章英才， 王 靜， 陶珊珊

(寧夏大學 生命科學學院， 銀川 750021)

阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan proteins，AGPs)是一類結構復雜的大分子，廣泛分布于植物體各器官的細胞中，參與植物營養(yǎng)生長[1]、生殖生長和發(fā)育[2]的各個環(huán)節(jié)。目前集中研究AGPs在根形態(tài)建成、細胞增殖與程序性死亡、雌雄配子體的發(fā)育、花藥發(fā)育與花粉管生長、體細胞胚胎發(fā)生以及植物激素信號傳導等方面的功能[3-4]，但對植物果實發(fā)育中AGPs的研究較少，如蘋果[5]、寧夏枸杞[6-7]等果實。AGPs由多糖支鏈和蛋白質核心鏈組成[8-10]，糖基部分主要由阿拉伯糖和半乳糖構成[11]。研究表明，寧夏枸杞多糖是一種以-O-連接的糖和蛋白質結合的阿拉伯半乳聚糖AGPs糖蛋白，枸杞果實的多糖具有典型的AGPs阿拉伯半乳聚糖糖蛋白特征，分布于果肉細胞的細胞壁、細胞膜和質體膜[6-7]；枸杞多糖是type II類型的阿拉伯半乳聚糖蛋白AGPs[12]。枸杞子糖蛋白被證實是枸杞果實提高免疫活性和抗衰老的藥用有效成分[13-14]。這與已報道的長棗多糖的藥理功能相一致[15]，也與靈武長棗不同發(fā)育時期果實中精制多糖的10種單糖中阿拉伯糖、半乳糖含量較高的研究結果一致[16]。因此，明確靈武長棗果實AGPs多糖蛋白積累和分布非常重要。

AGPs可能分布在植物各種組織和細胞的細胞壁、質膜、細胞器以及胞外基質等部位[17]。人工合成的苯基偶氮染色劑βGlcY(β-D-glucosyl-Yariv reagent)與AGPs發(fā)生特有反應，形成棕紅色絮狀沉淀，成為鑒定AGPs的常用染色劑[9]。但更多的是利用βGlcY對組織和器官中AGPs進行定量分析[17-18]，以及通過與AGPs結合研究其功能[18-19]，而利用βGlcY進行定位分布的研究極少[17]。與AGPs進行特異性反應的單克隆或多克隆抗體，成為研究AGPs時空分布普遍采用的良好工具[20-21]。如Bao等[7]通過Western Blot分析證實JIM8、JIM13、MAC204、JIM94為抗枸杞果實AGPs的抗體，并對果實AGPs進行了免疫組化定位。目前，通過βGlcY試劑對AGPs染色、單克隆抗體與AGPs反應等手段，為不同植物中不同部位AGPs的分布和表達定位提供支撐[22-25]。

靈武長棗(ZiziphusjujubaMill cv. Lingwuchangzao)原產于寧夏靈武市，果實中長棗多糖蛋白是最重要的藥用生物活性成分之一。近年來，在靈武長棗果實貯藏保鮮、品種選育等方面有了較多的研究成果[26]，而有關果實多糖重要組成AGPs糖蛋白的分布和與果實品質影響的研究尚未見報道。因此，本研究以不同發(fā)育時期的“靈武長棗”果實為試驗材料，應用βGlcY染色技術，研究了不同發(fā)育時期果實AGPs的分布特征，并通過免疫熒光定位法進行印證。為探討AGPs定位分布研究的βGlcY染色技術及該成分在品質調控方面的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以位于寧夏靈武市的寧夏紅棗工程技術研究中心試驗基地6年生“靈武長棗”為供試材料，采用隨機設計，3次重復，分別在果實膨大前期(2021年7月10日)、快速膨大期(2021年8月9日)、著色期(2021年9月8日)、完熟期(2021年9月28日)，選擇標記3 000朵花朵的枝條上果實作為試驗對象，采摘后用冰壺冷藏帶回實驗室[27]。

按質量比為9∶1稱取聚乙二醇-400二硬脂酸酯[Polyethylene glycol (PEG) 400 distearate(Sigma-Aldrich，cat.#305413)]和1-十六烷醇[1-Hexadecanol (Sigma-Aldrich，cat.#258741)]顆粒，放入燒杯中在50 ℃的溫箱中熔化混勻，室溫下冷卻成為熔點35 ℃～37 ℃石蠟Steedman’s wax保存?zhèn)溆?。βGlcY和βManY購自Biosupplies Australia Pty Ltd；AGPs單克隆抗體MAC204購自美國喬治亞大學，堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG二抗購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 糖蛋白βGlcY定位

(1)石蠟切片。選取各不同發(fā)育時期的果實，用刀片將材料切成帶外果皮的(0.6×0.4×0.5) cm小塊，立即放入4%多聚甲醛-0.5%戊二醛的PBS(10 mmol/L，pH 7.4)固定液中，蓋緊瓶蓋后注射器多次抽氣至樣品沉落瓶底，在室溫下固定12 h或過夜。樣品用PBS磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.4)清洗3次，每次15 min。在4 ℃下依次用30%、50%、70%、90%的乙醇梯度脫水，每次60 min，100%乙醇3～4次，60 min /次。樣品在37 ℃恒溫箱中用1∶1的純乙醇∶Steedman’s wax石蠟滲透過夜，次日更換1∶3的純乙醇∶石蠟滲透2.5 h，再用純石蠟繼續(xù)滲透3次，每次2 h。將樣品用純石蠟在牛皮紙盒中包埋，常溫凝固后即可。將樣品蠟塊固著在小木塊上，在25 ℃左右環(huán)境中，用LEICA RM 2255切片機切片，厚度為10 μm，光面朝下放在較低溫的瓷盤中。先在涂有0.2%聚乙烯亞胺的載玻片上加一兩滴蒸餾水，用鑷子將蠟帶光滑面朝下輕放在載玻片水滴中，按順序排好，在25 ℃左右室溫下可自然展片，切片自然展片后將多余的水吸去，晾干一周后備用。(2)βGlcY和βManY標記。將粘有蠟帶的載玻片切片放入裝有純乙醇的染色缸中，中間換2次純乙醇，30 min/次，切片完全脫蠟后，依次放入90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇的染色缸中逐級復水，每級10 min。直接在載玻片上滴1滴配置好的0.05、0.1、0.5、1 mg/mL的Yariv reagent(用預先配制1 mg/mL溶解于0.15 mol/L的NaCl母液稀釋)對切片染色60 min。對照采用βManY(用預先配制1 mg/mL溶解于0.15 mol/L的NaCl母液稀釋)，即陰性對照切片用βManY代替βGlcY；然后用ddH2O沖洗2～3次，每次1 min。稍微晾干后，取100%甘油少許滴在切片上封片。吸去多余的封片劑后用指甲油將蓋玻片周圍封固，OLYMPUS IX73顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2 糖蛋白免疫熒光定位

參照Bao等[7]的方法，略有改動。(1)石蠟切片。4個發(fā)育時期果實用刀片切成合適的大小，立即放入含有體積分數為3.7%的甲醛的2F4固定液中，蓋緊瓶蓋后注射器抽氣至樣品下沉瓶底，室溫固定4 h。更換固定液3次，每次30 min。然后用PBS磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)清洗3次，每次15 min。樣品在4 ℃下用0.05% Toluidine blue(甲苯銨藍)染色15 min，在4 ℃下依次用30%、50%、70%、90%的乙醇梯度脫水，每次60 min，100%乙醇3～4次，60 min/次。樣品用純乙醇∶Steedman’s wax石蠟=1∶1在37 ℃恒溫箱中滲透過夜，次日更換純乙醇∶石蠟=1∶3滲透2.5 h，再用純石蠟在37 ℃滲透3次，每次2 h。將樣品用純Steedman’s wax在牛皮紙盒中包埋，常溫凝固即可。后期蠟塊的固著、整修、切片、貼片和展片與前述石蠟切片步驟相同。(2)免疫熒光標記。將貼片后的載玻片放入裝有純乙醇的染色缸中，中間換2次純乙醇，30 min/次，切片即可全部脫蠟。切片依次放入90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇的染色缸中逐級復水，每級10 min。將載玻片上切片在PBS(10 mmol/L，pH 7.4)培養(yǎng)皿中浸泡10 min，用含50 mmol/L甘氨酸的PBS溶液封閉30 min，PBS(10 mmol/L，pH 7.4)浸泡10 min，然后用2% BSA的PBS(10 mmol/L，pH 7.4)溶液室溫封閉10 min，PBS(10 mmol/L，pH 7.4)浸泡10 min。用PBS(含1% BSA)以1∶100比例稀釋后的AGPs單克隆抗體MAC204，4 ℃下孵育過夜(陰性對照切片采用含1% BSA的PBS溶液代替一抗孵育)，次日用PBS淋洗浸泡3次，每次10 min，以去除多余抗體，再用PBS(含1%BSA)以1∶200比例稀釋后的堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG二抗36 ℃黑暗條件下孵育1 h。標記后，PBS淋洗浸泡3次，每次10 min，除去未標記的二抗，用0.01% Toluidine blue染色10 min，以去除植物本身的自發(fā)熒光。切片用PBS(10 mmol/L，pH 7.4)淋洗(浸泡)10 min，稍微晾干后，取甘油少許滴在切片上，用蓋玻片封片，避免產生氣泡，吸去多余的封片劑后用指甲油將蓋玻片周圍封固，盡快在OLYMPUS IX73熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 膨大前期果實AGPs的βGlcY定位

βGlcY與AGPs發(fā)生特有的反應，形成棕紅色絮狀沉淀。膨大前期果實0.05、0.1、0.5、1 mg/mL不同濃度的βGlcY形成的棕紅色沉淀的強弱不同，濃度越高染色強度越大[圖1(a)～(d)]。而βManY在果實相應部位均沒有棕紅色沉淀[圖1(e)]。果實外果皮βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光在細胞壁和細胞內部均有分布，緊鄰外果皮的數層排列較為緊密，內部相鄰數層排列較疏松的大型中果皮細胞內外均分布βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光[圖1(a)～(d)，(f)～(h)]。維管束所有細胞的細胞壁和細胞內部均分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光[圖1(a)～(d)，(f)～(h)]。

(a)～(d)分別為0.05、0.1、0.5、1 mg/mL濃度βGlcY處理后AGPs的染色情況；外果皮及內部組織AGPs定位。(e)近內果皮的中果皮維管束及周圍組織，βManY處理后均沒有棕紅色沉淀。(f)外果皮及內部組織免疫熒光分布。(g)中部中果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。(h)近內果皮的中果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。A：AGPs形成的棕紅色沉淀；VB：維管束；Ex：外果皮；En：內果皮。(a)～(f)，Bar=100 μm；(g)～(h)，Bar=50 μm。圖1 膨大前期果實AGPs的βGlcY及免疫熒光定位Figure 1 βGlcY and immunofluorescence distribution of AGPsduring the early bulking period

2.2 快速膨大期果實AGPs的βGlcY定位

快速膨大期果實0.05、0.1、0.5、1 mg/mL不同濃度βGlcY形成的棕紅色沉淀的強弱不同，濃度越高染色強度越大[圖2(a)～(d)]。而βManY在維管束及薄壁細胞等部位均沒有棕紅色沉淀[圖2(e)]。外果皮及內部數層排列較為緊密的中果皮小細胞細胞壁和細胞內部均分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光；內部數層大型卵圓形薄壁細胞AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光均主要分布于細胞壁上，大部分細胞內部無分布[圖2(a)～(d)，(f)～(h)]。維管束的所有細胞內外均分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光；除了空腔之外，維管束周圍中果皮薄壁細胞的細胞壁都分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光，細胞內部分布較少，部分細胞出現破裂現象[圖2(a)～(d)，(f)～(h)]。近內果皮維管束的所有細胞內外以及維管束周圍薄壁細胞的部分細胞內外也都分布βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光[圖2(a)～(d)，(f)～(h)]。

(a)～(d)分別為0.05、0.1、0.5、1 mg/mL濃度βGlcY處理后AGPs的染色情況；中果皮維管束及周圍組織AGPs定位。(e)中果皮維管束及周圍組織，βManY處理后均沒有棕紅色沉淀。(f)外果皮及內部組織免疫熒光分布。(g)近外果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。(h)近內果皮的中果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。A：AGPs形成的棕紅色沉淀；VB：維管束；Ex：外果皮。(a)～(h)，Bar=100 μm。圖2 快速膨大期果實AGPs的βGlcY及免疫熒光定位Figure 2 βGlcY and immunofluorescence distribution of AGPsduring the rapid enlargement period

2.3 著色期果實AGPs的βGlcY定位

著色期果實0.05、0.1、0.5、1 mg/mL不同濃度的βGlcY形成棕紅色沉淀的強弱也不同，濃度越高染色強度越大[圖3(a)～(d)]。βManY在維管束及薄壁細胞等部位均沒有棕紅色沉淀[圖3(e)]。βGlcY-AGPs形成棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光在外果皮及內部數層排列較為緊密的中果皮小細胞細胞壁和細胞內部均有分布[圖3(a)～(d)，(f)～(h)]。內部數層大型卵圓形薄壁細胞βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光均主要在薄壁細胞的細胞壁上，而細胞內部均較少分布，分布有所減少[圖3(a)～(d)，(f)～(h)]。維管束的所有細胞均分布有AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光；維管束周圍薄壁細胞的細胞壁均分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光，但大部分薄壁細胞內部無分布[圖3(a)～(d)，(f)～(h)]。

(a)～(d)分別為0.05、0.1、0.5、1 mg/mL濃度βGlcY處理后AGPs的染色情況。(a)(d)外果皮及內部組織AGPs定位；(b)(c)中果皮維管束及周圍組織AGPs定位。(e)中果皮維管束及周圍組織，βManY處理后均沒有棕紅色沉淀。(f)外果皮及內部組織免疫熒光分布。(g)近外果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。(h)近內果皮的中果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。A：AGPs形成的棕紅色沉淀；VB：維管束；Ex：外果皮。(a)～(h)，Bar=100 μm。圖3 著色期果實AGPs的βGlcY及免疫熒光定位Figure 3 βGlcY and immunofluorescence distribution of AGPsduring the the coloring period

2.4 完熟期果實AGPs的βGlcY定位

與著色期相似，完熟期果實0.05、0.1、0.5、1 mg/mL不同濃度βGlcY形成的棕紅色沉淀的強弱也不同，濃度越高染色強度越大[圖4(a)～(d)]。與前幾個時期相似，βManY在維管束及薄壁細胞等部位均沒有棕紅色沉淀[圖4(e)]。外果皮及內部數層排列較為緊密的中果皮小細胞的細胞壁和細胞內部均分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光；相鄰內部較大型的中果皮薄壁細胞βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光均主要在薄壁細胞的細胞壁上，而細胞內部均較少分布，分布明顯減少，很多細胞出現破裂[圖4(a)～(d)，(f)～(h)]。除空腔之外，在中果皮中部及內部維管束的所有細胞均分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光[圖4(a)～(d)，(f)～(h)]。維管束周圍薄壁細胞的細胞壁均分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識別的抗原綠色熒光，但大部分薄壁細胞內部無分布[圖4(a)～(d)，(f)～(h)]。

(a)～(d)分別為0.05、0.1、0.5、1 mg/mL濃度βGlcY處理后AGPs的染色情況。(a)外果皮及內部組織AGPs定位；(b)～(d)中果皮維管束及周圍組織AGPs定位。(e)中果皮維管束及周圍組織，βManY處理后均沒有棕紅色沉淀。(f)外果皮及內部組織免疫熒光分布。(g)近外果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。(h)近內果皮的中果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。A：AGPs形成的棕紅色沉淀；VB：維管束；Ex：外果皮。(a)～(h)，Bar=100 μm。圖4 完熟期果實AGPs的βGlcY及免疫熒光定位Figure 4 βGlcY and immunofluorescence distribution of AGPsduring the maturation period

總體來看，βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀在各時期果實外果皮及相鄰內部數層排列緊密的中果皮小細胞的細胞壁和細胞內部均有分布；中果皮大型卵圓形薄壁細胞的細胞壁和細胞內在膨大前期均有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀，而在快速膨大期、著色期和完熟期均主要分布于薄壁細胞的細胞壁上，大部分細胞內部無分布；各時期果實維管束所有細胞的細胞壁和細胞內部都分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀。隨著果實發(fā)育成熟，βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀分布有所減少。

3 討論與結論