劉芳，郭佳穎，林少鴻，侯玉菲，陳鑫

(福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122)

卒中后認(rèn)知障礙(post-stroke cognitive impairment，PSCI)是卒中后常見的并發(fā)癥之一。一項(xiàng)大型國(guó)際隊(duì)列研究結(jié)果表明，PSCI發(fā)病率高達(dá)24%-53.4%[1]，我國(guó)最新的《卒中后認(rèn)知障礙管理專家共識(shí)》顯示，約1/3的卒中幸存者患有PSCI，PSCI對(duì)卒中病人的生活質(zhì)量及生存時(shí)間產(chǎn)生了嚴(yán)重影響[2]。學(xué)習(xí)記憶障礙是PSCI患者最首要的特征，也是引起卒中持久后遺癥的主要因素[3]。艾灸作為其中不可或缺的一種非侵入性中醫(yī)外治法，是中風(fēng)的中醫(yī)特色護(hù)理技術(shù)之一[4，5]?！巴ǘ秸{(diào)神灸”是艾灸中的一種重要類型，其“通督”的治療總綱領(lǐng)與歷代醫(yī)家強(qiáng)調(diào)的“病變?cè)谀X，首取督脈”一致，成為了臨床PSCI治療中最常用的艾灸類型，但其作用機(jī)制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血區(qū)域的存活神經(jīng)元可通過(guò)軸突再生(即損傷神經(jīng)元的軸突末端形成生長(zhǎng)錐)與損傷區(qū)附近皮層重新建立連接，從而改善神經(jīng)功能。Cofilin是一種肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白，它定位于生長(zhǎng)錐，研究顯示其與卒中以及認(rèn)知障礙的發(fā)生發(fā)展存在著一定的聯(lián)系[6，7]。本研究通過(guò)觀察通督調(diào)神灸干預(yù)對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠神經(jīng)缺損情況、學(xué)習(xí)記憶能力、腦梗死情況、神經(jīng)元凋亡、軸突再生及Cofilin的影響，探討通督調(diào)神灸對(duì)MCAO大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的干預(yù)效果及作用機(jī)制，為通督調(diào)神灸在PSCI患者臨床康復(fù)護(hù)理中的推廣和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

45只成年健康雄性SD大鼠[許可證號(hào)碼：SCXK(滬)2017-0005]購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，體質(zhì)量250-300 g，于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證編號(hào):SYXK(閩)2020-0003]適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)：2021159)。分組采用隨機(jī)數(shù)字表，分為假手術(shù)組、模型組和通督調(diào)神灸組3組，15只/組。

1.2 模型制備

所有大鼠于術(shù)前禁食12 h，對(duì)模型組和通督調(diào)神灸組大鼠進(jìn)行左側(cè)MCAO手術(shù)。具體步驟：①大鼠稱重后，20%烏拉坦注射液0.6 mL/100 g腹腔注射麻醉；②充分麻醉后，仰臥固定頭部和四肢于實(shí)驗(yàn)鼠板，頸部充分暴露后備皮，消毒；③從頸部正中線剪開皮膚，鈍性分離并結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈；④頸內(nèi)動(dòng)脈被鈍性分離后用血管夾夾閉其遠(yuǎn)心端；⑤在頸總動(dòng)脈結(jié)扎處遠(yuǎn)端0.5 mm處剪一小口，將MCAO模型線栓由頸總動(dòng)脈開口處插入頸內(nèi)動(dòng)脈；⑥松開血管夾，將線栓繼續(xù)推入至遇少許阻力，深度約為20 mm，即表明線栓已進(jìn)入大腦中動(dòng)脈內(nèi)，記錄時(shí)間；⑦將頸內(nèi)動(dòng)脈及線栓一同結(jié)扎，常規(guī)縫合、消毒頸部手術(shù)切口并使線栓尾部暴露在皮膚之外，腹腔注射慶大霉素注射液后將大鼠放于恒溫加熱墊上保暖直至蘇醒；⑧待線栓插入1.5 h后將線栓部分拔出以實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈的缺血再灌注，最后將切口外線栓剪斷完成造模。待大鼠清醒后，根據(jù)Zea-Longa神經(jīng)功能缺損評(píng)分法[8]判斷造模是否成功，評(píng)分為1-3分表明MCAO大鼠造模成功。假手術(shù)組僅進(jìn)行分離動(dòng)脈操作，未結(jié)扎和插栓等。

1.3 干預(yù)措施

通督調(diào)神灸組于造模后第2天開始對(duì)大鼠進(jìn)行通督調(diào)神灸干預(yù)，即一手抓取大鼠并用食指和中指對(duì)其頭部稍加固定，一手持點(diǎn)燃后的艾條(直徑約8 mm)，在大鼠百會(huì)穴上方20-30 mm處施灸，穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9],20 min/次,1次/d,持續(xù)干預(yù)7 d[10]。另外兩組給予同等條件抓取，無(wú)其他干預(yù)。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

于造模清醒后2 h及干預(yù)7 d后進(jìn)行Zea-Longa評(píng)分評(píng)估各組大鼠的神經(jīng)功能缺損情況。

1.4.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行和空間探索兩部分實(shí)驗(yàn)，用以評(píng)估大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。定位航行實(shí)驗(yàn)：于干預(yù)第2-6天進(jìn)行。將大鼠面朝池壁順序從四個(gè)象限放入水中，若于90 s內(nèi)找到平臺(tái)并停留時(shí)間達(dá)3 s以上，尋找平臺(tái)成功，所耗費(fèi)時(shí)間即為逃避潛伏期；若大于90 s仍未能找到平臺(tái)，則記為90 s，四個(gè)象限的平均值即為逃避潛伏期，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用毛巾將大鼠擦干并置于烤燈下烘干保暖。空間搜索實(shí)驗(yàn)：于艾灸干預(yù)7 d后，平臺(tái)移除后將大鼠從第一象限放入水中，記錄其90 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.4.3 腦梗死體積測(cè)定

于造模24 h后及干預(yù)7 d后采用micro-MRI對(duì)各組大鼠的頭部進(jìn)行掃描，觀察大鼠左側(cè)腦梗死體積。大鼠吸入麻醉后，俯臥位固定于掃描床上，采用T2加權(quán)成像(T2-weighted imaging，T2WI)掃描。掃描結(jié)束后，運(yùn)用Image J圖像處理軟件計(jì)算腦梗死體積百分比，即每層腦梗死面積×(層間距+層厚)/同一層全腦面積×(層間距+層厚)×100%。

1.4.4 TUNEL染色

采用20%烏拉坦對(duì)大鼠進(jìn)行深度麻醉，全麻后取仰臥位，開胸暴露心臟，于心尖剪一小口，將已消毒的灌胃針從心尖插至升主動(dòng)脈并用止血鉗夾閉灌胃針及心臟以便固定。于右心耳處剪一小口，釋放靜脈血，使用針筒向灌胃針中快速注入150 mL 0.9%氯化鈉溶液去除血液，再用150 mL 4%多聚甲醛溶液(pH值=7.3)進(jìn)行固定。當(dāng)大鼠處于四肢抽搐，明顯僵直狀態(tài)時(shí)，使用斷頭鍘，快速斷頭取全腦。全腦組織使用4%多聚甲醛浸泡，4℃冰箱保存24 h固定后，流水沖洗，切除嗅球，按4∶3∶3比例進(jìn)行切割，切割完畢放于70%乙醇溶液中浸泡過(guò)夜。次日將浸泡完畢組織置于包埋盒中，脫水后用石蠟包埋。從腦組織的冠狀位，進(jìn)行4 μm厚度切片。于約37℃溫水中進(jìn)行攤片，使用載玻片將切片撈起烘干。將制備完成的腦組織切片放于60℃環(huán)境中復(fù)溫30 min，再用二甲苯脫蠟后滴加蛋白酶K工作液，置于20-37℃的環(huán)境反應(yīng)15 min至30 min，再漂洗3次。各樣品滴加50 μL TUNEL檢測(cè)液進(jìn)行上樣，避光，37℃，反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后 3次洗滌。封片使用抗熒光淬滅封片液，鏡下觀察。藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，綠色熒光為凋亡細(xì)胞。每片隨機(jī)選取5個(gè)視野。使用Image-Pro-Plus(IPP)軟件計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞凋亡率=綠色熒光數(shù)/藍(lán)色熒光數(shù)×100%。

1.4.5 免疫組化

取材、包埋及切片制備同TUNEL染色。將樣本完全浸于抗原修復(fù)液中加熱煮沸10 min，待自然冷卻至室溫后漂洗3次，3 min/次。將樣本周圍多余液體拭去后，沿樣本周圍用免疫組化筆畫出隔水帶。樣本上滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷液，室溫下孵育10 min后漂洗3次。加GAP-43一抗(濃度1∶200)4℃孵育過(guò)夜，再滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，5 min/次。按所購(gòu)試劑盒說(shuō)明書配置DAB工作液并滴加到待測(cè)樣本上，室溫孵育1-5 min(具體反應(yīng)時(shí)間可在顯微鏡下觀察并進(jìn)行控制)，隨后用純水進(jìn)行洗滌。使用Mayer’s蘇木素對(duì)樣本復(fù)染10 min，再用純水沖洗，PBS反藍(lán)。將樣本脫水，樹膠封片，待干后置于鏡下進(jìn)行觀察、拍照。每個(gè)切片任意選取5個(gè)視野拍照，計(jì)算平均光密度，即視野中陽(yáng)性表達(dá)部位累積光密度/視野下樣品面積。

1.4.6 免疫熒光

取材、包埋及切片制備同TUNEL染色?？乖瓱嵝迯?fù)同免疫組化染色。將樣本置于硼氫化鈉溶液中室溫反應(yīng)30 min后自來(lái)水沖洗5 min，再將樣本放入75%乙醇溶液中浸泡1 min，最后將樣本置于蘇丹黑染液中室溫反應(yīng)15 min，隨后用自來(lái)水沖洗5 min。用濾紙擦去樣本周圍多余液體，并用免疫組化筆在玻片上的樣本周圍畫出隔水帶。在樣本上滴加山羊血清，室溫下封閉60 min后滴加GAP-43一抗(濃度1∶100)，4℃孵育過(guò)夜；滴加二抗，37℃孵育60 min后漂洗3次，采用含DAPI的抗熒光淬滅封片液進(jìn)行封片，待干后于熒光顯微鏡下觀測(cè)、拍照。

1.4.7 免疫印跡

《中國(guó)儲(chǔ)運(yùn)》創(chuàng)刊于1990年，經(jīng)國(guó)家新聞出版署批準(zhǔn)出版，面向海內(nèi)外公開發(fā)行，國(guó)內(nèi)統(tǒng)一刊號(hào)CN12-1204/F，郵發(fā)代號(hào)6-151。國(guó)際16開銅版彩印，月刊，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)刊號(hào)ISSN1005-0434，國(guó)外發(fā)行代號(hào)BM1821。

采用20%烏拉坦注射液按0.6 mL/100 g進(jìn)行腹腔注射麻醉后迅速斷頭取全腦，分離出左側(cè)海馬組織置于液氮中，存于-80℃冰箱中保存。取100 mg組織樣品放入800 μL按比例提前配置好的裂解液混合物相應(yīng)組別凍存管中并剪碎組織，將凍存管置于研磨儀中進(jìn)行研磨處理，超聲10 min，隨后于冰上靜置20 min使其充分裂解，4℃，14 000 r/min(r=6 cm)，離心20 min，取蛋白上清液按試劑盒說(shuō)明書配置BCA工作液檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，以1∶4的比例進(jìn)行上樣，7 500 r/min(r=6 cm)，離心5 min后置于100℃金屬浴鍋中，加熱10 min。按試劑盒說(shuō)明書配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，順序一抗孵育、二抗孵育。按試劑盒說(shuō)明書配置ECL，滴加于漂洗后的PVDF膜上避光反應(yīng)1 min，最后在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察、拍照。用Image Lab軟件進(jìn)行條帶分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 各組最終完成實(shí)驗(yàn)的大鼠情況

最終假手術(shù)組完成試驗(yàn)大鼠15只；模型組和艾灸組大鼠因造模時(shí)大出血死亡、麻醉不耐受死亡及造模不成功剔除，最終模型組完成實(shí)驗(yàn)13只，艾灸組13只。

2.2 通督調(diào)神灸對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響

造模清醒后2 h，假手術(shù)組未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分，模型組和通督調(diào)神灸組大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，其評(píng)分較假手術(shù)組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明造模成功。同時(shí)，模型組與通督調(diào)神灸組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示在干預(yù)前兩組大鼠的神經(jīng)功能缺損程度具有可比性。干預(yù)7 d后與模型組相比，通督調(diào)神灸組評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。提示通督調(diào)神灸可有效減輕MCAO大鼠的神經(jīng)功能缺損程度。

表1 各組大鼠Zea-longa評(píng)分 分

2.3 通督調(diào)神灸對(duì)MCAO大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

對(duì)3組大鼠干預(yù)第2-6天的逃避潛伏期進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，結(jié)果顯示，干預(yù)第2-6天，與其他兩組相比，假手術(shù)組的逃避潛伏期短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；通督調(diào)神灸組逃避潛伏期于干預(yù)第4-6天均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表2。對(duì)干預(yù)第7天各組大鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)進(jìn)行組間比較結(jié)果顯示，假手術(shù)組高于模型組和通督調(diào)神灸組，通督調(diào)神灸組高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。以上結(jié)果表明通督調(diào)神灸能夠有效改善MCAO大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

表2 各組大鼠逃避潛伏期 秒

表3 各組大鼠90 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù) 次

2.4 通督調(diào)神灸對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響

造模后24 h，與假手術(shù)組相比，模型組和通督調(diào)神灸組腦梗死體積明顯增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明造模成功；模型組與通督調(diào)神灸組兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可見兩組大鼠在干預(yù)前腦梗死體積具有可比性。干預(yù)7 d后，與模型組相比，通督調(diào)神灸組腦梗死體積縮小明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖1。表明通督調(diào)神灸能有效減小MCAO大鼠的腦梗死體積。

注:高信號(hào)白色區(qū)域?yàn)槿毖Ｋ涝?/p>

表4 各組大鼠的腦梗死體積百分比

2.5 通督調(diào)神灸對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

注:藍(lán)色熒光為正常神經(jīng)元,綠色熒光為凋亡神經(jīng)元(標(biāo)尺25 μm)

表5 各組神經(jīng)元凋亡率

2.6 通督調(diào)神灸對(duì)MCAO大鼠GAP-43的影響

采用免疫組化法對(duì)各組大鼠梗死側(cè)海馬區(qū)的GAP-43進(jìn)行半定量分析，以平均光密度值代表GAP-43水平高低。對(duì)各組大鼠平均光密度值進(jìn)行組間比較，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組和通督調(diào)神灸組的平均光密度值增加，而通督調(diào)神灸組較模型組更高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表6和圖3。大鼠梗死側(cè)海馬區(qū)的GAP-43免疫熒光染色結(jié)果可見，GAP-43主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，模型組和通督調(diào)神灸組的紅色熒光(GAP-43)強(qiáng)度均高于假手術(shù)組，且通督調(diào)神灸組的紅色熒光強(qiáng)度在所有組別中最高，GAP-43表達(dá)量最高，見圖4。以上免疫組化和免疫熒光結(jié)果表明通督調(diào)神灸干預(yù)能夠升高M(jìn)CAO大鼠梗死側(cè)海馬區(qū)的GAP-43水平。

注:陽(yáng)性染色結(jié)果為黃色或棕黃色

注:紅色熒光為GAP-43,藍(lán)色熒光為神經(jīng)元細(xì)胞(標(biāo)尺25 μm)

表6 各組大鼠GAP-43免疫組化平均光密度值

2.7 通督調(diào)神灸對(duì)MCAO大鼠Cofilin表達(dá)的影響

對(duì)各組大鼠左側(cè)海馬組織Cofilin蛋白表達(dá)量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，模型組和通督調(diào)神灸組較假手術(shù)組升高，通督調(diào)神灸組較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表7、圖5。以上結(jié)果表明通督調(diào)神灸可降低MCAO大鼠海馬中Cofilin表達(dá)量，說(shuō)明通督調(diào)神灸可促進(jìn)軸突再生可能與調(diào)控Cofilin有關(guān)。

圖5 各組大鼠海馬組織相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果

表7 各組大鼠Cofilin表達(dá)情況

3 討論

3.1 通督調(diào)神灸可減輕MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損，縮小腦梗死體積

通督調(diào)神理論是由全國(guó)名老中醫(yī)張道宗教授提出的，是通過(guò)通調(diào)督脈調(diào)治全身臟腑從而對(duì)疾病達(dá)到治療效果的學(xué)術(shù)思想[11]。通督調(diào)神灸是由通督調(diào)神理論延伸、發(fā)展而來(lái)，以艾灸督脈腧穴作為主要方式，對(duì)疾病進(jìn)行治療，在臨床治療中已被證實(shí)具有疏經(jīng)通絡(luò)、調(diào)神益氣、補(bǔ)髓健腦的作用[12]。本研究結(jié)果顯示，模型組和艾灸組大鼠經(jīng)MCAO造模后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損情況，同時(shí)micro-MRI圖像顯示MCAO造模后大鼠的左側(cè)皮層及海馬組織均出現(xiàn)大面積的缺血梗死灶且梗死體積相當(dāng)，表明MCAO大鼠均造模成功且梗死部位及梗死程度相當(dāng)，具有可比性。在經(jīng)過(guò)7 d的通督調(diào)神灸干預(yù)之后，艾灸組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，腦梗死體積顯著縮小，較模型組改善程度顯著?？梢?，通督調(diào)神灸可以有效改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能缺損及腦梗死的體積。艾灸可通過(guò)其燃燒物效應(yīng)、溫?zé)岽碳ば?yīng)、紅外光譜共振效應(yīng)等作用于人體腧穴從而產(chǎn)生治療效果。其中溫?zé)嵝?yīng)是艾灸產(chǎn)生療效的主要方式，艾灸的溫?zé)岽碳つ苁鎻埲梭w局部及深層的血管，趙寧俠等人的研究表明艾灸百會(huì)穴能增加人大腦中動(dòng)脈及后動(dòng)脈的血流動(dòng)力[13]。姚寶農(nóng)等[14]使用艾灸儀對(duì)中風(fēng)患者的百會(huì)穴進(jìn)行艾灸后發(fā)現(xiàn)，艾灸可明顯改善腦缺血病人的大腦血液循環(huán)，經(jīng)治療后其神經(jīng)功能缺損程度有了顯著改善，說(shuō)明通督調(diào)神灸可能是通過(guò)其溫?zé)嵝?yīng)改善MCAO大鼠腦血流情況以改善MCAO大鼠的腦梗死體積及神經(jīng)功能。此外，蔣潔等[15]的研究表明艾灸可有效減輕MCAO大鼠的神經(jīng)功能缺損，減小腦梗死體積，促進(jìn)神經(jīng)功能的康復(fù)，與本研究結(jié)果一致。

3.2 通督調(diào)神灸可改善MCAO大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

本研究發(fā)現(xiàn)，在通督調(diào)灸干預(yù)第4-6天后，與模型組相比，通督調(diào)灸組的逃避潛伏期明顯縮短，在通督調(diào)灸干預(yù)第7天后，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多，說(shuō)明通督調(diào)神灸干預(yù)后MCAO大鼠的學(xué)習(xí)記憶較模型組得到了更大程度的改善。由此可見，通督調(diào)神灸可以有效改善MCAO大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為卒中后學(xué)習(xí)記憶障礙本質(zhì)為臟腑氣血不足以致腦髓不充，或因痰濕、瘀血、肝陽(yáng)等上擾“元神”，使其受損而發(fā)病。督脈是匯聚全身精、神、氣，并交通心腎、統(tǒng)帥經(jīng)絡(luò)而循行入腦的一條經(jīng)脈，百會(huì)穴是督脈中最常用于健腦清竅的穴位[16]。艾灸可加強(qiáng)局部刺激，利于激活穴位精氣，故當(dāng)艾灸作用于百會(huì)穴后可達(dá)到溫通經(jīng)絡(luò)、化瘀散結(jié)、通調(diào)髓海之功效，從而改善學(xué)習(xí)記憶功能[17]。

3.3 通督調(diào)神灸可抑制MCAO大鼠神經(jīng)元凋亡，抑制Cofilin活性，促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生

卒中發(fā)生后，梗死區(qū)域的腦組織神經(jīng)元受到損害后，梗死核心區(qū)的神經(jīng)元會(huì)立即發(fā)生細(xì)胞壞死，而缺血半暗帶的神經(jīng)元會(huì)延遲數(shù)小時(shí)或數(shù)天后才開始出現(xiàn)凋亡。而細(xì)胞凋亡可以通過(guò)一些治療手段的抑制而被逆轉(zhuǎn)，因此，及時(shí)挽救缺血半暗帶受損神經(jīng)元，抑制其細(xì)胞凋亡可減少缺血缺氧對(duì)于神經(jīng)元的損害，對(duì)改善腦卒中患者的神經(jīng)功能和預(yù)后尤為重要[18，19]。同時(shí)，腦缺血缺氧發(fā)生后，缺血半暗帶的受損神經(jīng)元會(huì)離斷成兩部分，包括與胞體相連的近端殘端及遠(yuǎn)離胞體的遠(yuǎn)端殘端，近端殘端軸突可通過(guò)發(fā)芽再生后朝著遠(yuǎn)端軸突方向生長(zhǎng)，進(jìn)而與附近神經(jīng)元重新建立連接[20]。相關(guān)研究顯示，Cofilin是海馬神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的必要條件之一，學(xué)習(xí)記憶功能的產(chǎn)生和維持依賴于肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)組裝及Cofilin磷酸化水平的增加[21，22]。相關(guān)研究顯示，抑制Cofilin的活性可減少M(fèi)CAO大鼠缺血半暗帶Cofilin的線粒體易位，從而抑制腦缺血引起的神經(jīng)元凋亡[23]。

GAP-43神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)是一種軸突相關(guān)蛋白，在神經(jīng)元生長(zhǎng)及突觸形成過(guò)程中高度表達(dá)，它能夠促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生、維持突觸可塑性并調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)信號(hào)的傳遞功能，是軸突再生的典型特征，并可作為反應(yīng)神經(jīng)生長(zhǎng)狀況的分子標(biāo)志物[24，25]。GAP-43的表達(dá)水平在正常情況下很低，在腦缺血發(fā)生后，梗死區(qū)域存活的受損神經(jīng)元由于負(fù)反饋機(jī)制出現(xiàn)反應(yīng)性軸突再生，使得GAP-43表達(dá)水平升高；隨著缺血缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，受損神經(jīng)元的損傷情況加重并出現(xiàn)凋亡，反應(yīng)性軸突再生減弱，GAP-43表達(dá)水平便開始逐漸下降[26]。而相關(guān)研究顯示，缺乏GAP-43會(huì)限制小鼠神經(jīng)元軸突再生，使其腦組織無(wú)法重建，導(dǎo)致突觸功能喪失，進(jìn)而出現(xiàn)認(rèn)知功能受損[27]。本研究結(jié)果顯示，MCAO造模后的大鼠神經(jīng)元凋亡率明顯高于假手術(shù)組大鼠，且造模后的大鼠梗死側(cè)海馬GAP-43、Cofilin表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致大鼠腦部梗死灶神經(jīng)元出現(xiàn)大量凋亡，同時(shí)在腦缺血發(fā)生后，梗死區(qū)域神經(jīng)元出現(xiàn)了一定程度上的反應(yīng)性軸突再生，神經(jīng)元中的Cofilin被大量激活，這不僅會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)錐崩塌，當(dāng)其進(jìn)入線粒體后還會(huì)促使存活的受損神經(jīng)元啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，引起神經(jīng)元大量凋亡，反應(yīng)性軸突再生出現(xiàn)減弱。通督調(diào)神灸干預(yù)后大鼠的腦梗死區(qū)域神經(jīng)元凋亡率與模型組相比出現(xiàn)明顯的降低，梗死側(cè)海馬GAP-43表達(dá)水平升高，Cofilin表達(dá)水平降低?？梢姡ǘ秸{(diào)神灸確可改善MCAO大鼠的腦梗死區(qū)域神經(jīng)元凋亡，抑制Cofilin活性從而促進(jìn)軸突再生，進(jìn)而改善MCAO大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

總之，通督調(diào)神灸干預(yù)可改善MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損情況，減少腦梗死體積，抑制腦梗死區(qū)域神經(jīng)元凋亡，同時(shí)抑制Cofilin表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶功能康復(fù)。但通督調(diào)神灸通過(guò)哪些途徑影響Cofilin表達(dá)與軸突再生還有待進(jìn)一步研究。