◎ 鄒曉花，方瑞雪

（西部第三方檢測集團（寧夏）有限公司，寧夏 銀川 750021）

本文旨在試析PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)在食品微生物檢測中的運用策略。通過系統(tǒng)研究PCR 技術(shù)的原理、步驟和應(yīng)用案例，探討了如何選擇合適的微生物目標、優(yōu)化前處理步驟、設(shè)計特異性引物和探針，并優(yōu)化PCR 反應(yīng)條件，以提高食品微生物檢測的準確性和效率。

1 PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)

1.1 優(yōu)勢

①PCR 技術(shù)具有高度的靈敏性和特異性，可以檢測微生物目標的低濃度。由于PCR 反應(yīng)能夠擴增目標DNA 序列，即使微生物目標在食品樣品中的濃度非常低，也能夠通過PCR 放大到足夠的數(shù)量進行檢測。同時，通過正確設(shè)計引物和探針，可以確保PCR 反應(yīng)的特異性，只檢測特定的微生物目標，避免誤報和交叉反應(yīng)。②PCR 能夠在短時間內(nèi)完成目標DNA 的擴增和檢測。PCR 反應(yīng)的周期時間可以在幾小時內(nèi)完成，有效提升食品微生物檢測速度，提供及時的結(jié)果。③PCR 技術(shù)可以通過前處理步驟去除樣品中的抑制物質(zhì)，并通過擴增目標DNA 的方法，克服復(fù)雜樣品的困難，提供更可靠的檢測結(jié)果[1]。

1.2 挑戰(zhàn)

①食品樣品的復(fù)雜性和多樣性，是PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中面臨的挑戰(zhàn)之一。不同食品樣品的成分和特性各不相同，可能導(dǎo)致樣品前處理和DNA 提取過程困難。②樣品中的抑制物質(zhì)和基質(zhì)干擾可能影響PCR 反應(yīng)的效果，導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。因此，在PCR 技術(shù)中，檢測人員需要考慮抑制物質(zhì)的存在，并采取相應(yīng)措施減輕其影響，如優(yōu)化DNA 提取方法和使用特殊試劑來消除抑制物質(zhì)。③PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中需要特定的實驗室設(shè)備和技術(shù)要求，包括溫控設(shè)備、PCR儀器、核酸提取設(shè)備和引物設(shè)計軟件等。④PCR 技術(shù)需要熟練的試驗操作和技術(shù)知識，以確保PCR 反應(yīng)的可靠性和重復(fù)性[2]。

2 PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的戰(zhàn)略應(yīng)用

PCR 技術(shù)作為一種強大的分子生物學(xué)工具，已經(jīng)在食品微生物檢測領(lǐng)域展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景。其在食品安全保障中的戰(zhàn)略性應(yīng)用，不僅可以提高檢測的靈敏度和特異性，還可以加速檢測過程，從而更好地滿足快速鑒定和檢測的需求。

2.1 靶標選擇與設(shè)計策略

2.1.1 靶標基因的重要性與選擇原則

在食品微生物檢測中運用PCR 技術(shù)時，靶標基因的選擇是確保檢測結(jié)果準確性和可靠性的關(guān)鍵因素。具體而言，靶標基因作為PCR 擴增的目標，在決定檢測靈敏度和特異性的同時，也影響著分析的可行性和實用性。合理選擇靶標基因可以使PCR 技術(shù)更好地適應(yīng)不同食品樣品的微生物檢測需求。通常情況下，選擇在目標微生物中具有高度保守性和特異性的基因片段作為靶標是必要的。其中，保守性指的是基因在不同菌株中的序列保持相對穩(wěn)定，以確保在多樣的微生物群體中同樣能被擴增；特異性是確保引物和探針僅與目標微生物的基因序列匹配，避免與其他非目標微生物的DNA 片段發(fā)生交叉反應(yīng)。作為一個成功的靶標基因，16S rRNA 基因在大多數(shù)細菌中具有高度保守性，因此被廣泛應(yīng)用于微生物鑒定。這一基因區(qū)段在細菌中扮演重要的生物學(xué)功能，其序列在不同菌株之間的變異性相對較小，使其成為微生物分類學(xué)和鑒定的理想選擇。

2.1.2 引物與探針設(shè)計的考慮因素

靶標基因片段的交叉反應(yīng)，是在PCR 技術(shù)中需要謹慎考慮的重要問題之一。在食品微生物檢測中，可能存在多種微生物種類，其基因組中的某些片段可能相似，導(dǎo)致引物與非目標微生物的DNA 產(chǎn)生交叉反應(yīng)。這種交叉反應(yīng)可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果，從而誤導(dǎo)檢測結(jié)果。因此，在選擇引物時，檢測人員需要特別關(guān)注其獨特性和特異性。其中，引物的獨特性和特異性可以通過生物信息學(xué)工具進行預(yù)測和分析。在引物設(shè)計的初期，檢測人員可以使用多序列比對分析，比較目標微生物和非目標微生物的基因序列，找到具有較高特異性的區(qū)域作為引物的擴增目標。探針設(shè)計應(yīng)考慮以下因素。①特異性結(jié)合：探針的序列應(yīng)該與引物擴增產(chǎn)物的特定區(qū)域相匹配，從而實現(xiàn)特異性結(jié)合。這可以通過確保探針序列僅與目標基因序列的特異性部分匹配來實現(xiàn)。②獨特性：與引物一樣，探針的序列應(yīng)該在目標微生物和非目標微生物中具有足夠的獨特性，以避免交叉反應(yīng)。生物信息學(xué)工具可以用來分析可能的交叉反應(yīng)情況。③標簽的選擇：探針上的熒光標簽和探針的修飾，對于檢測的靈敏度和特異性有影響。熒光標簽應(yīng)具有穩(wěn)定性和高信號強度，以確保在PCR反應(yīng)中可靠地檢測到信號。

2.2 樣本處理與前處理策略

2.2.1 樣本來源與處理的挑戰(zhàn)

在食品微生物檢測中，樣本的來源和處理是影響PCR 技術(shù)應(yīng)用的重要因素之一。食品樣本的復(fù)雜性可能對PCR 的準確性和靈敏度產(chǎn)生影響。不同食品類型的樣本可能包含不同的成分，如脂肪、蛋白質(zhì)、糖類等，這些成分可能干擾PCR 反應(yīng)，影響檢測結(jié)果的可靠性。此外，食品樣本中可能還存在各種抑制因子，如多種化學(xué)物質(zhì)、酶抑制劑等，也可能阻礙PCR 擴增的進行。這些樣本復(fù)雜性帶來的挑戰(zhàn)需要在樣本處理過程中克服，以確保PCR 反應(yīng)的可靠性和準確性。否則，可能會導(dǎo)致假陰性或假陽性的結(jié)果，影響食品微生物檢測的準確性[3]。

2.2.2 去除抑制因子的方法與策略

為了克服食品樣本中的抑制因子，樣本前處理過程至關(guān)重要。當前，有多種方法和策略可以幫助減少抑制效應(yīng)，保障PCR 檢測的準確性[4]。①使用特定的提取試劑盒：不同的提取試劑盒可以針對不同食品類型的樣本特性，選擇適當?shù)姆椒ㄟM行核酸提取，以有效分離核酸，并去除一些抑制因子。②酶處理：酶的加入可以在核酸提取過程中分解一些抑制性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)酶、脂肪酶等，有助于減少抑制效應(yīng)，提高PCR 反應(yīng)的成功率。③離心：通過離心操作，可以將樣本中的固體顆粒沉淀，分離出液相，從而降低抑制性物質(zhì)的含量。④稀釋樣本：對于特別濃縮或含有高濃度抑制因子的樣本，可以進行適當?shù)南♂?，從而降低抑制效?yīng)。⑤內(nèi)標物質(zhì)的使用：內(nèi)標物質(zhì)是已知的DNA 片段，與待測的目標基因一起擴增。內(nèi)標物質(zhì)的存在可以幫助判斷PCR 反應(yīng)是否受到抑制，從而驗證結(jié)果的可靠性。

2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化策略

2.3.1 溫度循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化與穩(wěn)定性

PCR 反應(yīng)的溫度循環(huán)參數(shù)對于擴增效率和產(chǎn)物特異性具有重要影響。①在PCR 過程中，溫度循環(huán)通過不同溫度階段的切換來實現(xiàn)DNA 的變性、退火和延伸。因此，優(yōu)化這些溫度循環(huán)參數(shù)可以顯著提高PCR 反應(yīng)的效率和準確性。通過調(diào)整退火溫度，可以確保引物在目標DNA 序列上結(jié)合的特異性。②延伸時間的優(yōu)化也至關(guān)重要。延伸時間應(yīng)足夠長，以確保DNA 聚合酶充分擴增目標序列，同時也應(yīng)避免過長的延伸時間，以免引起非特異性擴增或引物的降解。③擴增周期數(shù)的選擇取決于起始DNA 模板的初始濃度以及所需的擴增量。適當?shù)闹芷跀?shù)可以在不引起副產(chǎn)物的情況下達到足夠的擴增。

2.3.2 反應(yīng)體系組成的調(diào)控與優(yōu)化

①PCR 反應(yīng)體系的組成是影響PCR 反應(yīng)效率和產(chǎn)物穩(wěn)定性的重要因素之一。合理的反應(yīng)體系組成可以確保引物和核酸模板之間的充分結(jié)合，以及酶的高效催化。在反應(yīng)體系中，核酸模板的濃度應(yīng)該處于合適的范圍內(nèi)，以確保擴增的效率和特異性。引物和探針的濃度也需要經(jīng)過優(yōu)化，以避免過高或過低的濃度對反應(yīng)的影響。②反應(yīng)體系中，緩沖液的選擇和濃度影響pH 值的穩(wěn)定，從而影響酶的活性。適當添加酶抑制劑可以防止酶在PCR 反應(yīng)開始前不受控制的活性，從而保證反應(yīng)的穩(wěn)定性[5]。

2.4 數(shù)據(jù)分析與結(jié)果解釋策略

2.4.1 分析PCR 產(chǎn)物的方法與工具

當前，有多種方法和工具可以用于分析PCR 產(chǎn)物。①凝膠電泳是一種常用的分析方法，通過將PCR 產(chǎn)物在凝膠中進行電泳分離，可根據(jù)產(chǎn)物的大小判斷PCR擴增是否成功。然而，凝膠電泳能夠提供關(guān)于PCR 產(chǎn)物大小的信息，但無法進行定量分析。②毛細管電泳是一種高效分離和定量分析PCR 產(chǎn)物的方法。它通過在毛細管中進行電泳分離，根據(jù)PCR 產(chǎn)物的大小和電荷來分析樣品。③實時熒光PCR 是一種廣泛應(yīng)用于PCR 分析的技術(shù)。它可以提供實時監(jiān)測PCR 產(chǎn)物積累量的信息，通過熒光信號的強度來反映目標基因的豐度。實時熒光PCR 可以用于定量分析，計算閾值周期數(shù)（Ct 值），從而比較不同樣本中目標基因的數(shù)量。④數(shù)據(jù)分析工具和軟件，在PCR 產(chǎn)物分析中扮演著重要角色。這些工具可以用于解釋實時熒光PCR 的結(jié)果，繪制熒光曲線和標準曲線，計算Ct 值以及進行樣品間和批次間的比較與分析。

2.4.2 結(jié)果的可靠性和準確性的驗證

為了確保PCR 結(jié)果的準確性和可靠性，需要進行嚴格的驗證步驟。①陽性和陰性對照樣本：陽性對照樣本可以包含已知目標基因序列，用于驗證PCR 的靈敏度和特異性。同時，陰性對照樣本可以用于檢測是否存在潛在的污染。②重復(fù)性試驗：進行多次獨立的PCR試驗，可以驗證結(jié)果的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。通過比較不同試驗之間的結(jié)果，可以評估PCR 反應(yīng)的一致性和穩(wěn)定性。③平行試驗：同時進行多個平行試驗，可以評估試驗的一致性，幫助排除試驗中可能的隨機誤差。通過上述驗證步驟，可以確保PCR 檢測結(jié)果的可靠性和準確性，有助于排除假陽性和假陰性結(jié)果，提高PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的可信度和應(yīng)用價值。

3 結(jié)語

綜上所述，PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中具有巨大的潛力和廣泛的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和改進，PCR 技術(shù)將在食品微生物檢測中發(fā)揮越來越重要的作用，為人們提供更加可靠和高效的食品安全保障。