矯健，李建達(dá)，韓先杰，張琳，張玉玉，任素芳，劉飛，陳智，Nataliia Hrabchenko，張文娟，于江，吳家強(qiáng)

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽生物組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；3. 山東碧藍(lán)生物科技有限公司，山東 泰安 271400)

非洲豬瘟(African swine fever， ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus， ASFV)引起的一種高度傳染性、出血性疾病，臨床上以高熱、皮膚發(fā)紺、淋巴結(jié)及臟器廣泛出血為主要特征，如腎瘀斑、皮膚紅斑、肺水腫、彌散性血管內(nèi)凝血等[1]。 ASFV 主要通過接觸性傳播，家豬和野豬都是其主要宿主，一旦侵入家豬，便可在豬群中快速傳播，發(fā)病率和死亡率高達(dá)100%[2-3]，感染性病毒在組織中能夠存在較長時(shí)間，尤其是淋巴結(jié)和扁桃體[4]。 此外，該病毒也是唯一已知的DNA 蟲媒病毒，能夠通過軟蜱進(jìn)行傳播[5]。 ASF于1921 年首次在肯尼亞報(bào)道，隨后傳入其他非洲國家[6]。 2007 年，在格魯吉亞發(fā)現(xiàn)了毒力更高的ASFV Ⅱ型，并迅速傳播[7]。 2018 年8 月，我國沈陽首次暴發(fā)ASF，隨后迅速蔓延到全國所有省份[8]，對(duì)我國乃至全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

ASFV 是Asfarviridae 科中Asfarvirus屬的唯一成員[9]，是一種有囊膜的雙鏈DNA 病毒。 ASFV粒子是具有多層結(jié)構(gòu)的二十面體，直徑約為200 nm，病毒粒子結(jié)構(gòu)自內(nèi)向外依次為類核、核殼、內(nèi)囊膜、衣殼、外囊膜[10-11]。 ASFV 基因組長度約為170～194 kb，目前已從其中鑒定出結(jié)構(gòu)蛋白68種，部分蛋白的功能尚不清楚[12]。 這些結(jié)構(gòu)蛋白分布在不同的區(qū)域，在病毒黏附與入侵、病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、病毒包裝與出芽以及免疫逃避等病毒感染的不同方面發(fā)揮著重要的作用[5]。 由于ASFV 結(jié)構(gòu)復(fù)雜繁冗，對(duì)其功能的了解也十分有限，到目前為止還沒有完全有效的ASFV 商業(yè)疫苗，因此鑒定病毒結(jié)構(gòu)蛋白的免疫原性在探討病毒與宿主相互作用中至關(guān)重要[13]。

ASFV p22 蛋白由KP177R基因編碼，分子量為22 kDa。 p22 最初被描述為一種早期誘導(dǎo)的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，位于病毒顆粒外部，能夠從病毒顆粒表面溶解釋放出來[14]。 然而，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，p22 蛋白位于病毒顆粒的內(nèi)膜和感染細(xì)胞的表面[15]。 目前，p22 蛋白在ASFV 感染致病過程中的作用仍不清楚。 本研究通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)并純化出p22 重組蛋白，通過免疫Balb/c 小鼠成功制備了其單克隆抗體(MAb)，為進(jìn)一步探究p22 蛋白的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株、載體及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大腸桿菌Trans5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；骨髓瘤細(xì)胞SP2/0、pET-32a 載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存；ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；SPF 級(jí)5～8 周齡Balb/c 雌性小鼠購自濟(jì)南朋悅試驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.2 主要試劑

質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、蛋白Marker 均購自賽默飛世爾科技公司；Ni-NTA Agarose 購自德國Qiagen 公司；單抗亞型鑒定試劑盒購自美國Southern Biotech公司；ECL 發(fā)光液、羊抗鼠HRP-IgG、羊抗豬HRPIgG 購自Beyotime 公司。

1.3 ASFV p22 蛋白的原核表達(dá)

1.3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-p22 的構(gòu)建 根據(jù)ASFV pig/HLJ/2018 株基因序列(GenBank No.MK333180.1)的KP177R基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，正向引物(p22-F)序列:5＇-CTCGAGTTATGCGTGTTTATGATTAC-3＇(包含XhoⅠ酶切位點(diǎn))， 反向引物(p22-R) 序列: 5＇ - GGATCCAAAAAACAGCAGCCGCCGA-3＇(包含BamHⅠ酶切位點(diǎn))，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 以合成的密碼子優(yōu)化后的p22基因序列為模板，使用引物擴(kuò)增目的基因片段，PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，5 min；94 ℃，45 s，58 ℃，45 s，72℃，45 s，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min；4 ℃結(jié)束。 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳并純化回收，用T4 DNA 連接酶分別將KP177R基因與pET-32a 載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Trans5α 中。 挑取單克隆搖菌，菌液經(jīng)PCR 鑒定為陽性后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。 測序成功后將陽性重組質(zhì)粒命名為pET-32a-p22。

1.3.2 ASFV p22 重組蛋白的表達(dá)和純化 將陽性重組質(zhì)粒pET-32a-p22 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆至LB 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜，取1 mL 菌液接種至氨芐青霉素(ampicillin，Amp)抗性的100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min 搖床培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6～0.8 時(shí)，添加終濃度為1 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)4 h 后，收集菌體沉淀，使用裂解液( 300 mmol/L NaCl， 50 mmol/L NaH2PO4，pH＝7.4)重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，4 ℃、4 000 r/min 離心，經(jīng)SDS-PAGE 電泳鑒定后使用0.45 μm 濾膜過濾，與蛋白純化填料4 ℃過夜結(jié)合。 采用親和層析的方式純化，收集洗脫產(chǎn)物，用于SDS-PAGE 鑒定，使用超濾管將有單一目的蛋白條帶的洗脫產(chǎn)物濃縮并置換到PBS中，-80 ℃保存。

1.3.3 ASFV p22 重組蛋白的Western blot 鑒定重組p22 蛋白純化后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，以ASFV 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(1∶1 000)作為一抗孵育2 h。清洗后，加入HRP 標(biāo)記的羊抗豬IgG 二抗(1∶8 000)孵育1 h，進(jìn)行Western blot 鑒定。

1.4 ASFV p22 單克隆抗體的制備

1.4.1 Balb/c 小鼠的免疫及血清效價(jià)的測定純化后的重組p22 蛋白與等體積弗氏完全佐劑乳化后，對(duì)4 只5～8 周齡Balb/c 小鼠進(jìn)行背部多點(diǎn)皮下注射，免疫劑量為100 μg/只，每14 d 免疫一次，共免疫3 次。 最后一次免疫7 d 后從小鼠尾靜脈取少量血，分離血清，通過間接ELISA 方法檢測血清中的抗體效價(jià)。 將純化的p22 重組蛋白以2 g/mL 的濃度包被到聚苯乙烯96 孔反應(yīng)板(100 μL/孔)，4 ℃放置過夜；次日用PBST 洗板3次后進(jìn)行封閉(l50 μL/孔封閉液)，室溫放置0.5 h；用樣品稀釋液將小鼠血清按1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1 ∶64 000，1∶128 000……進(jìn)行倍比稀釋，洗板3 次后加入稀釋好的血清并設(shè)置空白血清做陰性對(duì)照(100 μL/孔)，室溫孵育1 h；洗板3 次后加入HRP 標(biāo)記的鼠二抗(1∶5 000，100 μL/孔)，37 ℃孵育40 min；PBST 洗板5 次并拍干，加入TMB(100 μL/孔)，室溫避光顯色10 ～15 min；加入終止液(50 μL/孔)，用酶標(biāo)儀測定450 nm 處各孔的吸光值。

1.4.2 細(xì)胞融合及亞克隆篩選 按照標(biāo)準(zhǔn)流程取免疫后的小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 融合，通過間接ELISA 方法檢測篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，使用有限稀釋法對(duì)單克隆陽性孔進(jìn)行3 次亞克隆。 篩選出穩(wěn)定表達(dá)p22 的陽性孔，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4.3 腹水制備 將陽性雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并注射至Balb/c 小鼠的腹腔(經(jīng)弗氏不完全佐劑乳化)，7～10 d 后觀察小鼠腹部隆起狀況，并及時(shí)抽取腹水。 12 000 r/min 離心10 min，收集上清，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ASFV p22 單克隆抗體的鑒定

1.5.1 單克隆抗體效價(jià)鑒定 將進(jìn)行不同比例稀釋后的腹水作為一抗，HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，用重組p22 蛋白建立的間接ELISA 方法進(jìn)行效價(jià)的測定(方法同1.4.1)。

1.5.2 單克隆抗體亞型鑒定 用小鼠抗體亞型鑒定試劑盒對(duì)雜交瘤細(xì)胞制備的腹水抗體進(jìn)行亞型測定。 準(zhǔn)備好包被有重組p22 蛋白的板條(50 ng/孔)，每個(gè)克隆收集600 μL 腹水上清，分別滴加到6 個(gè)對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)孔中(100 μL/孔)，37 ℃孵育1 h；PBST 洗板3 次，將稀釋好的分型二抗抗IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 的抗體加入6個(gè)孔中，37 ℃孵育1 h；PBST 洗板3 次，加入TMB顯色，有信號(hào)反應(yīng)的孔對(duì)應(yīng)的鑒定二抗亞型即為該抗體的亞型。

1.5.3 Western blot 鑒定單克隆抗體的免疫原性純化的重組p22 蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，使用5%脫脂奶粉封閉2 h；PBST 洗膜后，加入單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；清洗后，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗孵育1 h，充分清洗后使用ECL 發(fā)光液進(jìn)行曝光，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-p22 的構(gòu)建

用p22-F/p22-R 引物對(duì)優(yōu)化的p22基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，PCR 擴(kuò)增后的p22基因片段約為447 bp，大小符合預(yù)期(圖1)。 通過酶切酶連將p22擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pET-32a 質(zhì)粒中。 經(jīng)測序分析后，基因測序結(jié)果完全正確。

圖1 p22 基因PCR 擴(kuò)增目的片段

2.2 重組p22 蛋白的表達(dá)和純化

SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示，與未誘導(dǎo)組相比，誘導(dǎo)組可見與預(yù)期大小一致的37 kDa 融合蛋白，經(jīng)超聲破碎后可溶性分析發(fā)現(xiàn)，重組p22 蛋白條帶出現(xiàn)在超聲后上清中，表明重組p22 蛋白為可溶性表達(dá)(圖2A)。 進(jìn)一步大量誘導(dǎo)p22 重組蛋白的表達(dá)，并與His Ni-NTA Agarose 親和層析柱結(jié)合，使用不同濃度梯度的咪唑洗脫液洗脫蛋白，收集洗脫液，隨后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳鑒定。 結(jié)果顯示，使用高濃度洗脫液時(shí)，在37 kDa 處出現(xiàn)單一條帶(圖2B)，純化后純度大于95%。

圖2 重組p22 蛋白的表達(dá)(A)、純化(B)及鑒定(C)

2.3 重組p22 蛋白的Western blot 鑒定

對(duì)重組p22 蛋白進(jìn)行Western blot 鑒定，通過His 標(biāo)簽抗體孵育后，在37 kDa 處檢測到嵌合His標(biāo)簽的p22 蛋白；而使用ASFV 陽性血清孵育后，發(fā)現(xiàn)重組p22 蛋白能夠與ASFV 陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合(圖2C)，表明該抗原具有良好免疫原性。

2.4 單克隆抗體的制備及鑒定

2.4.1 血清效價(jià)的測定 三免7 d 后通過間接ELISA 方法檢測接種小鼠血清效價(jià)，測得1、2、3號(hào)小鼠的血清效價(jià)為1∶128 000，4、5 號(hào)小鼠的血清效價(jià)為1∶64 000(圖3A)。 選取1、2、3 號(hào)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

圖3 小鼠血清效價(jià)(A)及單克隆抗體效價(jià)(B)的測定

2.4.2 單克隆抗體效價(jià)測定 在骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞融合后，進(jìn)行融合篩選，對(duì)篩選的陽性孔進(jìn)行3 次亞克隆后，經(jīng)間接ELISA 方法檢測，最終篩選到了兩株能夠穩(wěn)定分泌重組p22 MAb 的雜交瘤細(xì)胞株，通過小鼠腹腔注射兩種雜交瘤細(xì)胞株，制備了小鼠腹水，通過間接ELISA 方法測定腹水的效價(jià)分別為1∶512 000 和1∶256 000(圖3B)，將獲得的單克隆抗體命名為2D6 和5E7。

2.4.3 單克隆抗體亞型鑒定 采用美國Southern Biotech 公司的單抗亞型鑒定試劑盒分別對(duì)p22 MAb 2D6 和5E7 的亞型進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示兩種MAb 的亞型均為IgG1(表1)。

表1 單克隆抗體亞型鑒定

2.4.4 單克隆抗體的免疫反應(yīng)鑒定 為了鑒定MAb 2D6 和5E7 的免疫反應(yīng)性，通過Western blot檢測了其對(duì)外源性p22 蛋白的反應(yīng)性。 結(jié)果顯示，兩株MAb 均能夠在37 kDa 處與p22 蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)(圖4)。

3 討論與結(jié)論

自2018 年ASF 傳入中國并迅速傳播以來，ASF 對(duì)生豬生產(chǎn)造成了重大的經(jīng)濟(jì)威脅，目前，在中國傳播的ASFV 類型主要為一種高毒力的基因型Ⅱ毒株[16]，基因型Ⅰ毒株也有報(bào)道[17]。 ASFV在環(huán)境中具有高傳染性和穩(wěn)定性，可通過與受感染的豬或其產(chǎn)品直接接觸或通過軟蜱進(jìn)行傳播[18]。 直到目前，仍然沒有針對(duì)ASFV 的有效商業(yè)疫苗，使得非洲豬瘟的預(yù)防、控制和治療變得十分艱難[19]，因此，篩選ASF 免疫原性蛋白，鑒定免疫相關(guān)基因，將有助于ASF 疫苗的開發(fā)。 另外，需要對(duì)ASFV 的結(jié)構(gòu)功能等基礎(chǔ)研究進(jìn)行攻克，以期為ASF 疫苗或診斷試劑的研發(fā)提供更多理論依據(jù)。 相關(guān)研究表明，鑒定最具抗原性的病毒蛋白對(duì)改進(jìn)血清學(xué)診斷試驗(yàn)具有重要作用，在ASFV 血清診斷試驗(yàn)中使用重組蛋白作為抗原來源可避免操縱活病毒的潛在風(fēng)險(xiǎn)[20]。 p22 蛋白為ASFV 的結(jié)構(gòu)蛋白，根據(jù)序列分析比較，東歐等地區(qū)ASFV 分離株中的p22 序列保守，證明p22蛋白是抗原穩(wěn)定的，因此適合用作開發(fā)新的血清診斷試驗(yàn)的工具[21]。 目前對(duì)于p22 蛋白的功能研究尚不完善，其生物學(xué)功能仍待闡明。

原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡單、表達(dá)量高的特點(diǎn)，本研究中所用的原核表達(dá)載體pET-32a 可在BL21(DE3)細(xì)菌中高度表達(dá)，并且可以在裂解物的上清液中檢測到大量目標(biāo)蛋白，大大簡化了純化過程，同時(shí)避免了由包涵體的變性和復(fù)性可能引起的活性損失[22]。 雖然從構(gòu)象結(jié)構(gòu)上看，原核表達(dá)與真核表達(dá)的抗原會(huì)有差異，但不會(huì)影響抗原的線性表位[23]，因此，使用原核表達(dá)系統(tǒng)制備單克隆抗體仍可繼續(xù)進(jìn)行線性表位的篩選，為ASFV 結(jié)構(gòu)功能的研究提供生物學(xué)材料。

單克隆抗體(MAb)是診斷病毒感染的關(guān)鍵試劑。 與多克隆抗體相比，MAb 在現(xiàn)代免疫診斷的應(yīng)用中表現(xiàn)出特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢，在疾病預(yù)防、診斷、治療和流行病學(xué)調(diào)查等研究中發(fā)揮了巨大作用。 張馮禧等[24]通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得ASFV p30 重組蛋白并制備了MAb，效價(jià)為1∶102 400，表明該蛋白有良好的免疫原性。 齊艷麗等[25]通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化了ASFV p54重組蛋白并制備了MAb，抗體ELISA 效價(jià)均高于1∶25 600 且特異性良好。

本研究通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)并純化出一種可溶性重組蛋白p22，并制備了兩株針對(duì)該蛋白的MAb。 經(jīng)SDS-PAGE 和Western blot共同分析，重組蛋白大小約為37 kDa，將純化的重組蛋白做免疫原免疫小鼠，得到抗體的ELISA效價(jià)不低于1∶256 000，說明制備的MAb 具有良好的免疫原性，為p22 蛋白的結(jié)構(gòu)功能等基礎(chǔ)研究以及ASFV 免疫類診斷試劑產(chǎn)品的開發(fā)提供了重要的生物材料。