樊錦雅，李瑞蘭，鐘世紅，古銳▲

(1.成都中醫(yī)藥大學 藥學院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學 民族醫(yī)藥學院，四川 成都 611137；3.西南民族大學 藥學院，四川 成都 610041)

藏藥“龍膽花”來源于龍膽科Gentianaceae龍膽屬Gentiana多種龍膽植物不含基生葉的帶花地上部分，9月花盛開時采收，曬干使用，主要分布于西藏、四川、青海、甘肅等地，具有解毒及治療各種熱癥、喉炎熱閉的功效，屬于藏藥“榜間”大類的一種?！鞍耖g”始載于8世紀中期的《月王藥診》[1]，藏醫(yī)藥文獻常采用“分類式”的形式來記載“榜間”：如《晶珠本草》[2]記載，榜間根據顏色分為白花、藍花、黑(青)花3種，分別稱為“榜間嘎?！薄鞍耖g完?！焙汀鞍耖g那?！?。但藥材市場上常根據花色將其稱為“藍花龍膽”(亦簡稱“龍膽花”)和“白花龍膽”兩類藏藥材?！褒埬懟ā迸c“白花龍膽”在臨床用法、功效上相似，常用于治療支氣管炎、肺炎等疾病。由于“白花龍膽”資源量少、市場價格較高，因此“龍膽花”常作為“白花龍膽”的替代品使用，在市場上供應量大、企業(yè)使用較多。

目前龍膽花的市場使用品種混亂，臨床上混用、誤用等問題突出，質量標準不規(guī)范，無法對用藥提供有效幫助。因此本研究基于對龍膽花野生資源與市場使用品種調查、實際應用功效分析，并與現有質量標準進行對比，提出修改意見。根據《中國藥典》2020年版中相關規(guī)定[3]對“龍膽花”主流品種進行顯微法、薄層色譜法定性鑒別，對其水分、灰分、浸出物等進行檢查、并對“龍膽花”環(huán)烯醚萜類成分和黃酮類成分進行含量測定和限度制定，以期為“龍膽花”的質量標準提升提供數據支撐和有效參考。

1 材料

1.1 實驗藥材

本次研究所用“龍膽花”藥材來源于四川、青海、甘肅和西藏地區(qū)，包括自采藥材，藏醫(yī)院、藏藥廠、藏藥市場收集藥材共43批，其中自采藥材22批，收集的藥材21批。所有樣品均由重慶中藥研究所秦松榮研究員、張植瑋助理研究員、成都中醫(yī)藥大學古銳教授鑒定為藍玉簪龍膽G.veitchiorumHemsl.、線葉龍膽G.farreriBalf.f.、華麗龍膽G.sino-ornataBalf.f.、青藏龍膽G.futtereriDiels et Gilg。藥材產地與批次見表1。

表1 龍膽花樣品產地與批次

1.2 試劑與藥物

馬錢苷酸對照品(批號:PS012095,純度≥98.5%)、龍膽苦苷對照品(批號:PS010423,純度≥99%)、異葒草苷對照品(批號:PS011444,純度≥98.5%)均購自成都普思生物科技股份有限公司；硅膠GF254薄層板購自青島海洋化工廠；分析純甲醇、諾爾施HPLC級磷酸均購自成都市科隆化學品有限公司；色譜純甲醇購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；水為超純水。

1.3 實驗儀器

島津2030(C)型高效液相(日本島津制作公司)；FA1004電子天平(十萬分之一，上海良平儀器儀表有限公司)；BSA124S電子天平(萬分之一，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；SB-52000型超聲波清洗器(寧波新藝超聲設備有限公司)；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱(鞏義市予華儀器有限責任公司)；8-10型箱式電阻爐(中國沈陽市節(jié)能電爐廠制造)；ΜLUP-1-10T型超純水機(成都優(yōu)普超純水科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1 鑒別

2.1.1 性狀鑒別

對龍膽花4個品種共43批藥材性狀進行研究。結果表明不同基原的龍膽花藥材的性狀差異較小，無明顯區(qū)別點，因此在4個品種的性狀鑒別上不做區(qū)分。鑒別結果顯示本品呈長條形，略扭曲，長5-15 cm，莖類圓形，斷面中空；莖生葉多于基部愈合，向上漸密，矩圓狀披針形或線狀披針形；花多頂生，基部包圍于上部葉叢中，無花梗；花萼筒形，萼筒常帶紫紅色，花絲淡藍色；花多皺縮呈鐘狀，濕展后，萼鐘狀，頂端5裂，萼齒線形，花冠倒錐狀圓筒形，上部深藍色或亮藍色，下部黃綠色，具深藍色條紋和斑點，斑點少見或無，長5-6 cm；雄蕊5枚，棕黃色或黃白色，著生于冠筒中部，整齊，花藥狹矩圓形；花柱線形，子房披針形，柱頭兩裂。氣清香，味苦?！褒埬懟ā彼幉膱D見圖1。

圖1 “龍膽花”藥材圖

2.1.2 顯微鑒別

取龍膽花4個基原品種藥材粉末(4號篩)(水合氯醛透化，稀甘油裝片)在顯微鏡下觀察。結果表明4個品種在顯微特征方面無顯著差異，不能作為品種間的鑒別要點，故建立“龍膽花”顯微鑒別，不做各品種間顯微特征區(qū)別。鑒別結果如下：本品粉末草綠色或黃綠色；葉表皮細胞類長方形，垂周壁呈波狀彎曲，連珠狀增厚，具角質線紋，氣孔不定式，副衛(wèi)細胞3-6個?；ò晁槠媳砥ぜ毎嗜橥粻?，具有細密的角質層紋理和油滴；下表皮細胞垂周壁呈淺波狀彎曲，彎曲處突出呈脊，脊呈研棒狀。纖維眾多成束，偶見零散分布。柱頭及花柱上部表皮細胞分化成圓錐形的單細胞毛，先端較尖或稍鈍。薄壁細胞多見細小的草酸鈣柱晶，偶見方晶?；ǚ哿ｉ冱S色，呈類球形、橢圓形、鈍三角形，直徑25-42.5 μm，表面光滑，偶見外壁具細刺狀突起，萌發(fā)孔3個；螺紋導管，直徑7.5-12.5 μm。龍膽花藥材粉末的顯微鑒別圖見圖2。

注:1-葉表皮細胞;2-呈連珠狀增厚的表皮細胞;3-花柱碎片;4-含草酸鈣結晶的薄壁細胞;5-纖維束;6a-花瓣碎片上表皮細胞;6b-花瓣碎片下表皮細胞;7-螺紋導管;8-花粉粒

2.1.3 薄層色譜鑒別

取龍膽花粉末1 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取對照藥材粉末1 g，同法制成對照藥材溶液。另取馬錢苷酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液4 μL，對照品溶液3 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(7∶1∶1∶0.4)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點(圖3)。

注:S為馬錢苷酸;DZYC為“龍膽花”對照藥材;LYZ1-QZ5為不同品種不同批次供試品

2.2 檢查項

按照《中國藥典》2020年版四部通則，對水分(通則0832下烘干法)、總灰分(通則2302)、酸不溶性灰分(通則2302)、浸出物(通則2201)進行檢查?；跍y定結果，考慮到藥材來源的差異，各取其平均值上浮20%，最終初步擬定龍膽花藥材水分不得過11.0%，總灰分不得過5.0%，酸不溶性灰分不得過1.50%，浸出物不得少于25.0%。具體結果見表2。

表2 龍膽花樣品各批次水分、灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量測定結果 n=2，%

2.3 含量測定

根據課題組前期建立的龍膽花“一測多評”法測定“龍膽花”中環(huán)烯醚萜類和黃酮類成分的含量[4]。

2.3.1 對照品溶液的制備

精密稱取龍膽苦苷對照品、異葒草苷對照品，加甲醇制成每1 mL含龍膽苦苷0.256 2 mg、異葒草苷0.324 6 mg的混合對照品，于4℃冰箱避光保存，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備

取本品粉末(過3號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率50 Hz)，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為InertsilODS-3(5 μm,4.6×250 mm,柱號:5020-01732),流動相為0.2%磷酸水溶液(A相),甲醇(B相),梯度洗脫:0-5 min,20%-24%甲醇;5-42 min,24%-37%甲醇;4-52 min,37%-38%甲醇;52-62 min,38%-40%甲醇;62-72 min,40%-20%甲醇。體積流量1.0 mL/min;進樣量10 μL;檢測波長240 nm;柱溫30℃。

2.3.4 樣品含量測定

基于課題組前期制定的一測多評(QAMS)方法對樣品含量進行計算分析[4]，相對保留時間及校正因子見表3、表4，計算7種成分的相對保留時間進行峰定位，再以龍膽苦苷的峰面積為對照，分別乘以校正因子，計算龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷的含量；以異葒草苷的峰面積為對照，分別乘以校正因子，計算異葒草苷、異金雀花素苷、異金雀花素的含量。

表3 環(huán)烯醚萜類的相對保留時間及相對校正因子

表4 黃酮類的相對保留時間及相對校正因子

計算結果顯示，39批龍膽花樣品中，環(huán)烯醚萜類成分(馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷)含量為2.18%-8.48%，黃酮類成分(異葒草苷、異金雀花素-2"-O-吡喃葡萄糖苷、異金雀花素)含量為0.38%-2.00%?？紤]到質量標準制定的適用性和藥材來源的差異性，本研究擬基于測定結果，各取其平均值上浮20%，初步擬定本品含環(huán)烯醚萜類成分[龍膽苦苷(C17H26O4)、馬錢苷酸(C16H24O10)、獐牙菜苦苷(C16H22O10)、獐牙菜苷(C16H22O9)]的總量不得少于3.00%；含黃酮苷類成分[異葒草苷(C21H20O11)、異金雀花素-2"-O-吡喃葡萄糖苷(C28H32O16)、異金雀花素(C22H22O11)]的總量不得少于0.50%。具體結果見表5。色譜圖見圖4。

注:1-龍膽苦苷對照品;2-異葒草苷對照品;A-混合對照品;B-“龍膽花”供試品

表5 QAMS法測得39批“龍膽花”中環(huán)烯醚萜類和黃酮類的含量 n=2,%

3 討論

3.1 定性和定量分析指標的選擇

據課題組前期對“龍膽花”主流品種進行化學成分分離鑒定的結果，龍膽花主要含環(huán)烯醚萜苷和黃酮苷類化合物，具抗炎鎮(zhèn)痛、止咳平喘等功效，“龍膽花”化學成分主要包括以馬錢苷酸[5，6](抗炎、抗菌)、龍膽苦苷[7](有抑制炎癥反應、抗氧化應激、抗纖維化、抗細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖等藥理作用)等為主的環(huán)烯醚萜類成分和以異葒草苷[8](抗氧化、抑制炎癥發(fā)展、改善胰島素抵抗、弱化肝纖維化發(fā)展以及誘導肝癌細胞凋亡等藥理作用)、異金雀花素等為代表的黃酮類成分，現代藥理研究表明這些化合物均為龍膽花的主要有效成分。

《中國藥典》2020年版一部中收載的同科同屬植物“龍膽”藥材以龍膽苦苷為對照品進行薄層鑒別和含量測定，但通過課題組前期采用HPLC指紋圖譜法和對不同產地、不同品種的52批龍膽花樣品化學成分差異的研究，發(fā)現龍膽苦苷在少部分樣品中檢測不到，無法對部分龍膽花品種起到完全有效的鑒別，而馬錢苷酸在所有檢測樣品中均可檢測到，后在含量測定中也得到了同樣的結果。因此薄層鑒別選擇馬錢苷酸為定性指標，總環(huán)烯醚萜和總黃酮為含量定量指標。

3.2 薄層鑒別條件的選擇與考察

本研究選擇馬錢苷酸進行薄層鑒別，并考察了不同展開系統(tǒng)、不同點樣量(2、4、6、8、10 μL)、不同顯色條件(254 nm、可見光)，結果表明以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(7∶1∶1∶0.4)為展開劑，供試品溶液4 μL、對照品溶液3 μL時，樣品中的馬錢苷酸能得到良好的分離。耐用性考察(溫度4℃、25℃、35℃；濕度32%、47%、65%、88%)結果表明該條件下馬錢苷酸均能得到很好的分離，說明該TLC鑒別方法可行。

3.3 浸出物測定條件的考察

本研究參照《中國藥典》2020年版對龍膽花浸出條件進行了考察，考察了冷浸法和熱浸法，以及浸出溶劑(水，25%、50%、75%、100%乙醇)，結果表明，以水熱浸時浸出效果最好，浸出率最高。最終選擇水熱浸法作為浸出物的測定條件。

3.4 含量測定指標成分的選擇和結果分析

本研究通過對龍膽花7種有效成分含量測定發(fā)現，不同品種間及同品種不同產地間的龍膽花樣品中各成分平均含量差異較大，其中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和異金雀花素在部分樣品中含量很低或沒有，例如4個品種均有不含異金雀花素的批次，并且大多為四川省內的自采樣品，這可能與樣品的生長環(huán)境、海拔、生長年限和采收時間等因素有關，也表明龍膽花在不同成分的含量上可能具有產地優(yōu)勢；此外，4個品種在不同化學成分含量上雖有差異但未表現出明顯的趨勢，表明本研究以環(huán)烯醚萜總量和黃酮總量作為龍膽花含量測定限度指標的可行性和合理性，不同化學成分的含量差異可為龍膽花的優(yōu)劣評價和龍膽花的不同產地的化學成分研究提供相關參考。

3.5 基于品種使用現狀、資源現狀的藥材名稱、基原品種、藥用部位修改建議

3.5.1 藥材名稱的修訂建議

本次研究發(fā)現，在近些年的市場實際應用中該藥材的藥材名、基原品種、藥用部位均與標準存在較大出入。藏醫(yī)藥文獻常采用“分類式”的形式來記載“榜間”，如《晶珠本草》[2]中“榜間”根據顏色分為白花、藍花、黑(青)花3種，分別稱為“榜間嘎保”“榜間莪?！焙汀鞍耖g那保”；《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·藏藥(第一冊)》(后簡寫為《部頒藏標》)因此收載“榜間那?！?，漢文名為“青藏龍膽”?！端拇ㄊ≈兴幉臉藴省穂9](2010年版)收載藍玉簪龍膽G.veitchiorumHemsl，根據花色，命名為“藍花龍膽”，藏語漢譯音為“榜間莪?！?藍花榜間)。品種整理表明[10]，因對花色深淺的主觀認識不同，藏醫(yī)對于“藍花”“黑花”的辨析并不明確，同樣的品種在不同的文獻中可能出現在不同的分類中。相對于藏醫(yī)對“藍色”的深淺辨析，藥材市場上的漢文稱呼關注其主色，直接稱之“藍花龍膽”，或稱之“龍膽花”，與“白花龍膽”進行區(qū)別。此外本研究在藏醫(yī)院、藏藥廠、市售藥材中鑒定出多種多枝組龍膽，其中藍玉簪龍膽和線葉龍膽批次最多，也是多種基原品種混合在一起使用的主要品種來源，而青藏龍膽并非其主流藥材。原標準中“青藏龍膽”藥材名不能反映藥材基原的客觀使用情況，若直譯為“黑花龍膽”不能反映其以藍色深淺作為辨識依據的命名原則；若使用“藍花龍膽”不能反映其傳統(tǒng)分類，且易造成與“榜間莪保”混淆。

綜上所述，按照本草記載、傳統(tǒng)藥材分類、市場上藥材習慣叫法及多基原使用現狀，且藏醫(yī)臨床使用并沒有嚴格區(qū)分榜間莪保和榜間那保，建議其藥材名修訂為“龍膽花”，藏文名和藏語漢文音譯不變，該名稱既能反映其多基原品種特點，又能反映其用藥部位，能夠和“白花龍膽”進行區(qū)分，與市場上廣泛使用的藥材漢文名一致，符合傳統(tǒng)認知。

3.5.2 來源的修訂建議

本品在《部頒藏標》中來源于青藏龍膽G.przewalskiiMaxim.及同屬數種植物的干燥花。G.przewalskiiMaxim.此名最早出現在Mel.Biol.Acad.Sci.St.Petersb.(1881年)，隨后《青藏高原藥物圖鑒》(第2冊)[11](1978年)，《中國民族藥志》(第2卷)[12](1990年)、《部頒藏標》(1995年)[13]和《中國藏藥》(1996年)引用了該拉丁名?！吨袊参镏尽?2卷(1988年)在云霧龍膽GentiananubigenaEdgew.的“文獻參考”部分記錄了該拉丁名，云霧龍膽花冠上部藍色，下部黃白色，與《青藏高原藥物圖鑒》(第2冊)[11]所記錄的G.przewalskii花冠筒淡黃色有明顯相異。調查表明，云霧龍膽G.nubigenaEdgew.確被藏醫(yī)識認為“榜間嘎?！币环N使用，但《中國植物志》記載本植物“萼片裂片直立，不整齊，狹矩圓形”，與《部頒藏標》藥材性狀中“萼齒線形”有較大差異，應不為記述的同一個品種。各文獻G.przewalskii所記錄植物性狀與《部頒藏標》中記載的藥材性狀有諸多矛盾之處。因此，本研究認為原標準《部頒藏標》中收載的G.przewalskii可能為誤定，應考慮進行修訂。

此外，本次實驗中收集到“龍膽花”商品藥材共29批，其中藍玉簪龍膽、線葉龍膽、華麗龍膽和青藏龍膽為“龍膽花”商品藥材的主流品種。為擴大藥源，故根據所收集的藏醫(yī)院、藏藥廠、市場藥材來源情況，參考《中國藥典》“淫羊藿”項下品種收錄范例，擬定“龍膽花”來源為龍膽科龍膽屬植物藍玉簪龍膽G.veitchiorumHemsl.、線葉龍膽G.farreriBalf.f.、華麗龍膽G.sino-ornataBalf.f.、青藏龍膽G.futtereriDiels et Gilg等同屬近似種植物。

3.5.3 入藥部位的修訂建議

原《部頒標準》中收載藥用部位為“干燥花”。文獻記載，“榜間”主要以花入藥，《晶珠本草》[2]將其納為旱生草本花入藥類藏藥。但因采收習慣，市場上多以花枝入藥，僅有精品藥材選用花朵且價格較為昂貴。本研究對收集的龍膽花商品藥材進行鑒定分析后發(fā)現，藏醫(yī)院、藥廠、市場所用或所售龍膽花藥用部位均為不含基生葉的帶花地上部分，而非現有標準的制訂的花或全草。此外，龍膽花資源逐年萎縮，僅收集花部分，難以滿足市場需求量，還會造成有同等價值的花枝部分資源的浪費。為保障臨床用藥安全有效，應修訂藥用部位，在提高市場供應量的同時提高資源的利用率。綜上所述，建議藥用部位修改為“不含基生葉的帶花地上部分”。