高前磊， 李川皓，陳帥，李?；?，張相倫，袁震，盛清凱

(1. 天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院/天津市農(nóng)業(yè)動物繁殖與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟(jì)南 250100；3. 山東鑫基牧業(yè)有限公司，山東 泰安 271200)

腸道是動物機(jī)體消化吸收的主要場所，也是機(jī)體重要的免疫器官[1]，腸道屏障作為防御腸腔毒素和病原微生物的重要防線，其遭到破壞會導(dǎo)致抗原向固有層滲透，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而引起腸道炎癥，誘發(fā)動物疾病，降低生產(chǎn)性能[2]。群體感應(yīng)是菌群之間的一種通訊機(jī)制，細(xì)菌根據(jù)種群密度在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間交換信息、協(xié)調(diào)群體行為、調(diào)節(jié)基因表達(dá)[3]。 細(xì)菌群落達(dá)到一定密度時，細(xì)菌會產(chǎn)生小分子物質(zhì)并向外界釋放，當(dāng)環(huán)境中信號分子富集濃度達(dá)到一定閾值時，會進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)與胞內(nèi)受體結(jié)合調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，使細(xì)菌群落出現(xiàn)新的群體行為，如生物發(fā)光、毒力因子的分泌、生物被膜的形成、抗生素抗性和運動等[4-6]。 銅綠假單胞菌產(chǎn)生的群體感應(yīng)分子3OC12HSL 在以往的研究中較為集中，發(fā)現(xiàn)其可以對多種細(xì)胞類型發(fā)揮細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，破壞細(xì)胞間連接，促進(jìn)細(xì)菌透過內(nèi)皮屏障[7]。3OC12HSL 在宿主體多個部位被檢測到，Xue等[8]在小鼠腸道、血清、肝臟中檢測到群體感應(yīng)分子，在無菌小鼠中未檢測到。 不同研究結(jié)果顯示，3OC12HSL 的作用效果并非一致，不同物種、不同細(xì)胞間存在差異。 本試驗選用豬回腸上皮IPI-2I 細(xì)胞，探討3OC12HSL 對IPI-2I 細(xì)胞的影響及機(jī)制，以期為促進(jìn)畜禽健康養(yǎng)殖生產(chǎn)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試細(xì)胞:豬IPI-2I 回腸上皮細(xì)胞系購自上海煊雅生物科技有限公司。

主要試劑:3OC12HSL、DMSO 購自Sigma 公司；胎牛血清(FBS)為Ausbian 品牌；RPMI1640培養(yǎng)液購自Gibco 公司；AnnexinV 凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞增殖活性檢測試劑盒(CCK-8)購自日本同仁化學(xué)研究所；白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素8(IL-8)、白介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA 試劑盒均購自武漢基因美生物技術(shù)公司；細(xì)胞總RNA 提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自南京諾威贊生物科技股份有限公司。

主要儀器:熒光定量PCR 儀(瑞士，羅氏)，流式細(xì)胞儀(美國，BD Biosciences)，酶標(biāo)儀(美國，伯騰)，倒置相差顯微鏡(日本，Nikon)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國，Thermo)，超高速離心機(jī)(德國，Eppendorf)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和試驗分組 將液氮保存的IPI-2I 細(xì)胞37 ℃水浴復(fù)蘇后接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至70%時，用0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)消化液消化，細(xì)胞密度調(diào)至105個/mL 接種，96 孔板每孔100 μL，25 cm2培養(yǎng)瓶每瓶4 mL，在37 ℃、5% 濃度CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞生長至70%時進(jìn)行試驗。 3OC12HSL 用DMSO 溶解，試驗組加入3OC12HSL 溶液，使各組終濃度分別為50、100、200、400 μmol/L，DMSO 濃度控制在0.1%。 對照組加入細(xì)胞培養(yǎng)液，其中DMSO 含量為0.1%。

1.2.2 CCK-8 法檢測細(xì)胞活性 將IPI-2I 細(xì)胞接種于96 孔板，分別用0、50、100、200、400 μmol/L的3OC12HSL 處理細(xì)胞，每組設(shè)6 個重復(fù)，分別培養(yǎng)4、8、12、24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm 處各孔吸光度值，計算細(xì)胞活性。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將IPI-2I 細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，分別用0、50、100、200、400、800 μmol/L 的3OC12HSL 處理細(xì)胞12 h，倒掉培養(yǎng)液，PBS 沖洗3 次，加入1 mL 胰蛋白酶37 ℃消化5 min 后，加入1 mL 含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕吹打未脫壁細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，去上清，加入100 μL緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL FITC，輕輕混勻，加入10 μL PI 染液，25 ℃孵育10 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.4 ELISA 法檢測炎癥因子 將IPI-2I 細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔重復(fù)3 次，分別用0、50、100、200、400 μmol/L 的3OC12HSL 處理細(xì)胞12 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，使用ELISA 試劑盒檢測培養(yǎng)液中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的含量。

1.2.5 實時熒光定量RT-PCR 檢測mRNA 表達(dá)水平 細(xì)胞培養(yǎng)與處理方法同1.2.4。 RT-PCR引物利用Primer 5.0 軟件設(shè)計，由上海生物工程有限公司合成。 利用試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 純度和完整性。 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR 反應(yīng)體系為20 μL，根據(jù)試劑盒說明書配制，反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃10 s，60 ℃30s，40個循環(huán)；95℃15s，60℃60s，95 ℃15 s。 以GAPHD作為內(nèi)參照基因，所用引物見表1，用2-△△Ct計算mRNA 的相對表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析作圖，組間比較采用ANOVA 分析，進(jìn)一步比較采用LSD 檢驗，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 3OC12HSL 對IPI-2I 細(xì)胞活性的影響

不同濃度3OC12HSL 分別處理IPI-2I 細(xì)胞不同時間，CCK-8 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著3OC12HSL 濃度的增加和作用時間的延長，細(xì)胞活性逐漸降低。 如圖1所示，作用時間為4 h，各組之間細(xì)胞活性沒有顯著差異；作用時間8 h、濃度為200 μmol/L 時，細(xì)胞活性較對照極顯著下降(P＜0.01)；作用時間延長至12 h，濃度為400 μmol/L 時，細(xì)胞活性降至對照組的50%以下；進(jìn)一步延長作用時間至24 h，細(xì)胞活性未繼續(xù)下降。 3OC12HSL 濃度為400 μmol/L、作用時間為8 h時，細(xì)胞活性極顯著降低(P＜0.01)，12 h 時降到最低，繼續(xù)延長作用時間，細(xì)胞活性無顯著變化。 結(jié)果顯示，3OC12HSL 對IPI-2I 抑制效果呈時間與濃度依賴性。

圖1 3OC12HSL 濃度和作用時間對細(xì)胞活性的影響

2.2 3OC12HSL 對IPI-2I 細(xì)胞凋亡的影響

利用流式細(xì)胞儀檢測不同濃度3OC12HSL 作用12 h 時對IPI-2I 細(xì)胞凋亡的影響(圖2)，結(jié)果顯示，與對照組相比，100 μmol/L 3OC12HSL 極顯著增加細(xì)胞凋亡率(P＜0.01)。 隨著濃度增加，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增大，濃度達(dá)到800 μmol/L 時，細(xì)胞凋亡比例達(dá)到17.24%。 說明3OC12HSL 可以誘導(dǎo)IPI-2I 細(xì)胞凋亡，其濃度越高細(xì)胞凋亡率也越高。

2.3 3OC12HSL 對IPI-2I 細(xì)胞炎癥因子的影響

ELISA 檢測結(jié)果顯示(圖3)，與對照組相比，200 μmol/L 3OC12HSL 處理細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-8、IL-1、TNF-α的濃度極顯著增加(P＜0.01)，隨3OC12HSL 作用濃度增大，炎癥因子濃度進(jìn)一步升高。 與200 μmol/L 濃度處理相比，400 μmol/L 3OC12HSL 處理的炎癥因子濃度差異不顯著(P＞0.05)。 表明3OC12HSL 可以促進(jìn)IPI-2I 細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。

圖3 3OC12HSL 對細(xì)胞炎癥因子的影響

2.4 3OC12HSL 對IPI-2I 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響

利用RT-PCR 檢測不同濃度3OC12HSL 作用12 h 后細(xì)胞Fas、Caspase3、Caspase8、Bax、Bcl-2基因mRNA 相對表達(dá)量。 結(jié)果(圖4)顯示，與對照組相比，3OC12HSL 濃度達(dá)到100 μmol/L 時顯著提高Bax基因mRNA 相對表達(dá)量(P＜0.05)，達(dá)到400 μmol/L 時顯著降低Bcl-2基因mRNA 相對表達(dá)量(P＜0.05)，達(dá)到50 μmol/L 時分別極顯著和顯著提高Fas(P＜0.01)、Caspase8(P＜0.05)基因的mRNA 表達(dá)水平，濃度達(dá)到100 μmol/L 時可極顯著提高Caspase3基因mRNA 相對表達(dá)量(P＜0.01)。 表明3OC12HSL 可能通過線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑和Fas/Fasl介導(dǎo)的外源性凋亡途徑誘導(dǎo)IPI-2I細(xì)胞凋亡。

圖4 3OC12HSL 對細(xì)胞凋亡基因mRNA 表達(dá)水平的影響

3 討論與結(jié)論

銅綠假單胞菌是畜禽腸道常見的條件致病菌，可引起宿主多個部位感染，其群體感應(yīng)系統(tǒng)主要分泌3OC12HSL 和C4HSL 兩種群體感應(yīng)分子，它們參與銅綠假單胞菌一系列生理過程的調(diào)節(jié)和與外界的信息交流[9]。 3OC12HSL 除了參與發(fā)揮細(xì)菌的致病作用，還可影響宿主細(xì)胞的功能及基因表達(dá)。 腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，腸道中聚集著大量的菌群，參與宿主免疫、代謝、內(nèi)分泌等生理功能[10]。 腸道菌群產(chǎn)生的代謝物也影響著宿主，當(dāng)腸道上皮細(xì)胞受損，腸黏膜屏障受到破壞[11]，會加劇宿主感染風(fēng)險。 3OC12HSL作為脂溶性小分子，可以進(jìn)入腸道上皮細(xì)胞，影響腸道細(xì)胞正常的生理功能，引起細(xì)胞凋亡，破壞腸道屏障。 Taguchi 等[12]利用低濃度3OC12HSL 作用于未分化的Caco-2 細(xì)胞，可使細(xì)胞活性降低，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過抑制Akt 磷酸化增加細(xì)胞存活率，說明3OC12HSL 通過靶向促進(jìn)Akt 磷酸化，引起細(xì)胞死亡。 Shimizu 等[13]發(fā)現(xiàn)低濃度的3OC12HSL 可以通過激活ERK1/2 途徑，減少黏糖蛋白(MUC3)的產(chǎn)生，進(jìn)一步引起Caco-2 的凋亡。 Schwarzer 等[14]在3OC12HSL 誘導(dǎo)的呼吸道上皮細(xì)胞凋亡中發(fā)現(xiàn)，3OC12HSL 通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+的信號傳導(dǎo)促進(jìn)凋亡，使用Ca2+抑制劑預(yù)處理10 min，可以保護(hù)呼吸道上皮屏障，顯著減少細(xì)胞死亡。 Nishimura-Danjobara等[15]發(fā)現(xiàn)3OC12HSL 可以干擾大鼠胸腺淋巴細(xì)胞膜對鉀離子的通透性，引起細(xì)胞膜超極化，擾亂淋巴細(xì)胞正常功能，表明3OC12HSL 可能通過影響宿主細(xì)胞內(nèi)外的離子濃度發(fā)揮功能。 本研究中，3OC12HSL 以濃度和時間依賴性降低IPI-2I 細(xì)胞活性，引起細(xì)胞凋亡，表明3OC12HSL 對不同細(xì)胞的影響可能與物種、器官、劑量及作用時間有關(guān)。

動物機(jī)體促炎因子和抗炎因子的失調(diào)會引起宿主炎癥反應(yīng)，炎癥性腸炎可破壞腸黏膜屏障，增加腸道通透性，擾亂腸黏膜免疫系統(tǒng)，破壞菌群平衡，最終引起腸道菌群失調(diào)，進(jìn)而引起一系列腸道疾病，因此，維持腸道屏障的完整性對動物體的健康至關(guān)重要。 研究發(fā)現(xiàn)，3OC12HSL 對宿主免疫細(xì)胞具有多種調(diào)控功能，能夠調(diào)控宿主細(xì)胞炎癥反應(yīng)，影響宿主固有免疫[16]。 Rahbari 等[17]研究表明，化膿性鏈球菌利用細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的3OC12HSL，通過抑制巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中NF-kβ 蛋白活性，顯著降低細(xì)胞液中TNF-α和IL-6 表達(dá)水平，減少促炎因子的濃度，減弱宿主對病原菌的抵抗。 Jahoor 等[18]發(fā)現(xiàn)3OC12HSL增加了小鼠成纖維細(xì)胞和人上皮細(xì)胞中促炎因子mRNA 的水平，提出細(xì)胞PPAR 受體可能作為3OC12HSL 的靶點調(diào)控宿主的基因表達(dá)，這種促炎反應(yīng)和抑炎反應(yīng)的表現(xiàn)可能與細(xì)胞類型不同有關(guān)系。 Glucksam-Galnoy 等[19]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌產(chǎn)生的 3OC12HSL 以劑量依賴的方式對RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，降低促炎因子TNF-α的濃度，提高抑炎因子IL-10 的濃度。 本研究中發(fā)現(xiàn)IPI-2I 細(xì)胞在3OC12HSL 影響下顯著增加IL-6、IL-8、IL-1、TNF-α的濃度，表明3OC12HSL 可誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞凋亡是真核細(xì)胞生物中一種程序性死亡，對維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和發(fā)育具有重要作用，主要包括內(nèi)源性途徑和外源性途徑[20]。 內(nèi)源性途徑由線粒體介導(dǎo)，可由多種因素誘導(dǎo)發(fā)生，引起促凋亡蛋白Bax 寡居化，增加線粒體膜的通透性，細(xì)胞色素c 透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)， 激活Caspase9，繼而活化Caspase3，活化的Caspase3 可以直接降解細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]。 線粒體內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2可抑制Bax 的寡聚化，保持線粒體膜的完整性，阻止細(xì)胞凋亡[22]，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 和Bax 的表達(dá)比例對細(xì)胞凋亡有重要意義。 本研究中3OC12HSL 作用IPI-2I 細(xì)胞，Bcl-2的mRNA 表達(dá)量降低，Bax的表達(dá)量升高，說明3OC12HSL 可以通過調(diào)控線粒體介導(dǎo)的Bcl-2家族抗凋亡和促凋亡基因的表達(dá)量，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。 外源性凋亡途徑由膜受體與配件結(jié)合傳遞凋亡信號，激活胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡，死亡受體Fas 作為上游信號分子與其配體FasL 結(jié)合，招募死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)，與Caspase8 酶原形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(DISC)，活化Caspase8 酶原，激活Caspase3，啟動細(xì)胞凋亡[23]。 Shin 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，LPS 與3OC12HSL 聯(lián)合作用于人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可加劇細(xì)胞凋亡，3OC12HSL 激活受體相互作用蛋白激酶1(RIPK1)通路，導(dǎo)致Caspase8和Caspase3水平的增加，用RIPK1 抑制劑作用后可減少細(xì)胞死亡。 Woo 等[25]發(fā)現(xiàn)3OC12HSL 可導(dǎo)致Ca2+外流和Caspase12活化，通過活性氧(ROS)損傷線粒體功能，導(dǎo)致細(xì)胞色素c 外漏，增加Caspase3，Caspase8，Caspase9的mRNA 表達(dá)量，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。 本研究發(fā)現(xiàn)，3OC12HSL 作用可以顯著增加Fas、Caspase8的mRNA 的表達(dá)水平，表明3OC12HSL 可以通過Fas/FasL凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果表明，一定濃度的群體感應(yīng)分子3OC12HSL 導(dǎo)致豬回腸上皮細(xì)胞多種促炎性因子的表達(dá)，能夠通過激活線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑和Fas/FasL介導(dǎo)的外源性凋亡途徑，促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的凋亡，損傷腸道屏障功能，為后續(xù)開發(fā)群體感應(yīng)抑制劑提供參考。