鞏靜，楊晴，王藝盼，王彥平，朱曉東，張傳生，耿立英，王繼英

(1. 河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北 秦皇島 066600；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽生物組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；3. 棗莊黑蓋豬養(yǎng)殖有限公司，山東 棗莊 277100)

毛色是豬的重要品種特征之一[1]，一直以來備受人們關(guān)注。 在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，毛色被廣泛應(yīng)用于評(píng)判品種的純度、遺傳穩(wěn)定性、親緣關(guān)系，以及在配套系培育中確定親本的雜交組合類型等方面。 揭示豬毛色的遺傳機(jī)制及影響毛色的相關(guān)基因的遺傳規(guī)律，對(duì)豬的育種具有重要意義[2-3]。毛色不同的品種或品系雜交時(shí)，F(xiàn)1代呈現(xiàn)顯性毛色，F(xiàn)2代群體則會(huì)出現(xiàn)毛色分離[4]，選擇毛色一致性強(qiáng)的種豬，淘汰毛色分離嚴(yán)重的個(gè)體，提高群體的整齊度，是新品種或配套系培育過程中的重要步驟[5]。

哺乳動(dòng)物毛色的形成是由一系列與黑色素細(xì)胞種類與形成有關(guān)的生理、生化反應(yīng)的最終結(jié)果，遺傳機(jī)制較復(fù)雜。 豬的毛色大致分為野生型毛色、純黑色、純白色、棕紅色、兩頭烏、花豬等。 雖然屬于質(zhì)量性狀，由少數(shù)幾對(duì)基因決定，但由于基因之間有上位效應(yīng)等遺傳互作效應(yīng)，調(diào)控毛色的基因及其作用機(jī)制尚未完全搞清楚。 黑色素皮質(zhì)素受體1(MC1R)基因是調(diào)控哺乳動(dòng)物毛色的一個(gè)關(guān)鍵基因[6-8]。MC1R是G 蛋白偶聯(lián)受體家族的一員，由Extension 基因座編碼，通過與其配體促進(jìn)劑α-黑素細(xì)胞刺激激素(α-MSH)或頡頏劑刺鼠蛋白(Agouti)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分別形成真黑素或褐黑素， 從而影響豬毛色表型[9]。 Kijas等[10-11]在歐洲野豬、歐洲大黑豬、中國(guó)梅山豬、漢普夏豬、大白豬、皮特蘭豬及杜洛克豬的MC1R基因部分序列中發(fā)現(xiàn)8 個(gè)突變構(gòu)成5 種等位基因，其中E+對(duì)應(yīng)于野豬的灰毛色，ED1對(duì)應(yīng)于歐洲大黑豬和中國(guó)梅山豬的黑毛色，ED2對(duì)應(yīng)于漢普夏豬的黑毛色，Ep對(duì)應(yīng)于皮特蘭豬的黑色斑點(diǎn)及大白豬的白毛色，e 對(duì)應(yīng)于杜洛克豬的棕紅毛色。Fang 等[12]在31 頭歐洲家豬和19 個(gè)亞洲品種家豬及15 頭亞歐野豬的MC1R基因編碼區(qū)內(nèi)共發(fā)現(xiàn)14 個(gè)突變，其中包括Kijas 等發(fā)現(xiàn)的8 個(gè)突變。

棗莊黑蓋豬是山東省著名地方品種，毛色為純黑色，具有肉質(zhì)鮮嫩、產(chǎn)仔數(shù)多、抗病能力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良特征，但其生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)肉性能和胴體瘦肉率低[13-14]。 利用杜洛克對(duì)棗莊黑蓋豬進(jìn)行雜交改良，瘦肉率、肉質(zhì)性能及胴體性能均明顯提高，為棗莊黑蓋豬雜交改良的優(yōu)良雜交組合之一。 我國(guó)多數(shù)黑豬毛色黑色對(duì)棕紅色呈顯性遺傳，杜洛克豬與棗莊黑蓋豬(以下簡(jiǎn)稱杜黑豬)F1雜交后代的毛色全部為全黑色，F(xiàn)2代群體出現(xiàn)了毛色分離。 常規(guī)育種對(duì)豬毛色的選育是橫交固定后，通過持續(xù)的世代選育逐漸剔除后代中毛色出現(xiàn)分離的個(gè)體，周期長(zhǎng)、效率低，嚴(yán)重影響和制約了專門化品系選育和新品種(配套系)育種進(jìn)程。

本研究以杜黑豬F2雜交群體和棗莊純種黑蓋豬為研究對(duì)象，對(duì)F2群體進(jìn)行毛色表型類型分組，利用液相芯片捕獲測(cè)序技術(shù)[15]鑒定MC1R基因中影響毛色的10 個(gè)SNP 的基因型，研究不同基因型與毛色表型的關(guān)系，篩選可用于毛色分子標(biāo)記輔助育種的SNP 位點(diǎn)，為快速建立毛色穩(wěn)定的杜黑豬新品種培育體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及毛色表型收集

試驗(yàn)動(dòng)物包括390 頭杜黑豬F2雜交后代和18 頭棗莊純種黑蓋豬，均來自棗莊黑蓋豬養(yǎng)殖有限公司。 將毛色分為全黑色(棗莊黑蓋豬毛色)、棕紅色(杜洛克毛色)、黑紅條紋、棕色偏黃色、棕色偏白色等類型，對(duì)F2代群體打耳號(hào)時(shí)記錄每頭試驗(yàn)豬的毛色，按毛色表型類型進(jìn)行分組，統(tǒng)計(jì)每組毛色的個(gè)體數(shù)。

1.2 基因組提取及SNP 基因型檢測(cè)

采集試驗(yàn)豬耳組織放入裝有75%乙醇的離心管中，-20 ℃冰箱存儲(chǔ)。 利用血液/組織/細(xì)胞提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取耳組織基因組DNA。 經(jīng)Nanodrop(260/280 在1.7～2.1 范圍之間，濃度＞50 ng/μL)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳(條帶清晰)檢測(cè)合格后，委托博瑞迪生物技術(shù)有限公司利用定制的液相芯片進(jìn)行基因組SNP 測(cè)定。 該液相芯片為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所豬繁育飼養(yǎng)團(tuán)隊(duì)集成了近年來候選基因、功能基因組研究方面公開發(fā)表的功能SNP、Del、Insertion 等標(biāo)記，采用博瑞迪GBTS 技術(shù)體系中的GenoBaits 技術(shù)[15]設(shè)計(jì)并優(yōu)化開發(fā)的一款中低密度(6K)豬功能標(biāo)記液相芯片，其中MC1R基因中影響毛色的10 個(gè)SNP 位點(diǎn)信息參考Fang 等[12]，詳見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel 軟件對(duì)杜黑豬毛色表型類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 利用PLINK v1.90 軟件[16]從液相芯片數(shù)據(jù)中調(diào)取出MC1R基因10 個(gè)SNP的基因型數(shù)據(jù)，并計(jì)算基因型頻率、基因頻率和哈代溫伯格平衡顯著性。 使用HaploView4.1 軟件[17]對(duì)SNP 進(jìn)行單倍型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜黑豬F2 代群體毛色表型分析

杜黑豬F2代個(gè)體出現(xiàn)了毛色的分離。 其中，與母本(棗莊黑蓋豬)全黑色毛色一致的個(gè)體最多(293 頭)，占總數(shù)的75.13%；呈現(xiàn)父本(杜洛克)棕紅色毛色的51 頭，占總數(shù)的13.08%；其余46 頭(11.79%)毛色呈現(xiàn)混雜顏色，其中5 頭呈黑紅條紋，另外41 頭毛色既不是黑色也不是棕紅色，而是呈棕色偏黃(24 頭)或棕色偏白(17 頭)。

2.2 杜黑豬F2 代MC1R 基因SNP 基因型和等位基因頻率分析

本研究測(cè)定的MC1R的10 個(gè)SNP 中，5 個(gè)SNP(rs337764723、rs786441673、rs326921593、rs705222433、rs691729809)在杜黑F2代群體中只有一種基因型，為單態(tài)SNP。 另外5 個(gè)多態(tài)SNP 的基因型和等位基因信息詳見表2。 可以看出，5 個(gè)多態(tài)SNP的等位基因頻率均在0.5 左右，處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)(P＞0.05)，這與試驗(yàn)豬為未經(jīng)毛色選擇的F2代群體有關(guān)。 另外，5 個(gè)多態(tài)SNP 不同基因型的個(gè)體數(shù)基本一致，推測(cè)可能存在緊密連鎖。利用HaploView 4.1 進(jìn)一步分析了5 個(gè)多態(tài)SNP單倍型，定義了1 個(gè)單倍型塊(圖2)。 單倍型塊中各個(gè)方塊的顏色由淺至深，表示變異位點(diǎn)連鎖程度由低到高，深紅色表示完全連鎖。 結(jié)果顯示，組成5 個(gè)SNP 的各個(gè)方塊均為深紅色，表示它們緊密連鎖在一起。 單倍型CGGGT 的頻率為0.526，含有該單倍型的個(gè)體全部為黑色毛色，單倍型TAAAC 的頻率為0.469，含有該單倍型的個(gè)體全部為棕紅色毛色。

圖2 MC1R 基因5 個(gè)多態(tài)SNP 位點(diǎn)單倍型塊

2.3 毛色與基因型關(guān)系分析

按照Kijas 等[10]的劃分標(biāo)準(zhǔn)，本研究中的5個(gè)多態(tài)SNP 位點(diǎn)可以劃分為ED1和e 等位基因，其中ED1等位基因包含rs45435031、rs45434630、rs45434629 3 個(gè)位點(diǎn)， e 等位基因包含rs45435032、rs321432333 2 個(gè)位點(diǎn)。 ED1等位基因SNP 位點(diǎn)中，突變純合基因型(GG、GG、TT 型)的F2代杜黑豬全部為黑色毛色，野生純合基因型(AA、AA、CC)為棕紅色，雜合基因型(GA、GA、TC)個(gè)體中大部分(80.83%)為黑色毛色，少部分個(gè)體(19.17%)毛色為黑紅條紋、棕色偏黃和棕色偏白(表3)。 e 等位基因SNP 位點(diǎn)中，突變純合基因型(AA、TT)個(gè)體全部為棕紅毛色，野生純合基因型(GG、CC)個(gè)體全部為黑色毛色，雜合基因型(GA、 TC， AA、 TC， GA、 TT) 大部分個(gè)體(80.99%)為黑色毛色，少部分個(gè)體(19.01%)毛色為黑紅條紋、棕色偏黃和棕色偏白(表3)。

5 個(gè)多態(tài)SNP 位點(diǎn)在棗莊黑蓋豬群體內(nèi)均只有2 種基因型。 ED1等位基因有突變純合基因型和雜合基因型，頻率分別為83.33%和16.67%；e等位基因有野生純合基因型和雜合基因型，頻率分別為83.33%和16.67%(表4)。

表4 棗莊黑蓋豬毛色與SNP 基因型關(guān)系

3 討論與結(jié)論

我國(guó)絕大多數(shù)地方豬種毛色均為黑色，而我國(guó)消費(fèi)者對(duì)黑豬肉具有一種與生俱來的青睞感。市場(chǎng)需求決定育種目標(biāo)，因此，利用國(guó)內(nèi)外兩類基因資源，培育優(yōu)質(zhì)高效、適應(yīng)不同市場(chǎng)需求的專門化品系并配套生產(chǎn)黑色優(yōu)質(zhì)風(fēng)味豬成為豬育種領(lǐng)域的主攻目標(biāo)。 然而，很多黑毛色的專門化品系選育和新品種(配套系)培育過程中后代會(huì)出現(xiàn)明顯毛色分離，從而影響產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 研究毛色關(guān)鍵基因的突變位點(diǎn)與毛色類型的關(guān)系，尋找目標(biāo)毛色的分子標(biāo)記，可利用分子標(biāo)記輔助育種快速建立育種目標(biāo)毛色類型種群。

MC1R基因位于E 座位，定位在豬第6 號(hào)染色體短壁的末端[18]。 Kijas 等[10]研究認(rèn)為ED1等位基因rs45435031、rs45434630 和rs45434629 對(duì)應(yīng)于歐洲大黑豬和中國(guó)梅山豬的黑毛色，其中，rs45435031為同義突變，rs45434630 和rs45434629 是錯(cuò)義突變，使所編碼的氨基酸Leu 和Val 突變?yōu)镻ro 和Met。 本研究中棗莊黑蓋豬毛色為黑色，大部分個(gè)體(83.33%)為ED1等位基因突變基因型(GG、GG和TT)，與鄧素華[19]、師科榮[20]等的研究結(jié)果相一致，表明我國(guó)地方豬種的黑毛色可能主要由顯性黑等位基因ED1調(diào)控。 杜黑豬群體中，ED1等位基因突變基因型個(gè)體全部表現(xiàn)為黑色毛色，雜合基因型(GA、GA 和TC)個(gè)體中大部分(80.83%)表現(xiàn)為黑色毛色，其他表現(xiàn)為黑紅條紋、棕色偏黃和棕色偏白，表明黑色對(duì)棕紅色為不完全顯性，與張建[21]、曾檢華[22]等的報(bào)道一致。 rs45435032和rs321432333 2 個(gè)SNP 位點(diǎn)皆為錯(cuò)義突變，使Ala 分別突變?yōu)門hr 和Val，對(duì)應(yīng)于Kijas 等[10]研究中的等位基因e，其突變純合基因型(AA 和TT)決定了杜洛克豬的棕紅毛色。 本研究中，因?yàn)闆]有采集杜黑雜交豬的父本杜洛克樣本，故沒有檢測(cè)杜洛克的MC1R基因SNP 基因型。 但杜黑豬F2中棕紅色豬全部為突變純合基因型，與Kijas 等[10]報(bào)道的等位基因e 突變純合基因型影響棕紅色毛色的結(jié)論一致。

MC1R基因中ED1和e 等位基因的5 個(gè)多態(tài)SNP 位于444 bp 的序列上，在分析杜黑豬F2個(gè)體時(shí)發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)相似的基因頻率，推測(cè)可能存在緊密連鎖。 利用HaploView 4.1 進(jìn)行5 個(gè)SNP 單倍型分析，結(jié)果顯示5 個(gè)SNP 定義了1 個(gè)高度連鎖的單倍型塊。 單倍型CGGGT 的頻率為0.526，含有該單倍型的個(gè)體全部為黑色毛色，單倍型TAAAC 的頻率為0.469，含有該單倍型的個(gè)體全部為棕紅色毛色。 該結(jié)果提示在杜黑豬新品種選育中，對(duì)MC1R基因的5 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行毛色分子標(biāo)記輔助選擇，有助于快速剔除隱性棕紅色等位基因，使杜黑豬新品種的毛色迅速固定為全黑色。

綜上，本研究分析了MC1R基因多態(tài)性與杜黑豬F2群體毛色的關(guān)系，揭示了杜黑豬毛色中黑色對(duì)棕紅色為不完全顯性，利用MC1R基因的5個(gè)多態(tài)SNP 標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇可快速剔除隱性棕紅色等位基因，為杜黑豬新品種培育中黑色毛色固定奠定基礎(chǔ)。