劉東，張莉，許金鳳，萬彥，吳嬌嬌，夏佳，楊雨，敖慧

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137 )

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種由遺傳背景與環(huán)境因素相互作用而導(dǎo)致的慢性炎癥性疾病，表現(xiàn)為結(jié)直腸黏膜的持續(xù)性炎癥反應(yīng)，病變呈連續(xù)性，臨床以反復(fù)發(fā)作和緩解交替為特點。近年來，我國潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率和患病率呈快速上升趨勢，已成為臨床常見病[1]。根據(jù)UC臨床特點，中醫(yī)上多將之歸屬于“久痢”“腸澼”“泄瀉”“便血”等，本病以“本虛標(biāo)實”為特點，脾虛為導(dǎo)致UC的主要因素之一，《諸病源候論》記載：“虛損不復(fù)，遂連滯涉引歲月，則為久痢也?！贝似诒孀C多為虛實夾雜，以虛為主，健脾補(bǔ)腎兼除濕導(dǎo)滯為其治療大法，“四季脾旺不受邪”，說明健脾為其正治，臨床多選用參苓白術(shù)丸、補(bǔ)中益氣湯、附子理中丸等加減治療[2]。白術(shù)(BZ)常配伍人參(RS)治療UC[3]。但在臨床實踐中黨參(DS)代替人參配伍白術(shù)在治療脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎中使用頻率亦較高。但黨參是否能代替人參與白術(shù)配伍治療UC尚無定論。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析和數(shù)據(jù)處理等技術(shù)，通過“藥物-成分-靶點-疾病”之間多層次、多角度的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，預(yù)測藥物可能的作用機(jī)制，適合中醫(yī)復(fù)方研究。本文首次通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對人參和黨參配伍白術(shù)在治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制進(jìn)行對比研究，旨在探討其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制異同，為臨床使用黨參替代人參治療潰瘍性結(jié)腸炎提供參考。

1 方法

1.1 藥物成分靶點篩選

通過YaTCM數(shù)據(jù)庫分別篩選人參、黨參、白術(shù)含有的化合物。YaTCM數(shù)據(jù)庫包含6 220種草藥、47 696種天然化合物、18 697種靶標(biāo)，從中可以獲取不包含在TCMSP、ETCM、SYMMAP里的草藥的信息。該數(shù)據(jù)庫的復(fù)方-草藥、草藥-成分信息來源于多個方面，包括數(shù)據(jù)庫，如TCMID、TCMSP、TCM@Taiwan，書籍和文本挖掘。OB通過YATCM系統(tǒng)提供算法得到，此算法設(shè)定OB大于80為高吸收，小于20為低吸收，以DL≥0.18，OB≥80為條件篩選有效化合物。通過Pubchem數(shù)據(jù)庫查找有效化合物結(jié)構(gòu)，然后用Swisstargetpredition預(yù)測靶點，以預(yù)測靶點P≥0.1為篩選條件，得到藥物潛在靶點數(shù)據(jù)庫。

1.2 疾病靶點篩選

以“ulcerative colitis”為檢索詞在Gene Cards數(shù)據(jù)庫(https//www.genecards.org/)、Drug Bank數(shù)據(jù)庫(https//www.drugbank.ca/)、Disgenet數(shù)據(jù)庫中(https//www.disgenet.org/)以Score=1為篩選條件查找各個數(shù)據(jù)庫中疾病相關(guān)靶點并刪除重復(fù)項，得到UC靶點數(shù)據(jù)庫。

1.3 藥物、疾病交集靶點

將黨參與白術(shù)潛在靶點數(shù)據(jù)庫合并，去除重復(fù)靶點得到黨參-白術(shù)潛在靶點合集，同法得到人參-白術(shù)潛在靶點合集。將上述合集靶點分別與UC靶點通過在線軟件 Venny 2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)取交集，分別得到人參配伍白術(shù)與UC(下文以RS組表示)的交集靶點、黨參配伍白術(shù)與UC(下文以DS組表示)的交集靶點，繪制韋恩圖。并計算兩組共有靶點在RS組中的占比，即為黨參替代人參的可替代比。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)

將1.3得到的交集靶點分別導(dǎo)入STRING平臺(https：//string-db.org/)，物種設(shè)置為 “Homo sapiens”，置信度設(shè)置為0.4，獲得靶標(biāo)的相互作用關(guān)系，以TSV格式保存，導(dǎo)入 Cytoscape 3.8.2軟件，分別構(gòu)建RS組和DS組蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 富集分析

將1.4得到的兩組交集靶點導(dǎo)入到Metascape(http：//metascape.org/)數(shù)據(jù)庫中，選擇Multiple Gene List選項，物種選擇“homo sapiens”，點擊Costom Analysis進(jìn)入下一步。在Enrichment頁面設(shè)置P≤0.05，勾選GO Biological Processes選項進(jìn)行基因本體論(gene ontology，GO)生物學(xué)過程分析；勾選KEGG Passway選項進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析。得到GO分析結(jié)果和KEGG富集結(jié)果。

1.6 通路-靶點-成分-藥物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.8.2軟件對1.5中得到的關(guān)鍵通路分別繪制通路-靶點-成分-藥物網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分、預(yù)測靶點

人參得到92種化合物，主要包括人參皂苷類、甾醇類、有機(jī)酸及酯類化合物，去重后得到729個靶點。黨參得到51種化合物，主要包括甾醇類、有機(jī)酸及酯類、還有部分三萜類化合物，去重后得到461個靶點。白術(shù)得到17種化合物，主要是酯類，去重后得到393個靶點。其中人參和黨參共有的成分有13種主要包括豆甾醇、灌木遠(yuǎn)志酮 A、有機(jī)酸及其酯類化合物。藥物成分見表1，其中*G代表人參和黨參共有成分。

表1 藥物成分表

2.2 疾病靶點

在Gene Cards數(shù)據(jù)庫得到179個靶點，在Drug Bank數(shù)據(jù)庫得到70個靶點，在Disgenet數(shù)據(jù)庫中符合篩選條件的靶點有380個，合并去重后得到553個疾病相關(guān)靶點。

2.3 藥物、疾病交集靶點

利用Venny 2.1.0繪制韋恩圖，其中RS組的交集靶點有93個(圖1A)，DS組的交集靶點有76個(圖1B)。比較發(fā)現(xiàn)，DS組能夠替代RS組的靶點，即共有靶點有70個，其可替代比約為75%。RS組特有靶點23個，DS組特有靶點6個，具體靶點見表2。

注:A為人參-白術(shù)與潰瘍性結(jié)腸炎(即RS組)交集靶點;B為黨參-白術(shù)與潰瘍性結(jié)腸炎(即DS組)交集靶點;BZ為白術(shù)簡稱

表2 人參-白術(shù)、黨參-白術(shù)與潰瘍性結(jié)腸炎交集靶點

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)

為了進(jìn)一步研究兩組藥對治療UC的作用機(jī)制，將RS組的93個交集靶點和DS組的76個交集靶點分別導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，并利用Cytoscape 3.8.2進(jìn)行可視化處理，節(jié)點連接度越大表明其在PPI網(wǎng)絡(luò)中越重要，連接度越大，節(jié)點顏色越深大小越大(圖2A，2B)。RS組網(wǎng)絡(luò)包含92個節(jié)點和925條邊，DS組網(wǎng)絡(luò)包含75個節(jié)點和607條邊。以degree值的中位數(shù)進(jìn)行3次篩選，RS組得到13個靶點，DS組得到10個靶點(見表3)，兩組共有靶點包括TNF、AKT1、VEGFA、STAT3、ESR1、CCND1、PPARG、MMP9、PTGS2，這些靶點可能是兩組藥對治療潰瘍性結(jié)腸炎的核心靶點。其中RS組網(wǎng)絡(luò)特有靶點四個，是IL6、TLR4、TP53、HRAS。而DS組網(wǎng)絡(luò)只有ERBB2是特有靶點。

注:A為RS組PPI網(wǎng);B為 DS組PPI網(wǎng)絡(luò)

表3 RS組和DS組PPI高連接度基因(3倍中位數(shù))

2.5 富集分析結(jié)果

由Metascape軟件分析得到KEGG和GO富集結(jié)果。去除不同表達(dá)的同一個KEGG通路,RS組富集得到147條KEGG通路(P<0.05),特有通路12條,包括氧化磷酸化(LogP=-1.8)、溶酶體(LogP=-2.1)、吞噬體(LogP=-1.8)等通路;DS組富集得到136條KEGG通路(P<0.05),特有通路1條為醛固酮的合成與分泌(LogP=-2.6),兩組共有通路135條,其可替代比約為92%。將所有KEGG歸類,兩組前20條通路中有19條相同,這可能是黨參替代人參發(fā)揮作用的機(jī)制,并作heatmap圖(圖3)。KEGG結(jié)果表明兩者都主要通過細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路對UC起作用。

圖3 RS組和DS組KEGG heatmap圖

RS組富集得到1 515條生物學(xué)過程(P<0.05),DS組富集得到1 224條生物學(xué)過程(P<0.05),其中兩組共有生物學(xué)過程1 196條,可替代比約為79%。兩組均可將所有BP條目歸為23類,發(fā)現(xiàn)兩組前20條具有代表性的BP條目皆相同,并作heatmap圖(圖4)。二者主要通過蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、激素水平的調(diào)節(jié)和對肽的反應(yīng)等生物學(xué)過程對UC發(fā)揮治療作用。

圖4 RS組和DS組GO生物學(xué)過程heatmap圖

A.RS組的細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路的網(wǎng)絡(luò)圖 B.DS組細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路的網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 通路-靶點-成分-藥物網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape軟件對2.5中得到RS組和DS組的細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用繪制通路-靶點-成分-藥物網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)。圖4A和4B分別是RS組和DS組的細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路的網(wǎng)絡(luò)圖,在此通路DS組和RS組中白術(shù)的物質(zhì)基礎(chǔ)相同,主要為雙白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)三醇,黨參主要通過甾醇類、黃酮類等化合物發(fā)揮作用,人參主要通過人參皂苷等發(fā)揮作用。RS組在這條通路上富集到了13個基因,DS組富集到了11個基因,其中有10個基因共同出現(xiàn),分別是CCR1、FLT3、IL2、KIT、MET、PDGFRB、TGFBR1、TGFBR2、TNF和VEGFA,其可替代比約為77%。

3 討論

參苓白術(shù)散、四君子湯等為治療脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎的常用方劑，人參、黨參和白術(shù)都是補(bǔ)脾益氣的常用藥物。在古籍中參苓白術(shù)散、四君子湯等常用人參配伍白術(shù)，而現(xiàn)代醫(yī)家多用黨參配伍白術(shù)代替人參治療UC[3]。關(guān)于黨參代替人參使用的研究目前較少，因此，本文首次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究黨參替代人參配伍白術(shù)治療潰瘍性結(jié)腸炎的可行性。

UC發(fā)病機(jī)制與結(jié)腸上皮細(xì)胞、黏膜屏障和上皮屏障缺陷有關(guān)[4，5]。免疫功能異常是導(dǎo)致UC的重要因素，涉及先天性免疫和適應(yīng)性免疫，包括多種免疫細(xì)胞(如抗原呈遞細(xì)胞、多種T細(xì)胞等)和多條信號通路(cytokine-cytokine receptor interaction、NF-κB、MAPK信號通路等)，這些免疫細(xì)胞和信號通路的激活產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子(如炎性因子、免疫因子、趨化因子等)，從而加劇腸道炎癥反應(yīng)[6-8]。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選得到人參、黨參、白術(shù)三者有效成分、潛在作用靶點，將黨參和人參分別與白術(shù)配伍，然后與UC作用靶點取交集，分別得到RS組和DS組的交集靶點。兩組交集靶點分別做PPI分析和富集分析，對富集得到的核心通路繪制通路-靶點-處方-藥物網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)而從多方面比較黨參能否替代人參發(fā)揮治療作用。

通過對PPI結(jié)果分析比較，發(fā)現(xiàn)兩組藥對共有的核心靶點是腫瘤壞死因子(TNF)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)和血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)。TNF作為細(xì)胞因子家族中的關(guān)鍵促炎因子，與UC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸有密切關(guān)系[9]。TNF可誘導(dǎo)腸屏障抵抗力顯著降低，固有層產(chǎn)生的TNF可導(dǎo)致UC特有的屏障缺陷[8]。AKT1是3種密切相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1、AKT2和AKT3)之一，稱為AKT激酶，可調(diào)節(jié)許多過程，包括代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長和血管生成，AKT是PI3K下游信號通路的關(guān)鍵蛋白，研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 信號通路參與促炎細(xì)胞因子如 TNF-α的調(diào)節(jié)和釋放，并在UC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10]。朱銳等[9]通過奧曲肽治療UC模型大鼠發(fā)現(xiàn)AKT1表達(dá)明顯下降。STAT3通過調(diào)節(jié)幼稚 CD4+T 細(xì)胞向 T 輔助 Th17 或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的分化，作為炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠降低VEGFA基因的表達(dá)從而減輕UC小鼠的癥狀[11]。上述靶點在UC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。上述靶點可能是臨床上黨參代替白術(shù)發(fā)揮治療作用的靶點。此外，人參與黨參相比，具有更強(qiáng)的藥效，本研究發(fā)現(xiàn)RS組特有的靶點包括白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤細(xì)胞抗原p53(TP53)與UC聯(lián)系緊密。其中IL-6是一種促炎細(xì)胞因子，小鼠模型顯示，IL-6通過激活STAT3刺激腸上皮細(xì)胞的激活、增殖和向癌癥發(fā)展[12]。P53 腫瘤抑制蛋白是調(diào)節(jié)基因組完整性、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子之一，有研究發(fā)現(xiàn)p53 的突變可能是進(jìn)展性UC的早期生物標(biāo)志物[13]。這些靶點可能是人參-白術(shù)藥對特有的作用機(jī)制。而酪氨酸激酶受體2(ERBB2)是DS組特有的靶點，ERBB2是表皮生長因子受體(EGFR)家族成員之一，研究表明ErbB2通過促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞存活，在損傷后的結(jié)腸上皮中具有重要的細(xì)胞保護(hù)和修復(fù)作用[14]。對ERBB2靶點的調(diào)節(jié)可能是黨參-白術(shù)藥對治療UC的特有作用機(jī)制。

通過對KEGG過程分析比較發(fā)現(xiàn)，兩組共同通過細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)信號通路對UC起主要治療作用。細(xì)胞因子是炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，通過與靶細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合來誘導(dǎo)反應(yīng)。UC 的免疫反應(yīng)和炎癥通路表明，細(xì)胞因子與其受體的相互作用是導(dǎo)致組織損傷的因素之一，其中促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6、IL-9、IL-13和IL-33在上調(diào)中起重要作用，而抗炎細(xì)胞因子(TGF-β、IL-10 和 IL-37)在疾病進(jìn)展的下調(diào)中起重要作用[15]。此外，本研究表明RS組還可以通過氧化磷酸化、溶酶體和吞噬體通路對UC發(fā)揮作用。吞噬細(xì)胞表面的特異性受體識別顆粒表面的配體時，就會形成吞噬體，吞噬體通過與循環(huán)內(nèi)體、晚期內(nèi)體和溶酶體相互作用獲得消化特征，溶酶體通過包括內(nèi)吞作用、吞噬作用和自噬在內(nèi)的一系列過程獲得消化物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)慢性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中分離的LPM溶酶體數(shù)量和活性明顯減少，促炎細(xì)胞因子水平升高，抗炎細(xì)胞因子水平降低[16]。兩組藥對共同通過蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、激素水平的調(diào)節(jié)和對肽的反應(yīng)等生物學(xué)過程對UC發(fā)揮治療作用。對以上KEGG信號通路和GO生物學(xué)過程的調(diào)控，可能是黨參代替白術(shù)治療UC的共有機(jī)制。

通過比較RS組和DS組的細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號通路發(fā)現(xiàn)，黨參主要通過甾醇類、黃酮類和三萜類等化合物對UC發(fā)揮治療作用，而人參主要通過人參皂苷發(fā)揮作用。其物質(zhì)基礎(chǔ)存在較大差異，但兩者在藥效發(fā)揮方面較為類似。有臨床研究表明在部分慢性輕證如慢性潰瘍，以及在補(bǔ)益劑如四君子湯中可以用黨參代替人參[17，18]。動物實驗發(fā)現(xiàn)人參能夠治療脾虛大鼠，可以提高脾臟免疫功能，黨參功同人參而力弱[19]。這些結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果類似，即，黨參治療UC的作用機(jī)制與人參相似，初步研究表明人參有大于75%的機(jī)制可以在黨參中發(fā)現(xiàn)，這佐證了黨參作用弱于人參，也可以為臨床上黨參替代人參治療UC提供了一定科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從成分-靶點-通路多方面進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，雖然人參和黨參配伍白術(shù)后治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用成分雖然不同，但是發(fā)揮治療作用的核心靶點、關(guān)鍵通路和生物學(xué)過程相似。本研究為臨床上常用黨參代替人參與白術(shù)配伍治療潰瘍性結(jié)腸炎提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

4 利益沖突

所有作者均聲明不存在利益沖突。