侯宗文，黃鈺綜述，史新昌，周勇，張怡軒 審校

1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧沈陽(yáng) 117004；2.武昌首義學(xué)院，湖北武漢 430064；3.中國(guó)食品藥品檢定研究院衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

細(xì)胞因子是由各種細(xì)胞（免疫及非免疫細(xì)胞）分泌產(chǎn)生的在細(xì)胞間發(fā)揮相互作用的一類可溶性多肽/蛋白，可通過(guò)與自身受體相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答［1］。細(xì)胞因子可通過(guò)旁分泌、自分泌及內(nèi)分泌機(jī)制發(fā)揮信號(hào)傳遞的作用。目前普遍認(rèn)為細(xì)胞因子可分為6類：白細(xì)胞介素（interleukin，IL）、集落刺激因子、干擾素（interferon，IFN）、生長(zhǎng)因子、趨化因子、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）。

細(xì)胞因子與其靶細(xì)胞上的受體結(jié)合后可觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)特定的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，如增強(qiáng)細(xì)胞代謝、觸發(fā)細(xì)胞增殖或凋亡等。細(xì)胞因子的受體通常為多個(gè)跨膜蛋白組成的多聚體，且細(xì)胞因子與不同受體多聚體結(jié)合后可產(chǎn)生不同的效應(yīng)［1］。多種胞因子具有同樣或類似的生物學(xué)作用，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）和IL-15 均能刺激T 細(xì)胞增殖［2］。一種細(xì)胞因子也可抑制或激活另一種細(xì)胞因子的功能。

細(xì)胞因子最初從人血清及動(dòng)物組織中提取，但獲取量十分有限，隨著基因工程技術(shù)的興起，人們逐漸利用基因工程改造的大腸埃希菌表達(dá)提取，但表達(dá)的包涵體復(fù)性存在諸多技術(shù)瓶頸，繼而應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)提供具有功能的細(xì)胞因子，自此，多種形式的工程化細(xì)胞因子技術(shù)得到長(zhǎng)足的發(fā)展。

細(xì)胞因子工程化是以結(jié)構(gòu)生物學(xué)和細(xì)胞工程為基礎(chǔ)，利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)對(duì)天然或重組細(xì)胞因子進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾及改造，以提高細(xì)胞因子的治療效力或增加細(xì)胞因子類藥物的產(chǎn)量。工程化的細(xì)胞因子廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療。如通過(guò)抑制IL-17治療銀屑?。?］，通過(guò)IL-6 和IL-1 拮抗劑治療COVID-19［4］，通過(guò)阻斷腫瘤壞死因子治療克羅恩?。?］等。

鑒于細(xì)胞因子對(duì)不同受體親和力的差異，細(xì)胞因子工程化的研究集中在改變受體結(jié)合親和力上，如對(duì)IL-2“超級(jí)因子”［6］和IL-15“超級(jí)激動(dòng)劑”［7］的嘗試；提高受體結(jié)合選擇性，如IL-12 部分激動(dòng)劑的研發(fā)［8］；通過(guò)干擾相互作用，如IL-15 拮抗劑和IL-13超因子的使用［9］。本文主要對(duì)細(xì)胞因子的工程化設(shè)計(jì)、靶向、遞送以及mRNA 表達(dá)、細(xì)胞技術(shù)的創(chuàng)新作一綜述，并進(jìn)行展望。

1 重組細(xì)胞因子的設(shè)計(jì)

隨著現(xiàn)代生物分析技術(shù)的進(jìn)步，最新的蛋白質(zhì)工程已經(jīng)開(kāi)發(fā)出用于增加細(xì)胞因子的功能、降低毒性、提高信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、優(yōu)化分布的技術(shù)。以下著重探討如何使用不同的蛋白質(zhì)工程模式設(shè)計(jì)細(xì)胞因子。

1.1 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）化和肽基化細(xì)胞因子的體內(nèi)半衰期一直是影響細(xì)胞因子類藥物治療效果的關(guān)鍵因素。用PEG共價(jià)偶聯(lián)細(xì)胞因子是延長(zhǎng)其半衰期的有效方法。PEG 可增加細(xì)胞因子的相對(duì)分子質(zhì)量及體積，降低腎臟清除率，減少與血漿成分的相互作用，從而降低其免疫原性。Besremi是單糖基修飾的脯氨酸IFNα-2b，并具有甲氧基PEG部分，通過(guò)重組DNA 技術(shù)在大腸埃希菌細(xì)胞中產(chǎn)生。臨床試驗(yàn)表明，PEG 后可將給藥間隔延長(zhǎng)至2 ～4 周，能更持久地控制血細(xì)胞數(shù)量，以用于治療真性紅細(xì)胞增多癥［10］。HOGGATT 等［11］在大腸埃希菌中表達(dá)的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的基礎(chǔ)上，使用新的糖PEG 化技術(shù)，通過(guò)在非格司汀的蘇氨酸134開(kāi)放位點(diǎn)添加O-聚糖，然后用唾液酸轉(zhuǎn)移酶將20 kD的PEG-唾液酸衍生物轉(zhuǎn)移至O-聚糖上制備了重組人粒細(xì)胞刺激因子類藥物——Lonquex，作為非格司亭的長(zhǎng)效生物仿制藥，與培非格司亭相比，Lonquex的終末半衰期延長(zhǎng)了7 ～10 h，可顯著增加血液中中性粒細(xì)胞數(shù)量。

IL-2 是臨床應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞因子之一，其受體由3 條鏈組成，根據(jù)對(duì)IL-2 親和力的不同可分為低親和力IL-2Rα、中親和力IL-2Rβγ 和高親和力IL-2Rαβγ。研究表明，IL-2 的毒性通常與高親和力三聚體IL-2Rαβγ 復(fù)合物的激活有關(guān)，這種高親和力的三聚體在調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞上大量表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［12］?？梢詫L-2 進(jìn)行PEG 化綴合，使其PEG 部分特異性阻斷與IL-2α亞單位的結(jié)合位點(diǎn)，但維持與其他受體亞單位的相互作用，從而選擇性地促進(jìn)T細(xì)胞和NK 細(xì)胞的擴(kuò)增［13-14］。雖然PEG 的細(xì)胞因子療法取得一定進(jìn)展，但PEG 化的細(xì)胞因子也并非完全安全，其原因是患者在長(zhǎng)期使用過(guò)程中可能產(chǎn)生抗PEG化的抗體［15］。由于PEG可作為mRNA疫苗的賦形劑，用于穩(wěn)定脂質(zhì)納米顆粒，所有mRNA 疫苗均可能含有PEG。mRNA COVID-19 疫苗在極少數(shù)情況下所產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)可能由PEG引起［16］。為解決上述問(wèn)題，出現(xiàn)了可降解和非免疫原性的PEG 替代品，即合成多肽。用合成多肽與細(xì)胞因子化學(xué)偶聯(lián)，即肽基化。動(dòng)物試驗(yàn)表明，肽基化后的細(xì)胞因子顯示出極強(qiáng)的蛋白酶抗性和低免疫原性［17］。

1.2 定點(diǎn)進(jìn)化技術(shù) 定點(diǎn)進(jìn)化技術(shù)可用于直接設(shè)計(jì)細(xì)胞因子，并改變受體結(jié)合位點(diǎn)的親和力。定點(diǎn)進(jìn)化是基于對(duì)蛋白質(zhì)界面內(nèi)氨基酸突變時(shí)自由能變化的預(yù)測(cè)。由于在細(xì)胞因子與受體相互作用的情況下，潛在的能量極難預(yù)測(cè)，因此，該方法主要用于削弱受體-細(xì)胞因子相互作用。在過(guò)去的幾十年中，野生型IL-2已在臨床上用于治療多種癌癥，但會(huì)引起嚴(yán)重毒副作用。為了在癌癥治療中激活細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，許多工程改造均集中在改變IL-2對(duì)不同受體亞基的親和力上，在設(shè)計(jì)突變體時(shí)，可用易錯(cuò)PCR 創(chuàng)建IL-2變異體的誘變文庫(kù)，并根據(jù)對(duì)IL-2Rβ 的親和力進(jìn)行篩選，最終產(chǎn)生對(duì)IL-2Rβ親和力增強(qiáng)的IL-2“超級(jí)因子”，IL-2“超級(jí)因子”在小鼠模型中顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)，更低的毒副作用，進(jìn)一步將IL-2超因子與白蛋白融合，可改善其藥代動(dòng)力學(xué)特性［18］。

除了IL-2，最近還對(duì)其他細(xì)胞因子進(jìn)行了定點(diǎn)突變。IL-18 可增強(qiáng)抗腫瘤免疫，但其臨床治療效果不理想，主要是由IL-18結(jié)合蛋白（IL-18 binding protein，IL-18BP）的誘餌受體負(fù)調(diào)節(jié)導(dǎo)致。臨床研究表明，在接受重組IL-18 治療的患者中，IL-18BP 的血清濃度增加了10 ～100 倍［19］。ZHOU 等［20］使用酵母表面展示的定向進(jìn)化篩選了超過(guò)2.5 億個(gè)mIL-18 變異體，這些變異體隨機(jī)分布在13 個(gè)受體接觸位置，經(jīng)過(guò)5 輪IL-18Rα 的選擇和針對(duì)IL-18BP 的反向選擇，獲得1 個(gè)完全結(jié)合IL-18Rα 的群體。該群體的測(cè)序揭示了11 個(gè)獨(dú)特的序列，從中創(chuàng)建了2 個(gè)“共有序列”CS1 和CS2，通過(guò)重組表達(dá)該變異體，并通過(guò)表面等離子體共振檢測(cè)其對(duì)IL-18Rα 和IL-18BP 的親和力。結(jié)果表明，所有選擇的變異體均保留與IL-18Rα的結(jié)合位點(diǎn)，與IL-18BP的結(jié)合可忽略不計(jì)。GORBY等［21］首先將IL-10 中螺旋D 和E 之間的連接接頭延伸6 個(gè)肽以產(chǎn)生單體IL-10，然后用單體IL-10 構(gòu)建體轉(zhuǎn)染酵母，結(jié)果顯示，單體IL-10 構(gòu)建體保留了與IL-10Rα 結(jié)合位點(diǎn)，但與IL-10Rβ 結(jié)合力較弱。繼續(xù)利用易錯(cuò)PCR產(chǎn)生對(duì)IL-10Rβ具有增強(qiáng)親和力的IL-10 突變體，并將突變產(chǎn)物電穿孔至釀酒酵母菌株EBY100中，進(jìn)行了8輪選擇，隨著IL-10Rβ 濃度逐漸降低，分離出與IL-10Rβ 結(jié)合并具有增強(qiáng)親和力的IL-10 變體，從而解決了使用高劑量IL-10 引發(fā)的毒性問(wèn)題。

1.3 結(jié)構(gòu)解析指導(dǎo)設(shè)計(jì)技術(shù) 利用結(jié)構(gòu)解析指導(dǎo)設(shè)計(jì)技術(shù)來(lái)制備工程化細(xì)胞因子需要依賴于細(xì)胞因子詳細(xì)的結(jié)構(gòu)知識(shí)和先進(jìn)的蛋白模型。IL-22 是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗炎細(xì)胞因子，但也會(huì)引發(fā)炎性反應(yīng)，可通過(guò)降低與受體IL-10Rβ 的親和力來(lái)提高受體結(jié)合特異性，從而減少不必要的促炎反應(yīng)的發(fā)生。SAXTON等［22］通過(guò)突變IL-22的4個(gè)氨基酸殘基（Q1-16A、K124A、Q128A 和S45E）提高了受體結(jié)合選擇性，選擇性地激活了STAT3信號(hào)通路，增強(qiáng)了細(xì)胞因子的功能特異性。MENDOZA 等［23］解析了IFNγ 晶體結(jié)構(gòu)，并確定了完整六聚體IFNγ-IFNγR1-IFNγR2（2∶2∶2）信號(hào)復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)揭示了6個(gè)相互作用位點(diǎn)：IFNγ 與IFNγR1 共享的2 個(gè)位點(diǎn)1界面，IFNγ與IFNγR2共享的2個(gè)位點(diǎn)2界面，IFNγR1與IFNγR2共享的2個(gè)位點(diǎn)3界面。進(jìn)一步研究表明，IFNγ先與IFNγR1結(jié)合為二聚體后，才能與IFNγR2相互作用；同時(shí)，作者進(jìn)一步合理地設(shè)計(jì)了與IFNγR1結(jié)合但取消與IFNγR2 結(jié)合的IFNγ 三重（K74A/E75Y/N83R）突變體，減少了IFNγ作用的多效性。

2 靶向和遞送

利用蛋白質(zhì)工程設(shè)計(jì)出的細(xì)胞因子可在多種疾病中發(fā)揮良好的治療效果，但較高的給藥劑量限制了其廣泛的臨床應(yīng)用。可采取以下策略減少細(xì)胞因子的多效性，提高其靶向性。

2.1 抗體與細(xì)胞因子融合設(shè)計(jì) 使用抗體修飾細(xì)胞因子是目前改善細(xì)胞因子定位的一種流行策略?？贵w與細(xì)胞因子的融合體稱為免疫細(xì)胞因子，抗體片段的大小和空間排列極大地影響了細(xì)胞因子的靶向性能［24］。WEISS 等［25］將單鏈可變片段（single-chain variable fragment，scFV）或其二聚體形式的L19 片段分別與TNFα 和IL-12 融合制備了L19-mTNF 和L19-mIL12，結(jié)果證明，2 種免疫細(xì)胞因子均能促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的增殖，并增加腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中促炎細(xì)胞因子的數(shù)量，可實(shí)現(xiàn)有效的抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤活性。QIAO 等［26］將西妥昔單抗的可結(jié)晶片段（fragment crystallizable，F(xiàn)c）分別與本身抗原結(jié)合片段（fragment antigen binding，F(xiàn)ab）和IL-10二聚體融合構(gòu)建出CmAb-（IL-10）2，靜脈注射CmAb-（IL-10）2至小鼠模型后，與rIL-10相比，其半衰期從2.7 ～4.5 h延長(zhǎng)至40 h；進(jìn)一步用高（2 mg/kg）或低（0.8 mg/kg）劑量的CmAb-IL-2 注射至小鼠體內(nèi)，可顯著誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子分泌，并伴有體重減輕，最終所有用高劑量治療的小鼠均死亡。相比之下，即使CmAb-（IL-10）2劑量（4 mg/kg）遠(yuǎn)高于CmAb-IL-2，CmAb-（IL-10）2治療的小鼠中也未觀察到以上效應(yīng)。因此，CmAb-（IL-10）2可能是全身治療癌癥的良好候選物，具有延長(zhǎng)半衰期和降低毒性的作用。L19-mTNF、L19-mIL12和CmAb-（IL10）2的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1［25-26］。

圖1 L19-mTNF（A）、L19-mIL12（B）和CmAb-（IL10）2（C）的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure diagram of L19-mTNF（A），L19-mIL12（B）and CmAb-（IL10）2（C）

細(xì)胞因子也可作為抗體的接合物，即用2 個(gè)特異性抗體分別靶向腫瘤抗原及免疫細(xì)胞，用細(xì)胞因子將2 個(gè)特異性抗體連接。VALLERA 等［27］首先合成了由抗CD16的scFv、抗CD33的scFv和作為接頭的IL-15組成的三特異性殺傷細(xì)胞接合物。這種設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是同時(shí)結(jié)合腫瘤抗原和自然殺傷（NK）細(xì)胞受體，并用修飾的IL-15 將NK 細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞結(jié)合在一起形成免疫突觸，可刺激NK細(xì)胞存活和增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡?？贵w細(xì)胞因子融合策略可顯著提高細(xì)胞因子的療效，增加細(xì)胞因子的循環(huán)半衰期，但也存在脫靶效應(yīng)及免疫原性等問(wèn)題［28］。

2.2 細(xì)胞因子與毒素融合 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中過(guò)表達(dá)IL-4 的高親和力受體可通過(guò)IL-4 偶聯(lián)毒素的方式達(dá)到治療的目的。MOHAN 等［29］開(kāi)發(fā)了一種靶向基因融合蛋白，并命名為MDNA55，其包含2個(gè)分子：高度特異性的環(huán)狀I(lǐng)L-4 超因子和假單胞菌外毒素a 的催化結(jié)構(gòu)域。二者融合的作用機(jī)制見(jiàn)圖2［29］。MDNA55與腫瘤細(xì)胞表面IL-4R結(jié)合，整個(gè)復(fù)合物被內(nèi)吞為內(nèi)體，弗林蛋白酶發(fā)現(xiàn)并切割內(nèi)體中的假單胞菌外毒素a，并將其釋放至胞質(zhì)溶膠中，游離的假單胞菌外毒素a 導(dǎo)致ADP 糖基化，延伸因子失活，蛋白質(zhì)合成抑制，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。

圖2 環(huán)狀I(lǐng)L-4 超因子和假單胞菌外毒素a 融合的作用機(jī)制Fig.2 Mechanism of fusion of cyclo-IL-4 hyperfactor and Pseudomonas exotoxin a

2.3 前藥設(shè)計(jì) 將細(xì)胞因子與蛋白質(zhì)或肽連接形成前藥融合體，其在體外無(wú)活性，進(jìn)入體內(nèi)后被疾病部位過(guò)表達(dá)的特異性蛋白酶切割后，重新激活細(xì)胞因子。前藥策略不僅可延長(zhǎng)細(xì)胞因子的血液半衰期，還能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子的靶向定位。HSU 等［30］設(shè)計(jì)了受體掩蔽的IL-2 的前藥ProIL2，其包含4 個(gè)結(jié)構(gòu)域：野生型hIgG1 Fc、IL-2 變體、IL2Rβ 和柔性基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）-可切割接頭，并通過(guò)GGGGS將IL-2突變體融合至野生型hIgG1 Fc的N-末端，柔性MMP-可切割接頭將IL2Rβ的完整胞外結(jié)構(gòu)域融合至Fc 的N-末端。這種設(shè)計(jì)方式可產(chǎn)生腫瘤治療的雙重作用，既可利用IL-2 的突變體實(shí)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞的有效激活，還能利用腫瘤相關(guān)MMPs的特異性切割作用釋放阻斷的IL-2 受體，并實(shí)現(xiàn)靶向激活作用，將副作用降到最低。ProIL2 在腫瘤中的作用機(jī)制見(jiàn)圖3［30］。

圖3 ProIL2在腫瘤中的作用機(jī)制Fig.3 Mechanism of ProIL2 in tumors

IL-12能強(qiáng)效激活淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫作用，但I(xiàn)L-12早期臨床試驗(yàn)因患者嚴(yán)重的全身性炎癥的毒副作用被叫停。MANSUROV 等［31］用腫瘤相關(guān)蛋白酶可切割的含有35 個(gè)氨基酸的接頭將IL-12Rβ1 受體的Q20-A261 位結(jié)構(gòu)域與IL-12 的p35 亞單位的N-末端連接，并將其與p40 亞單位結(jié)合，達(dá)到掩蓋IL-12 受體二聚體的作用，掩蓋的IL-12 在腫瘤相關(guān)蛋白酶作用下，才能將接頭酶解。動(dòng)物試驗(yàn)證明，完整的掩蔽IL-12 變體的活性比未修飾的IL-12 低約80 倍，可消除全身性免疫相關(guān)不良反應(yīng)事件，而不影響其免疫療效。

2.4 腫瘤定位設(shè)計(jì) TME 與正常組織相比有更多膠原。可利用膠原結(jié)合蛋白對(duì)TME 中的膠原進(jìn)行定位，從而發(fā)揮腫瘤靶向作用。IL-2 的劑量限制性毒性抑制了其療效和臨床轉(zhuǎn)化，MOMIN 等［32］將IL-2與小鼠血清白蛋白（mouse serum albumin，MSA）結(jié)合后再與膠原結(jié)合蛋白Lumican融合，構(gòu)建了Lumican-（GGG）2-MSA-（GGGS）1-IL-2-（H）6。加入MSA的作用是確保Lumican與膠原蛋白結(jié)合時(shí)，與IL-2的空間接觸，同時(shí)也增加了IL-2的相對(duì)分子質(zhì)量，減少了遠(yuǎn)離腫瘤的擴(kuò)散通量。將此構(gòu)建體注射至患黑色素瘤的小鼠內(nèi)，延長(zhǎng)了細(xì)胞因子的局部滯留時(shí)間，增強(qiáng)了抗腫瘤免疫。MANSUROV 等［33］利用IL-12 的異二聚體結(jié)構(gòu)，將膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（collagen binding domain，CBD）通過(guò)GGGSGGGS與IL-12每個(gè)亞單位融合，與未修飾的IL-12 相比，CBD-IL-12 在腫瘤中的累積增加，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)IFNγ 持續(xù)增加，體循環(huán)減少，降低全身毒性。CBD-IL-12異二聚體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4［33］。

圖4 CBD-IL-12結(jié)合示意圖Fig.4 Schematic diagram of binding CBD-IL-12

2.5 納米顆粒定位 細(xì)胞因子納米醫(yī)學(xué)技術(shù)可將細(xì)胞因子遞送至特定的細(xì)胞或器官以提高細(xì)胞因子的局部濃度。一種方法是將細(xì)胞因子包被在納米顆粒的表面，使細(xì)胞因子在特定部位富集。通過(guò)制備含有表面結(jié)合的IL-2和抗CD137的PEG 化脂質(zhì)體的組合納米顆粒使免疫刺激劑在腫瘤中快速積累，引發(fā)相當(dāng)于高劑量游離IL-2/抗CD137的T細(xì)胞和NK細(xì)胞反應(yīng)的有效激活，但也加速了從血流中的清除［34］。另一種方法是利用納米顆粒將細(xì)胞因子遞送至非腫瘤靶標(biāo)，并釋放細(xì)胞因子。KAMALY 等［35］用微流控芯片技術(shù)構(gòu)建了靶向動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的Ⅳ型膠原結(jié)合聚合物納米粒，并用此納米粒包裹IL-10，當(dāng)膠原蛋白結(jié)合這些顆粒時(shí)，聚合物緩慢釋放IL-10，促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化炎癥的消退。

2.6 溶瘤病毒載體遞送 細(xì)胞因子溶瘤病毒是天然存在或重組的病毒，其可在TME中選擇性復(fù)制，破壞腫瘤細(xì)胞并將腫瘤抗原呈遞給免疫細(xì)胞。通過(guò)對(duì)溶瘤病毒進(jìn)行基因改造，使其遞送編碼細(xì)胞因子的基因，將其注射至腫瘤動(dòng)物模型中，可使腫瘤顯著消退，延長(zhǎng)動(dòng)物存活時(shí)間［36-37］。Adstiladrin 是以非復(fù)制型腺病毒為載體，將編碼人IFNα-2b 的基因整合至非復(fù)制性腺病毒載體的基因組而研發(fā)用于治療膀胱癌的基因治療藥物，可將編碼人IFNα-2b 的基因轉(zhuǎn)移至膀胱壁細(xì)胞，利用膀胱壁細(xì)胞自身的翻譯機(jī)制表達(dá)出大量的人IFNα-2b 蛋白，從而發(fā)揮治療作用［38］。

3 基于核酸和免疫細(xì)胞的工程化細(xì)胞因子設(shè)計(jì)

3.1 基于mRNA的設(shè)計(jì) COVID-19疫情的暴發(fā)加速了mRNA 疫苗及mRNA 遞送載體研發(fā)。將編碼細(xì)胞因子的mRNA 遞送至機(jī)體中，利用機(jī)體自身翻譯機(jī)制表達(dá)大量細(xì)胞因子進(jìn)而發(fā)揮治療作用。但直接向體內(nèi)遞送裸mRNA 易被體內(nèi)RNA 酶降解，且難以穿過(guò)細(xì)胞膜并導(dǎo)致先天性免疫激活，因此需將mRNA進(jìn)行體外包裝，從而實(shí)現(xiàn)mRNA有效遞送。

利用脂質(zhì)納米粒（lipid nanoparticle，LNP）技術(shù)可實(shí)現(xiàn)mRNA的有效遞送。LIU等［39］合成了含有二氨基的可電離脂質(zhì)材料（diamino lipid derivatives，DALs），并用該脂質(zhì)體包裹編碼細(xì)胞因子的mRNA 注射至腫瘤細(xì)胞內(nèi)。結(jié)果顯示，與單一細(xì)胞因子療法相比，腫瘤內(nèi)注射負(fù)載IL-12 mRNA的DAL4-LNP在抑制黑色素瘤生長(zhǎng)方面更有效。此外，腫瘤內(nèi)注射雙DAL4-LNP-IL-12 mRNA 和IL-27 mRNA 可協(xié)同抑制腫瘤生長(zhǎng)，并產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，重塑TME，而不會(huì)引起系統(tǒng)毒性。

將編碼細(xì)胞因子混合物的mRNA 用LNP 進(jìn)行局部遞送后增強(qiáng)T 細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的反應(yīng)，重塑TME［40］。雖然進(jìn)行了LNP 的局部遞送，但少量的LNP 也會(huì)從腫瘤部位泄露至循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)入肝臟導(dǎo)致脫靶效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中富含microRNA-122，可在mRNA上設(shè)計(jì)microRNA-122 的結(jié)合位點(diǎn)序列，當(dāng)LNP-mRNA進(jìn)入肝臟后，含microRNA-122 互補(bǔ)序列的mRNA 鏈會(huì)被切割，蛋白翻譯終止［41］。

3.2 基于T細(xì)胞的設(shè)計(jì) 嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T 細(xì)胞療法是體外收集并分離患者T 細(xì)胞后，在T 細(xì)胞上轉(zhuǎn)入特定的CAR 基因，并重新回輸至患者體內(nèi)。該方法使用了自體細(xì)胞，進(jìn)而減少了免疫介導(dǎo)的宿主排斥的反應(yīng)，但也增加了制造過(guò)程的復(fù)雜性，同時(shí)明顯增加了成本［42］。由于T 細(xì)胞持久性和適應(yīng)性差、實(shí)體瘤穿透性差以及TME 的免疫抑制，迄今為止在實(shí)體瘤中幾乎未取得成功。

CAR-T 細(xì)胞也可作為遞送細(xì)胞因子的載體，通過(guò)這種細(xì)胞載體可在體內(nèi)激發(fā)、維持和增強(qiáng)免疫反應(yīng)。研究表明，CCL19和IL-7在淋巴器官中T細(xì)胞區(qū)的形成及維持中發(fā)揮重要作用［43］。但直接將這些細(xì)胞因子與CAR-T 細(xì)胞結(jié)合可誘導(dǎo)細(xì)胞因子介導(dǎo)的毒性反應(yīng)［44］。ADACHI等［45］用2A肽將編碼CAR、IL-7 和CCL19 的基因串聯(lián)，形成表達(dá)IL-7 和CCL19 的CAR-T細(xì)胞，小鼠體內(nèi)注射后實(shí)現(xiàn)了實(shí)體瘤的完全消退和小鼠生存期延長(zhǎng)。LIU 等［46］利用一種非天然糖納米顆粒標(biāo)記T 細(xì)胞，用于錨定抗腫瘤細(xì)胞因子，一方面可增強(qiáng)T 細(xì)胞功能，另一方面使得毒性細(xì)胞因子具有局部、集中的活性而不產(chǎn)生不必要的全身副作用。該方法增加了T 細(xì)胞對(duì)實(shí)體瘤的浸潤(rùn)，刺激了宿主的免疫系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤細(xì)胞，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。

3.3 基于NK細(xì)胞的設(shè)計(jì) 與基于T細(xì)胞的免疫療法誘導(dǎo)的副作用相比，NK 細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移可引起輕微的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”和其他副作用。但NK 細(xì)胞的弱生存能力是一個(gè)缺點(diǎn)［47］。通過(guò)對(duì)NK 細(xì)胞進(jìn)行直接的基因修飾可延長(zhǎng)其在體內(nèi)的存在時(shí)間并發(fā)揮其生物學(xué)功能。LIU 等［48］用逆轉(zhuǎn)病毒載體將編碼IL-15、抗CD19 CAR、半胱天冬酶9 的基因修飾NK 細(xì)胞，從而構(gòu)建了CAR-NK 細(xì)胞以治療CD19 陽(yáng)性癌癥，在Ⅰ和Ⅱ期臨床試驗(yàn)（NCT03056339）中的大多數(shù)患者對(duì)治療均存在抗腫瘤反應(yīng)。

3.4 基于其他免疫細(xì)胞的設(shè)計(jì) YAO 等［49］從小鼠的單核細(xì)胞中分離并誘導(dǎo)出成熟的樹突狀細(xì)胞后，用構(gòu)建的過(guò)表達(dá)IL-12 的慢病毒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞以進(jìn)行基因修飾，將該樹突狀細(xì)胞注射至模型小鼠的黑色素瘤中，可產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤作用。由于嵌合抗原受體免疫細(xì)胞療法存在脫靶毒性、潛在免疫原性以及復(fù)雜和昂貴的體外制備等問(wèn)題，KANG 等［50］設(shè)計(jì)了一種CAR-巨噬細(xì)胞療法，將巨噬細(xì)胞靶向納米載體與CAR-IFNγ 編碼的質(zhì)粒組成納米復(fù)合物后并在體內(nèi)注射，結(jié)果顯示，該納米復(fù)合物可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1 型分化，并具有CAR 介導(dǎo)的腫瘤吞噬、抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)和抑制實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)的能力，對(duì)實(shí)體腫瘤非常有效，降低了制備成本，減少了制備過(guò)程的復(fù)雜性。

3.5 細(xì)胞因子與免疫檢查點(diǎn)阻斷劑的聯(lián)合設(shè)計(jì) 提供單一的免疫刺激信號(hào)并不足以產(chǎn)生持久的免疫反應(yīng)，因此，結(jié)合多種免疫刺激信號(hào)的聯(lián)合免疫療法越來(lái)越受到重視。以下重點(diǎn)介紹細(xì)胞因子與免疫檢查點(diǎn)阻斷劑的聯(lián)合設(shè)計(jì)。

在TME 中，腫瘤細(xì)胞上的免疫檢查點(diǎn)配體會(huì)與T 細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，從而產(chǎn)生免疫逃逸效應(yīng)。目前，廣泛應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)阻斷劑來(lái)恢復(fù)TME 中T細(xì)胞的免疫反應(yīng)性，但在所謂的“冷”腫瘤中效果有限。JEFFREY 等［51］用IL-12 與CBD 融合成CBD-IL-12，能局部激活抗腫瘤免疫，從而減少免疫相關(guān)副作用。進(jìn)一步將CBD-IL-12和抗程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）抗體聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果顯示免疫“冷”腫瘤有顯著的消退。

SHEN 等［52］設(shè)計(jì)將PD-1 靶向抗體與IL-21 突變體融合，這種雙功能融合蛋白可阻斷PD-1/PD-L1相互作用，同時(shí)將IL-21細(xì)胞因子遞送至表達(dá)PD-1的T細(xì)胞，可改善IL-21血清半衰期，進(jìn)而減少給藥頻率，并可改善和擴(kuò)展目前臨床上抗PD-1療法的效用。

4 總結(jié)、挑戰(zhàn)及展望

本文綜述了細(xì)胞因子工程化研究的最新進(jìn)展，通過(guò)蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)細(xì)胞因子進(jìn)行設(shè)計(jì)修飾或定點(diǎn)誘變，以提高細(xì)胞因子的治療效力；通過(guò)抗體結(jié)合、納米工程、病毒遞送及前藥等設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子的靶向遞送；通過(guò)將編碼幾種細(xì)胞因子的mRNA 用LNP 包裝后注射至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，增加細(xì)胞因子的治療效果；搭載細(xì)胞因子的免疫細(xì)胞療法和細(xì)胞因子偶聯(lián)毒素治療也取得了重大成功，各種工程化方法各有利弊，目前大部分產(chǎn)品均處于研發(fā)階段。

細(xì)胞因子類藥物的顯著毒性和微弱療效為臨床轉(zhuǎn)化帶來(lái)了重大挑戰(zhàn)，截至目前，唯一被臨床批準(zhǔn)改善細(xì)胞因子類藥物性質(zhì)的方法是與PEG 聚合物偶聯(lián)。細(xì)胞因子的多效性仍然是細(xì)胞因子衍生毒性的主要原因，并且是臨床轉(zhuǎn)化的一個(gè)大的障礙，因此，在激活所需免疫細(xì)胞與脫靶效應(yīng)之間找到最佳平衡仍然是一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。雖然細(xì)胞因子的工程開(kāi)發(fā)及聯(lián)用策略解決了細(xì)胞因子半衰期短及高劑量給藥全身反應(yīng)嚴(yán)重等問(wèn)題，但由于細(xì)胞因子的體外修飾會(huì)存在免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，盡管在動(dòng)物模型中取得了良好療效，但考慮跨物種的反應(yīng)性，其具體應(yīng)用仍需較長(zhǎng)時(shí)間，且細(xì)胞因子最佳給藥劑量和給藥途徑以及不同腫瘤類型對(duì)細(xì)胞因子或細(xì)胞因子組合敏感度的研究等問(wèn)題尚未解決。

未來(lái)將會(huì)出現(xiàn)更多研究，以提高用于治療目的細(xì)胞因子的活性、壽命、藥代動(dòng)力學(xué)和遞送。細(xì)胞因子療法有望從4 個(gè)方向發(fā)展：①利用生物學(xué)知識(shí)及現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)對(duì)細(xì)胞因子進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，以改進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)品藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，增加其半衰期；②局部給藥。將細(xì)胞因子的重組蛋白或編碼細(xì)胞因子的基因治療載體直接注射至TME 中，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子的靶向治療；③通過(guò)細(xì)胞因子的精準(zhǔn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)、復(fù)雜的患者分層實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子的精準(zhǔn)治療；④協(xié)同組合。如多種細(xì)胞因子的聯(lián)合治療，細(xì)胞因子與其他免疫療法聯(lián)合應(yīng)用。

綜上所述，各種細(xì)胞因子工程化策略之間的組合和調(diào)整可提高細(xì)胞因子臨床應(yīng)用的療效并降低不良副作用，這也將進(jìn)一步激發(fā)基于細(xì)胞因子的免疫療法的發(fā)展，從而為難治性疾病的治療開(kāi)發(fā)新方法和新途徑。