王吉，王莎莎，李威，付瑞，譚淑萍，范婷婷，鄭立群，劉志堅(jiān)，湯華東，萬(wàn)滔，岳秉飛

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物遺傳檢測(cè)中心，北京 102629；2.舒泰神（北京）生物制藥股份有限公司，北京 100176；3.未名生物醫(yī)藥有限公司，福建廈門 361009；4.武漢海特生物制藥股份有限公司，湖北武漢 430056

動(dòng)物源性制品存在攜帶人獸共患病毒的可能，為確保人用動(dòng)物源性生物制品的使用安全性，避免如漢坦、呼腸孤病毒Ⅲ型等人獸共患病毒的擴(kuò)散［1-2］，人用藥品注冊(cè)技術(shù)國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（International Conference on Harmonization，ICH）及《歐洲藥典》EP10.2021對(duì)人用動(dòng)物源性原材料及制品均有病毒安全性評(píng)價(jià)及檢測(cè)的相關(guān)要求［3-4］?！吨袊?guó)藥典》三部（2020 版）對(duì)人用動(dòng)物源性生物制品及原材料的使用安全性也有相應(yīng)要求，包括人用鼠源表皮生長(zhǎng)因子、鼠源神經(jīng)生長(zhǎng)因子、單克隆抗體等相關(guān)制品均需進(jìn)行8 種鼠源人獸共患外源病毒的檢測(cè)［5］。

《中國(guó)藥典》三部（2015版）收錄的鼠源人獸共患外源病毒檢測(cè)方法包括細(xì)胞試驗(yàn)、動(dòng)物抗體產(chǎn)生試驗(yàn)、雞胚感染試驗(yàn)等方法，耗時(shí)較長(zhǎng)、操作繁瑣、使用動(dòng)物數(shù)量較多，還會(huì)產(chǎn)生動(dòng)物干擾檢驗(yàn)結(jié)果等問(wèn)題［5］。為避免上述不足，中國(guó)食品藥品檢定研究院（以下簡(jiǎn)稱中檢院）和舒泰神（北京）生物制藥股份有限公司（以下簡(jiǎn)稱舒泰神）建立了對(duì)8種鼠源性病毒的熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，Q-PCR）檢測(cè)方法，在此基礎(chǔ)上，由中檢院聯(lián)合舒泰神、廈門未名生物醫(yī)藥有限公司和武漢海特生物制藥股份有限公司3 家單位，對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，以期用于鼠源性制品8種外源病毒的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 病毒 淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）、漢坦病毒（Hantavirus，HV）、鼠痘病毒（又名脫腳病病毒）（ectromelia virus，EctV/Mouse Pox，MPV）、仙臺(tái)病毒（Sendai virus，SV）、小鼠肺炎病毒（pneumonia virus of mice，PVM）、呼腸孤病毒Ⅲ型（reovirus type 3，Reo3）、鼠腺病毒（mouse adenovirus，MAdV）、小鼠白血病病毒（mouse leukemia virus，MuLv）、小鼠腦脊髓炎病毒（Theiler’s murine encephalomyelitis virus，TMEV）、腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）、牛痘病毒（cowpox virus，CPV）、流感病毒H3N2（簡(jiǎn)稱H3N2）、流感病毒B（influenza B virus，F(xiàn)lu B）、猴腺病毒（simian adenovirus，SAdV）、禽腺病毒Ⅰ型（fowl adenovirus groupⅠ，F(xiàn)AdV-Ⅰ）及禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）均由中檢院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)室保存并提供。

1.2 樣品 26 批SARS-CoV-2 疫苗生產(chǎn)用單抗細(xì)胞株由國(guó)內(nèi)15 個(gè)廠家提供；15 批其他鼠源性制品（重組帶狀皰疹疫苗3 批、抗人CD3 抗體3 批、鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子6 批、鼠表皮生長(zhǎng)因子3 批）由國(guó)內(nèi)6 個(gè)廠家提供；陰性單抗細(xì)胞株（經(jīng)Q-PCR 法檢測(cè)確認(rèn)8 種病毒均為陰性）為國(guó)內(nèi)某廠家送檢的重組帶狀皰疹疫苗生產(chǎn)用單抗細(xì)胞株。

1.3 主要試劑 8種病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及EASY Dilution（for Real Time PCR）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Taqman DNA Expression Master Mix購(gòu)自美國(guó)ABI公司；RNA 快速提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 委托Thermo 公司設(shè)計(jì)并合成針對(duì)8 種鼠源性病毒的引物和探針，見(jiàn)表1。按照《中國(guó)藥典》三部（2020 版）通則3303 鼠源性病毒檢查法，分別由中檢院、舒泰神、廈門未名生物醫(yī)藥有限公司、武漢海特生物制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)室（編碼1～4）進(jìn)行檢測(cè)。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用EASY Dilution 進(jìn)行10 倍系列稀釋（2 × 108～2 × 100copies/μL），取2×107～2×102copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)。PCR反應(yīng)體系為：RNase FreedH2O3.75μL，引物F/R（10μmol/L）各0.5μL，探針（10μmol/L）0.25μL，模板5μL，TaqmanDNAExpression Master Mix 10μL，共20μL。PCR反應(yīng)條件為：50 ℃保持2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40 個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)［1-7］。探針的熒光標(biāo)記選擇FAM（5'端）作為報(bào)告發(fā)光基團(tuán)，TAMRA（3'端）為淬滅基團(tuán)。以Ct為縱坐標(biāo)，病毒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（取5～7 個(gè)稀釋度）［1，7］，標(biāo)準(zhǔn)曲線的Slope 應(yīng)在-3～-3.5之間，R2應(yīng)＞1±0.05，Eff應(yīng)在80%～120%之間。

表1 8種病毒引物及探針序列Tab.1 Sequences of primers and probes of 8 viruses

1.5 檢測(cè)方法 用RNA 快速提取試劑盒提取待檢病毒總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及條件同1.4 項(xiàng)。Ct≤35 且拷貝數(shù)≥10 copies/μL時(shí)，判為陽(yáng)性；Ct≤35且拷貝數(shù)＜10或Ct＞35且拷貝數(shù)≥10或Ct＞35且拷貝數(shù)＜10 copies/μL時(shí)，判為陰性。

1.6 方法的驗(yàn)證

1.6.1 特異性 選擇LCMV、HV、EctV、SV、PVM、Reo3、MAdV、MuLv 8 種鼠源性病毒及相應(yīng)的小鼠其他易感病毒、同科同屬病毒及感染引起同類疾病的相關(guān)病毒［8-9］，每種鼠源性病毒對(duì)應(yīng)的其他病毒見(jiàn)表2。按1.5 項(xiàng)方法于4 個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行檢測(cè)，以RNase Free dH2O作為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)［1，7］。8種鼠源性病毒應(yīng)有特異性病毒擴(kuò)增曲線產(chǎn)生，其他病毒應(yīng)無(wú)擴(kuò)增曲線。

表2 8種病毒特異性驗(yàn)證用相關(guān)病毒Tab.2 Related viruses used for detection of specificity of Q-PCR method for 8 viruses

1.6.2 靈敏度 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用EASY Dilution 稀釋為2×107～2×100copies/μL，按1.5 項(xiàng)方法，于4 個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)稀釋度設(shè)3 個(gè)重復(fù)［1，4］。靈敏度應(yīng)不低于2×102copies/μL。

1.6.3 精密性 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用EASY Dilution 稀釋為2×103～2×107copies/μL，隨機(jī)選擇3 個(gè)連續(xù)濃度梯度，按1.5 項(xiàng)方法檢測(cè)3 次，每個(gè)濃度各設(shè)3 個(gè)重復(fù)，計(jì)算3個(gè)重復(fù)的Ct和拷貝數(shù)變異系數(shù)（CV），即試驗(yàn)內(nèi)精密性；計(jì)算每個(gè)濃度梯度3 次檢測(cè)間Ct和拷貝數(shù)的CV，即試驗(yàn)間精密性。Ct和拷貝數(shù)的CV均應(yīng)＜25%。4個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行檢測(cè)，每次檢測(cè)至少應(yīng)有3個(gè)實(shí)驗(yàn)室滿足上述結(jié)果要求［1，4］。

1.7 病毒污染模擬試驗(yàn) 將LCMV、HV、EctV、SV、PVM、Reo3、MAdV、MuLv 8 種鼠源性病毒用無(wú)菌PBS 稀釋為10-1～10-8，將不同濃度梯度病毒按10%的體積分?jǐn)?shù)加入陰性單抗細(xì)胞株樣品中，取0.2 mL，采用1.5項(xiàng)方法進(jìn)行檢測(cè)。4個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)室間拷貝數(shù)檢測(cè)限相差應(yīng)≤1個(gè)數(shù)量級(jí)［1，7］。

1.8 盲樣檢測(cè) 給每個(gè)廠家隨機(jī)分發(fā)32份陰性單抗細(xì)胞株樣品，每種病毒4份，其中2份加入不同量（1%～50%）的相應(yīng)病毒，混勻，即陽(yáng)性樣品。2 份陰性及2份陽(yáng)性樣品隨機(jī)編號(hào)1 ～4。采用1.5項(xiàng)方法進(jìn)行檢測(cè)，以RNase Free dH2O為陰性對(duì)照。檢出的陽(yáng)性樣品，需用相同方法進(jìn)行復(fù)檢。4家單位檢出結(jié)果符合率應(yīng)為100%［1，7］。

1.9 方法的應(yīng)用 用建立的方法檢測(cè)26批國(guó)內(nèi)15個(gè)廠家的SARS-CoV-2 疫苗生產(chǎn)用單抗細(xì)胞株及15 批國(guó)內(nèi)6個(gè)廠家其他鼠源性制品的8種外源病毒。

1.10 數(shù)據(jù)采集及分析 應(yīng)用7500fast 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、分析及作圖。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 實(shí)驗(yàn)室1檢測(cè)LCMV的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)圖1，獲得曲線方程為：y= -3.284x+ 35.917，R2=0.999，實(shí)驗(yàn)室1 對(duì)其他病毒及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線均略。8 種病毒的Q-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)均符合要求，見(jiàn)表3。

圖1 實(shí)驗(yàn)室1檢測(cè)LCMV的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of LCMV detection in laboratory 1

表3 4個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立8種病毒Q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)匯總表Tab.3 Summary table of Q-PCR standard curve parameters of 8 viruses in 4 laboratories

2.2 方法的驗(yàn)證

2.2.1 特異性 Q-PCR 法檢測(cè)8 種病毒均可見(jiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照和其他病毒均無(wú)擴(kuò)增曲線產(chǎn)生。以實(shí)驗(yàn)室1對(duì)LCMV特異性擴(kuò)增曲線圖為例，見(jiàn)圖2，其他均略，相應(yīng)Ct和拷貝數(shù)見(jiàn)表4。表明該方法具有良好的特異性。

圖2 特異性驗(yàn)證的擴(kuò)增曲線（以實(shí)驗(yàn)室1 檢測(cè)LCMV為例）Fig.2 Amplification curve of specificity verification（taking LCMV detection in laboratory 1 as example）

表4 特異性驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Specificity verification results

2.2.2 靈敏度 實(shí)驗(yàn)室2 對(duì)EctV 檢測(cè)的靈敏度為2 × 102copies/μL，實(shí)驗(yàn)室2 對(duì)其他7 種病毒及其他3 個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)8 種鼠源性病毒的檢測(cè)靈敏度均為2×101copies/μL，以實(shí)驗(yàn)室1 對(duì)LCMV 的特異性擴(kuò)增曲線為例，見(jiàn)圖3，其他均略。

圖3 靈敏度驗(yàn)證的擴(kuò)增曲線（以實(shí)驗(yàn)室1檢測(cè)LCMV為例）Fig.3 Amplification curve of sensitivity verification（taking LCMV detection in laboratory 1 as example）

2.2.3 精密性 除實(shí)驗(yàn)室3 對(duì)MAdV 檢測(cè)拷貝數(shù)試驗(yàn)間CV為37.58%外，實(shí)驗(yàn)室3對(duì)其他7種病毒和其他3個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)8種病毒檢測(cè)的試驗(yàn)內(nèi)、試驗(yàn)間Ct和拷貝數(shù)CV均＜25%，。以實(shí)驗(yàn)室1對(duì)LCMV特異性擴(kuò)增曲線為例，見(jiàn)圖4。表明該方法具有良好的精密性。

圖4 精密性驗(yàn)證的擴(kuò)增曲線（以實(shí)驗(yàn)室1檢測(cè)LCMV為例）Fig.4 Amplification curve of precision verification（taking LCMV detection in laboratory 1 as example）

2.3 病毒模擬污染試驗(yàn) 4 個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)模擬污染病毒的檢測(cè)靈敏度相差均控制在1 個(gè)數(shù)量級(jí)之內(nèi)，見(jiàn)圖5（以實(shí)驗(yàn)室1對(duì)LCMV特異性擴(kuò)增曲線為例）及表5。

圖5 病毒模擬污染的擴(kuò)增曲線（以實(shí)驗(yàn)室1檢測(cè)LCMV為例）Fig.5 Amplification curve of virus simulated contamination test（taking LCMV detection in laboratory 1 as example）

表5 8種病毒模擬污染試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Simulated contamination test results of 8 viruses

2.4 盲樣檢測(cè) 4 個(gè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)盲樣樣本陰性結(jié)果和陽(yáng)性結(jié)果符合率為100%，見(jiàn)圖6、圖7（以驗(yàn)室1對(duì)LCMV特異性擴(kuò)增曲線為例）及表6。

圖6 盲樣檢測(cè)結(jié)果（以實(shí)驗(yàn)室1檢測(cè)LCMV為例）Fig.6 Blind sample detection results of LCMV in laboratory 1（taking LCMV detection in laboratory 1 as example）

圖7 盲樣陽(yáng)性樣本復(fù)檢結(jié)果（以實(shí)驗(yàn)室1 檢測(cè)LCMV為例）Fig.7 Retest results of LCMV blind positive samples by laboratory 1（taking LCMV detection in laboratory 1 as example）

表6 8種病毒熒光定量PCR法盲樣檢測(cè)結(jié)果匯總表Tab.6 Summary results of blind sample detection by Q-PCR for 8 viruses

2.3 方法的應(yīng)用 26 批SARS-CoV-2 疫苗生產(chǎn)用單抗細(xì)胞株及15 批其他鼠源性制品的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，圖略。

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)、生物學(xué)檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)的不斷更新和發(fā)展，對(duì)人用生物制品的檢測(cè)提出了新的要求，尤其是人用動(dòng)物源性生物制品的使用安全性方面。Q-PCR法操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰可靠，已廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)與診斷、質(zhì)量與安全檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域［10-16］?！睹绹?guó)藥典》USP43.2020和《歐洲藥典》EP10.2021 已將Q-PCR 法納入用于動(dòng)物源性產(chǎn)品及細(xì)胞基質(zhì)外源病毒的檢測(cè)［3-4］。本研究對(duì)8 種鼠源病毒Q-PCR 法進(jìn)行了驗(yàn)證，該方法既能提高檢測(cè)的敏感性和特異性，又能與國(guó)際接軌［6］。

本研究結(jié)果顯示，4 個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立的8 種病毒Q-PCR 法標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)均符合要求。驗(yàn)證結(jié)果顯示，Q-PCR法檢測(cè)8種目的病毒均可見(jiàn)特異性擴(kuò)增曲線，檢測(cè)同科同屬或小鼠易感其他病毒均未見(jiàn)相應(yīng)特異性擴(kuò)增曲線；除實(shí)驗(yàn)室2 對(duì)EctV 的靈敏度為2×101copies/μL外，實(shí)驗(yàn)室2對(duì)其他7種病毒和其他實(shí)驗(yàn)室對(duì)8 種病毒的靈敏度均為2 × 101copies/μL；4 個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)LCMV、HV、PVM、MuLv 4 種病毒模擬污染試驗(yàn)的檢測(cè)靈敏度一致；除實(shí)驗(yàn)室3對(duì)MAdV檢測(cè)拷貝數(shù)試驗(yàn)間CV為37.58%外，實(shí)驗(yàn)室3 對(duì)其他7種病毒和其他3個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)8種病毒檢測(cè)的試驗(yàn)內(nèi)、試驗(yàn)間Ct和拷貝數(shù)CV均＜25%，符合重復(fù)性穩(wěn)定性要求。盲樣檢測(cè)結(jié)果顯示，4個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果符合率為100%，表明8 種鼠源病毒Q-PCR 法特異性、靈敏度、精密性良好。

實(shí)驗(yàn)室2檢測(cè)EctV的靈敏度為2×102copies/μL，與預(yù)期結(jié)果（2×101copies/μL）相差1 個(gè)數(shù)量級(jí)；實(shí)驗(yàn)室3 對(duì)MAdV 檢測(cè)拷貝數(shù)試驗(yàn)間CV為37.58%，不符合＜25%的要求；模擬病毒污染試驗(yàn)結(jié)果顯示，4個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)EctV、SV、Reo3 和MAdV 4 種病毒檢測(cè)靈敏度不完全一致，相差1 個(gè)數(shù)量級(jí)。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是受不同人員操作熟練程度、不同儀器升溫和降溫的精確性差異及每個(gè)孔間溫度的均一性差異等因素影響而導(dǎo)致的［7］。因此，在設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及判定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)考慮上述因素的影響，在Q-PCR檢測(cè)限之內(nèi)，規(guī)定方法靈敏度驗(yàn)證應(yīng)不低于2×102copies/μL，模擬污染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靈敏度差異在1 個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)，精密性驗(yàn)證CV應(yīng)＜25%。

Q-PCR 法與鼠源性病毒檢測(cè)傳統(tǒng)方法比較，不僅可定性，還可定量，且操作簡(jiǎn)便快速，節(jié)省動(dòng)物的使用量，符合減少（reduction）、替代（repIacement）和優(yōu)化（refinement），即3R 原則；避免了動(dòng)物本身可能攜帶病毒的干擾，使結(jié)果判定更加準(zhǔn)確可靠；易于推廣，有助于企業(yè)自檢；應(yīng)用范圍廣，可用于鼠源性生物制品、半成品及原材料的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)室采用Q-PCR 法對(duì)26 批SARS-CoV-2 疫苗生產(chǎn)用單抗細(xì)胞株及15 批鼠源神經(jīng)生長(zhǎng)因子和其他制品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，節(jié)省了大量動(dòng)物，縮短了檢驗(yàn)周期，加快了產(chǎn)品的研發(fā)速度和上市時(shí)間，尤其是為SARS-CoV-2疫苗等相關(guān)產(chǎn)品的上市爭(zhēng)取了時(shí)間。