李珂云，陳水親，張 婷，黃瑜涵，肖子慶，黃彬紅，張文娟

（1. 贛南醫(yī)學院基礎醫(yī)學院；2. 贛南醫(yī)學院心腦血管疾病防治教育部重點實驗室；3. 贛南醫(yī)學院第一臨床醫(yī)學院，江西 贛州 341000）

肝纖維化是一種肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理性過程，通常由病毒、酒精和藥物等多種因素引起，是一種對肝臟受到持續(xù)性損傷后發(fā)生的一系列針對炎性刺激的慢性修復反應［1］。肝纖維化的特征是細胞外基質(zhì)的過度積累，形成纖維瘢痕并取代原有肝細胞，導致肝組織損傷和功能障礙。該過程涉及肝實質(zhì)細胞、肝星狀細胞（Hepatic stellate cells，HSCs）、肝巨噬細胞（Kupffer cells，KC）。全球患有肝纖維化的人數(shù)不斷增加。據(jù)統(tǒng)計，全球肝纖維化患者人數(shù)由2017 年的7.4 億人增加至2022 年的8.21 億人［2］。如果治療不及時，肝纖維化會持續(xù)進展為肝硬化［3］。我國作為肝病大國，目前約有700萬肝硬化患者。而肝纖維化作為早期肝損傷進展至肝硬化的過渡階段，是一種可逆的肝損傷，因此，該階段是阻止早期肝損傷發(fā)展為肝硬化的關鍵階段［4］。盡管肝纖維化的發(fā)病機制仍不清楚，但已有證據(jù)表明先天免疫反應在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

先天性免疫反應作為機體的第一道防線，通過抵御病原微生物感染，以維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［5］。當機體受到各種刺激時，免疫細胞的模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）識別細胞外的病原相關分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）或者細胞內(nèi)的損傷相關分子模式（Damage-associated molecular patterns，DAMPs）觸發(fā)先天免疫反應［6］。PRRs 分為胞膜型、內(nèi)體型、胞漿型和分泌型，而NLRP3 炎性小體屬于胞漿型PRRs［7］。NLRP3 炎性小體作為一種多蛋白復合物，表達于肝臟實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞中。其多蛋白復合物包括NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）、凋亡相關斑點樣蛋白（Apoptosisassociated specklike protein containing a CARD，ASC）和半胱天冬蛋白酶1 前體（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase1，pro-Caspase-1）。NLRP3 活化后，通過接頭蛋白ASC，募集pro-Caspase-1，形成NLRP3-ASC-pro-Caspase-1復合物，即NLRP3炎性小體［8］。NLRP3 炎性小體一旦形成，pro-Caspase-1 前體便發(fā)生自活化，形成Caspase-1［9］。Caspase-1 一方面可促使促炎細胞因子前體（比如：pro-IL-1β、pro-IL-18）成熟，形成成熟的白介素-1β（Interleukin，IL-1β）和白介素18（Interleukin-18，IL-18），另一方面可以剪切gasdermin D（GSDMD）的N 段片段，形成Gasdermin D-NT，Gasdermin 逐漸聚集在細胞膜上形成孔道［10］。IL-1β和IL-18通過孔道，釋放至細胞外，同時細胞發(fā)生焦亡［11］。

傳統(tǒng)觀點認為細胞焦亡是細胞代謝停止、結(jié)構(gòu)破壞和功能喪失的過程。這一過程對機體造成不可逆性的損害。然而，現(xiàn)在觀點認為細胞焦亡是機體正常的生理過程，且有利于機體穩(wěn)態(tài)的維持。比如：細胞焦亡有利于清除破壞的、有害的和冗余的細胞［12］。依據(jù)細胞死亡過程是否需要調(diào)控，將細胞死亡分為偶然性細胞死亡（Accidental cell death，ACD）和調(diào)節(jié)性細胞死亡（Regulatory cell death，RCD）［13］。ACD 是由物理、化學或者藥物等因素引起的不可避免的細胞死亡過程。RCD 是由多種分子參與調(diào)控的細胞死亡過程［14-15］。肝細胞的死亡伴隨有NLRP3 的活化和NLRP3 炎性小體的形成。NLRP3 炎性小體的不斷活化，促使肝臟不斷的愈合修復，形成肝臟纖維化。本文總結(jié)了NLRP3 炎性小體的結(jié)構(gòu)和活化機制，并闡述NLRP3 炎性小體和細胞焦亡在肝纖維化中的作用。

1 NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)

NLRP3 炎性小體由3 部分組成，即NLRP3、ASC 和pro-Caspase-1［16］。NLRP3 主要由3 種結(jié)構(gòu)域組成，羧基端（C 端）是富含亮氨酸的重復序列（Leucine-rich repeats，LRR）、中心端是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（Nucleotide-binding oligomerization domain，NOD，又名NACHT）、氨基端（N 端）是熱蛋白結(jié)構(gòu)域（Pyrin domain，PYD）。NLRP3 先通過LRR識別信號，再通過NACHT 的ATP 酶介導自身寡聚化，并經(jīng)由PYD 的凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）募集pro-Caspase-1形成NLRP3炎性小體。

2 NLRP3炎性小體的活化機制

NLRP3 可以被PAMPs 和DAMPs 活化。其中，PAMPs 涉及病原微生物（比如：金黃色葡萄球菌、腸道桿菌、寄生蟲等）、晶體成分（比如：草酸鈣、硅、石棉等）等。DAMPs 涉及代謝產(chǎn)物（比如：血糖、血脂等）、氧化型產(chǎn)物（比如：線粒體DNA 等）等［17-18］。目前NLRP3 炎性小體活化的途徑有3 條：“經(jīng)典”NLRP3 炎性小體活化途徑、“非經(jīng)典”NLRP3 炎性小體活化途徑［19］、“替代”NLRP3 炎性小體活化途徑［20］。

2.1 “經(jīng)典”NLRP3炎性小體活化途徑大多數(shù)觀點認為NLRP3 炎性小體的活化分為“準備階段”和“活化階段”。病原微生物及其產(chǎn)物通過相應受體（比如：Toll 樣受體、細胞因子受體）活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB），促使NLRP3、pro-Caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18 轉(zhuǎn)錄并翻譯。轉(zhuǎn)錄翻譯后，通過磷酸化、泛素化途徑，修飾上述蛋白分子［21］。這一過程為NLRP3 炎性小體活化提供物質(zhì)基礎，即為“準備階段”［8］。“活化階段”主要是NLRP3 被NLRP3 激動劑識別后，NLRP3、ASC、pro-Caspase-1 一起組裝成NLRP3 炎性小體，且發(fā)生活化。據(jù)報道，NLRP3 的活化過程受多種因素影響，比如：K+外流、Na+內(nèi)流、Cl-外流、Ca2+動員、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）等［22-26］。盡管這些因素都可以活化NLRP3炎性小體，但是NLRP3炎性小體尚沒有統(tǒng)一的活化機制。因此，NLRP3 炎性小體的活化途徑仍有待進一步研究。

2.2 “非經(jīng)典”NLRP3 炎性小體活化途徑與“經(jīng)典”途徑相比，NLRP3 炎性小體活化的“非經(jīng)典”途徑主要激活Caspase-11、Caspase-4、Caspase-5 等［27］。并且NLRP3 炎性小體的“非經(jīng)典”活化途徑并不是必須需要“準備階段”。小鼠細胞中Toll 樣受體（Toll-like Receptor Signaling，TLRs）/細胞因子受體刺激劑，先通過活化NF-κB，誘導Ⅰ型干擾素（type I interferon，I-IFN）產(chǎn)生，再通過JAK/STAT 信號通路/補體C3-C3R 軸，促使Caspase-11 的表達，這個過程需要“準備階段”。而人體細胞中Caspase-4 和Caspase-5的表達并不需要NLRP3炎性小體的“準備階段”［28］?；罨蟮腃aspase-11，可以剪切GSDMD的Asp276 位點?；罨蟮腃aspase-4、Caspase-5 可以剪切GSDMD 的Asp275 位點。GSDMD 被剪切后，可以釋放N 端的結(jié)構(gòu)域，成為GSDMD-NT。GSDMD-NT 可以與細胞膜上的心磷脂、磷脂酰肌醇磷酸鹽、磷脂酰絲氨酸結(jié)合，在細胞膜上形成孔道，同時細胞也發(fā)生焦亡。這一過程可以激活K+外流依賴的NLRP3炎性小體“經(jīng)典”活化途徑［29-30］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的氧化磷脂可以直接與小鼠細胞中的Caspase-11 結(jié)合，或直接與人體細胞中的Caspase-4、Caspase-5 結(jié)合，活化樹突狀細胞（Dendritic cells，DCs）中的NLRP3 炎性小體為“非經(jīng)典”活化途徑，但具體機制尚不完全清楚［31］。

2.3 “替代”NLRP3炎性小體活化途徑與NLRP3“經(jīng)典”和“非經(jīng)典”活化途徑相比，發(fā)現(xiàn)僅用TLRs激動劑處理也可以誘導人/豬單核細胞中的Caspase-1活化，而Caspase-1 依然可以誘導IL-1β 的成熟和分泌［32］。研究發(fā)現(xiàn)“替代”NLRP3 炎性小體活化途徑是LPS通過TLR4-TRIF-RIPK1-FADD-CAPS8信號通路直接活化NLRP3。與NLRP3 炎性小體“經(jīng)典”活化途徑相比，NLRP3 炎性小體“替代”活化途徑也有NLRP3-ASC-pro-Caspase-1 復合物的形成，但是沒有“典型”的ASC 斑點形成、K+外流和細胞焦亡［33-34］。載脂蛋白C3可以使TLR2/TLR4形成異源二聚體，通過TLR-SCIMP-Lyn-Syk-TRPM2 軸，導致Ca2+內(nèi)流、ROS 產(chǎn)生，活化NAPDH 氧化酶，最終活化Caspase-8［33］。Caspase-8是NLRP3炎性小體“替代”活化途徑的上游，但其確切機制有待進一步闡明。

3 NLRP3炎性小體活化在肝纖維化中的作用

肝纖維化是肝臟針對有害刺激的愈合修復反應。肝纖維化形成后，正常的肝細胞被破壞，出現(xiàn)大量的HSCs［1］。HSCs不斷增多，形成細胞外基質(zhì)覆蓋于肝臟［35］。肝纖維化形成過程中涉及多種細胞參與，如：肝實質(zhì)細胞、Kupffer細胞和肝星狀細胞［1］。這些細胞都表達NOD 樣受體（NOD-like receptors，NLRs），其中NLRP3 是NOD 樣受體中最常見的受體。肝纖維化發(fā)生時，肝實質(zhì)細胞、Kupffer 細胞和肝星狀細胞中都有NLRP3炎性小體的活化［36］。

3.1 肝實質(zhì)細胞與NLRP3 炎性小體活化肝臟中的主要細胞是肝實質(zhì)細胞，占據(jù)肝臟細胞總數(shù)的60%～80%。細菌、病毒、真菌作用于肝實質(zhì)細胞后，依賴于ROS、mtDNA、P2X7 途徑，促使肝實質(zhì)細胞合成pro-Caspase-1、pro-IL-1β 以及pro-IL-18［36］。NLRP3 炎性小體經(jīng)“經(jīng)典”活化途徑，啟動炎性反應，最終肝實質(zhì)細胞發(fā)生焦亡［11］。肝實質(zhì)細胞的焦亡，依次活化Kupffer細胞、肝星狀細胞，導致肝纖維化的發(fā)生［37］。

3.2 Kupffer 細胞與NLRP3 炎性小體活化Kupffer 細胞是位于肝竇內(nèi)的巨噬細胞，占肝臟非實質(zhì)細胞的10%～15%，全身巨噬細胞的80%～90%，通過分泌細胞因子發(fā)揮功能［1］。Kupffer 細胞活化后，可根據(jù)分泌細胞因子的不同，分為M1 型巨噬細胞和M2 型巨噬細胞［38］。M1 型巨噬細胞依賴NLRP3 炎性小體“經(jīng)典”活化途徑，分泌促炎細胞因子白介素6（Interleukin-6，IL-6）、白介素1（IL-1）、腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor -α，TNF-α），引起炎癥反應［39］。M2 型巨噬細胞在PAMPs 刺激下，分泌抗炎細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白介素10（IL-10），通過活化肝星狀細胞，修復損傷組織［39］。Kupffer 細胞中具有多種模式識別受體，比如：Toll 樣受體、清道夫受體、NOD 樣受體。這些受體識別PAMPs、DAMPs后，依賴NLRP3“經(jīng)典”活化途徑，活化NLRP3 炎性小體［39］。在氧化應激反應中，Kupffer 細胞依賴于ROS-TLR9 途徑，活化NLRP3 炎性小體［39］。研究表明Toll 的配體可以增強NLRP3 炎性小體的活化，比如LPS 識別TLR4 途徑，活化NLRP3 炎性小體［39］。TLR9 激動劑ODN1668 通過TLR9，也活化NLRP3 炎性小體［39］。Kupffer細胞中NLRP3炎性小體活化后，通過活化HSCs，參與肝纖維化過程［40］。

3.3 肝星狀細胞與NLRP3 炎性小體活化肝星狀細胞作為肝臟的非實質(zhì)細胞，位于肝臟的竇間隙，占肝臟細胞總數(shù)的8%～13%［41］。HSCs 是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵細胞［42］。HSCs 活化包括“啟動”和“持續(xù)”階段。“啟動階段”是HSCs 由靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，“持續(xù)階段”是肝纖維化形成階段［43］。肝臟受到刺激后，一方面肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞釋放的IL-1β 和IL-18，通過HSCs 表面的白介素1β 受體（Interleukin-1β receptors，IL-1βR）和白介素18 受體（Interleukin-18 receptors，IL-18R）進入HSCs；另一方面肝實質(zhì)細胞中的NLRP3 炎性小體可通過胞吞的方式進入HSCs［44］。HSCs 受到刺激后，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞。肌成纖維細胞可分泌α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ，形成細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM），導致肝纖維化［45-46］。研究［47］表明，在血吸蟲感染當天給予MCC950，可以抑制NLRP3 炎性小體活化，引起肝實質(zhì)細胞和Kupffer 細胞IL-1β和IL-18 釋放減少，同時HSCs 胞吞NLRP3 炎性小體減少，使得HSCs 的“啟動”和“活化”減弱，從而減輕肝纖維化。

4 細胞焦亡在肝纖維化中的作用

細胞焦亡依賴Caspase-1-Gasdermin D 路徑形成細胞膜孔道?？椎佬纬珊螅毎麅?nèi)容物被釋放，水分進入細胞內(nèi)，造成細胞腫脹，最終細胞發(fā)生焦亡［48］。細胞焦亡可“間接”或者“直接”參與肝纖維化的發(fā)生。細胞焦亡的“間接”途徑為焦亡細胞誘導肝細胞死亡。肝細胞死亡，可募集并活化單核細胞。單核細胞受到刺激后，可向M2 型Kupffer 細胞趨化［49］。M2 型Kupffer 細胞通過分泌TGF-β，活化HSCs?；罨腍SCs 是肝纖維化形成的核心細胞。細胞焦亡的“直接”途徑為焦亡細胞釋放的內(nèi)容物直接活化HSCs，促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

4.1 肝實質(zhì)細胞焦亡肝實質(zhì)細胞損傷是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的始發(fā)因素。肝實質(zhì)細胞受到損傷后，依賴NLRP3 炎性小體“經(jīng)典”活化途徑，在細胞膜表面形成Gasdermin D-NT，最終肝實質(zhì)細胞發(fā)生焦亡。肝實質(zhì)細胞的焦亡可以觸發(fā)Kupffer細胞、肝星狀細胞中NLRP3 炎性小體活化，最終活化HSCs 形成肝纖維化。Caspase-1 抑制劑可以抑制肝實質(zhì)細胞焦亡，進一步抑制HSCs活化，緩解肝纖維化［50］。

4.2 Kupffer 細胞焦亡Kupffer 細胞作為駐留在肝臟中的吞噬細胞，是肝臟抵御病原微生物的第一道防線，同時也是參與肝纖維化過程的重要細胞。Kupffer 細胞在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起到關鍵作用［51］。Kupffer 細胞焦亡，可促進肝纖維化發(fā)生發(fā)展，抑制Kupffer細胞焦亡，可減輕小鼠的肝纖維化。給予Kupffer 細胞LPS 后，在Kupffer 細胞中可見NLRP3 炎性小體和細胞膜上孔道形成，并出現(xiàn)Kupffer 細胞焦亡［52］。提前用不飽和脂肪酸——二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）和花生四烯酸 （Arachidonic acid，AA）干預后，再給予LPS，發(fā)現(xiàn)LPS 誘導的NLRP3 炎性小體活化減弱，且Kupffer細胞的焦亡情況減輕［53］。不飽和脂肪酸是G蛋白偶聯(lián)受體120（G-protein-coupled receptor 120，GPR120）的配體。研究發(fā)現(xiàn)，DHA 和AA 通過使GPR120從細胞膜向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移來減輕Kupffer 細胞焦亡［54］。Kupffer 細胞發(fā)生焦亡后，釋放的炎性細胞因子與HSCs細胞表面的受體結(jié)合，最終活化HSCs，導致肝纖維化。

4.3 肝星狀細胞焦亡HSCs中存在少量NLRP3炎性小體，當機體受到外界刺激時，細胞內(nèi)Caspase-1、GSDMD 被激活，并分泌促炎因子，誘導HSCs 焦亡，并且促使HSCs 轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，進一步誘導肝臟炎癥和肝纖維化［48］。促進HSCs 焦亡可減少膠原蛋白-Ⅰ和α-SMA 的含量，以及ECM 的形成和沉積，以減輕肝纖維化［55］。研究表明，酸敏感離子通道1a（Acid sensitive ion channels，ASIC1a）可以抑制酸誘導的肝纖維化中HSC 的焦亡，而Ca2+作為第二信使，由ASICa 運輸，參與HSCs 活化［56］。在酸性條件下ASIC1a 通道被打開，促進Ca2+進入細胞，與傳統(tǒng)認為的Ca2+內(nèi)流促進NLRP3炎性小體活化矛盾的是，該研究表明，Ca2+內(nèi)流減少了NLRP3炎性小體的組裝，引起gasdermin D 活性減弱以及IL-18 和IL-1β的釋放減少，從而減輕HSCs的焦亡，促進ECM 沉積加劇肝纖維化，而抑制ASIC1a可以促進細胞焦亡減少沉積以緩解肝纖維化［56］。

5 小結(jié)與展望

NLRP3 炎性小體是位于細胞質(zhì)中的多蛋白復合物，由天然免疫蛋白NLRP3、ASC 和pro-Caspase-1 組成。NLRP3 炎性小體表達于肝實質(zhì)細胞、Kupffer 細胞和肝星狀細胞中。當肝臟受到PAMPs/DAMPs刺激時，這些細胞中的NLRP3炎性小體發(fā)生活化。NLRP3 炎性小體的活化，可以使肝實質(zhì)細胞、Kupffer 細胞、HSCs 發(fā)生焦亡。NLRP3 炎性小體的活化和細胞焦亡共同參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。了解肝纖維化中NLRP3 炎性小體的活化機制和細胞焦亡，有助于開發(fā)以NLRP3 炎性小體/細胞焦亡相關分子為中心的藥物，為肝纖維化的治療提供新的治療靶點。