合程度的不同，單個(gè)蛋白質(zhì)的測(cè)定結(jié)果可能會(huì)存在較大差異［6］。BCA 法測(cè)定快速簡便，干擾物質(zhì)少，不受大部分樣品中的去垢劑等化學(xué)物質(zhì)影響，但易受蔗糖、尿素、NH4+和EDTA 等物質(zhì)的影響［8］，王麗等［9］發(fā)現(xiàn)，組分百日咳疫苗中硫酸銨的存在會(huì)對(duì)BCA法測(cè)定蛋白含量產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。Lowry 法是《中國藥典》中規(guī)定的百日咳疫苗蛋白定量方法［10］，但Lowry1 法常受樣品顏色、甘油以及尿素、Triton 等物質(zhì)的影響［4-7，11-13］，測(cè)定結(jié)果往往偏離真實(shí)值。組分百日咳疫苗因其生產(chǎn)工藝的特殊性，在純化、脫毒過程中加入了尿素、戊二醛、甘油等物質(zhì)，易對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成干擾。蛋白定量的準(zhǔn)確與否直接決定了脫毒劑的添加量、毒性的殘留以及成品免疫原性的強(qiáng)弱，對(duì)疫苗質(zhì)量有較大影響。Lowry2法通過酸沉淀處理可排除干擾成分的影響［4］，因此更適合組分百日咳疫苗中間產(chǎn)品的蛋白質(zhì)定量。

本實(shí)驗(yàn)采用《中國藥典》三部（2020版）通則0731中的Lowry2 法進(jìn)行組分百日咳疫苗中間產(chǎn)品的蛋白測(cè)定，并對(duì)Lowry2 法的專屬性、線性、準(zhǔn)確性及精密性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，該方法靈敏、穩(wěn)定且易操作，可排除樣品中其他物質(zhì)的干擾，線性范圍在0 ～50 μg/mL，R2＞0.98，準(zhǔn)確性和精密性良好。采用Lowry2 法檢測(cè)3 批組分百日咳疫苗純化及脫毒后樣品的蛋白含量，結(jié)果均符合企業(yè)內(nèi)部《制造與檢定規(guī)程》要求。因此，Lowry2 法可用于組分百日咳疫苗多步驟中間產(chǎn)品的蛋白含量測(cè)定，并使各步驟之間的蛋白含量具有可比性和可分析性。