李泰運，廖 鈺，陳保平，周君怡，張 敏，劉品月

（湖南醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 懷化 418000）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是指起源于鼻咽腔表面上皮細(xì)胞或鼻咽隱窩上皮的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計該病80%發(fā)生在我國，尤其高發(fā)于湖南與兩廣地區(qū)，發(fā)病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首［1-2］。目前鼻咽癌治療手段多為放療結(jié)合化療的綜合治療，但其毒副作用大，易導(dǎo)致許多不良反應(yīng)和后遺癥［3-5］?，F(xiàn)代藥理和臨床研究表明姜在腫瘤治療方面具有很好的療效。6-姜烯酚（6-shogaol）是生姜和干姜中主要成分6-姜酚脫水形成的烷基酚類化合物，對多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用［6-8］。本文以人鼻咽癌CNE2 和HNE2 細(xì)胞為模型，探究6-姜烯酚是否對CNE2和HNE2細(xì)胞的增殖有抑制作用，進(jìn)一步拓展6-姜烯酚的抗腫瘤作用，為鼻咽癌的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑6-姜烯酚（上海源葉生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS）（Gibco 公司）；DMEM 培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific 公司）；CCK-8 試劑盒、RIPA 蛋白裂解液、Annexin V-FITC 試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；青-鏈霉素（Sigma 公司）；BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒（Bio-Rad 公司）；PCNA、Caspase-3、Occludin、E-cadherin 和Vimentin 的兔單克隆抗體（Cell Signaling Technology 公司）；增強型化學(xué)發(fā)光試劑盒（EMD Millipore公司）；GAPDH兔重組單克隆抗體和HRP-羊抗兔IgG 二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.1.2 細(xì)胞人鼻咽癌CNE2 和HNE2 細(xì)胞系（上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組CNE2和HNE2細(xì)胞分別用含有10%FBS、1%青-鏈霉素的DMEM 和PRMI 1640 培養(yǎng)基在5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%時，進(jìn)行傳代用于后續(xù)實驗。將CNE2和HNE2細(xì)胞分別分為CNE2空白組（CNE2-Blank）、CNE2對照組（CNE2-DMSO）、CNE2-6-姜烯酚處理組（CNE2-6-shogaol）；HNE2 空白組（HNE2-Blank）、HNE2 對照組（HNE2-DMSO）、HNE2-6-姜烯酚處理組（HNE2-6-shogaol）。細(xì)胞處理：CNE2 和HNE2 空白組細(xì)胞正常培養(yǎng)；CNE2和HNE2對照組細(xì)胞加入同體積DMSO；CNE2-6-姜烯酚處理組和HNE2-6-姜烯酚處理組在細(xì)胞中加入6-姜烯酚（25 μmol·L-1）。

1.2.2 半抑制濃度（IC50）測定CNE2-6-姜烯酚處理組和HNE2-6-姜烯酚處理組細(xì)胞各分為三組分別加入濃度為10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、30 μmol·L-1、40 μmol·L-1和50 μmol·L-1的6-姜烯酚溶液，5%CO2，37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h，每孔加入0.5%MTT溶液20 μL，4 h后終止培養(yǎng)，吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 的DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm 處測量各孔的吸光值，分析各濃度水平的劑量值（即IC50）和95%可信區(qū)間值。

1.2.3 CCK-8 法CNE2 和HNE2 細(xì)胞以濃度3×103個/孔接種于96孔板中。當(dāng)細(xì)胞完全貼壁后定義為0 h，在每孔中分別于0 h、24 h、36 h 和48 h 加入20 μL CCK-8溶液，將孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育2 h。使用Spectra Max M5 多功能微孔酶標(biāo)儀，450 nm 波長測定吸光度值（OD值）。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實驗取對數(shù)生長期的CNE2 和HNE2 細(xì)胞按2×105個·mL-1密度、每孔500 μL 接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞融合到90%左右時，用20 μL 的槍頭在孔中劃“井”字并吸出培養(yǎng)基，用PBS 沖洗2 次，將脫落的細(xì)胞洗掉，此時定義為傷口愈合0 h，對照組和6-姜烯酚處理組分別加入含有同體積的DMSO 或25 μmol·L-1的6-姜烯酚培養(yǎng)液，將細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后，觀察不同組CNE2和HNE2細(xì)胞遷移狀況，拍照并確定劃痕邊緣區(qū)域及相對距離，實驗結(jié)果通過Image J軟件分析細(xì)胞的遷移率。細(xì)胞遷移率＝（0 h劃痕面積-48 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡約1×105個·mL-1的CNE2 和HNE2 細(xì)胞接種于24 孔板中，培養(yǎng)24 h后，用DMSO 或終濃度為25 μmol·L-1的6-姜烯酚處理48 h，收集細(xì)胞。按照Annexin V-FITC 凋亡試劑盒說明書對細(xì)胞進(jìn)行染色，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析各組的細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達(dá)CNE2 細(xì)胞5×105個·mL-1接種于6 孔板中，待細(xì)胞生長達(dá)到50%匯合度時，用DMSO 或25 μmol·L-1的6-姜烯酚處理48 h 后，收集細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)RIPA 蛋白裂解液冰浴裂解30 min，4 ℃離心30 min，收集細(xì)胞裂解上清，經(jīng)BCA 法測定蛋白濃度。取大約20 μg 總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結(jié)束后，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。PVDF 膜用5% 脫脂奶粉封閉2 h，室溫孵育相應(yīng)一抗（PCNA、Caspase-3、occludin、E-ccadherin 和vimentin）2 h，隨后，室溫孵育二抗1 h，免疫化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行蛋白顯影。使用Image J軟件測定分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均來自3 次獨立重復(fù)實驗，并以表示。SPSS 19.0和GraphPad Prism 7進(jìn)行統(tǒng)計分析。多組定量資料比較用單因素方差分析，兩組間多重比較用Dunnett'st檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6-姜烯酚半抑制濃度（IC50）測定6-姜烯酚的IC50為26.94 μmol·L-1，95%可信區(qū)間（95%CI）為24.22～29.71 μmol·L-1（圖1）。后期的實驗均用25 μmol·L-16-姜烯酚處理CNE2和HNE2細(xì)胞。

圖1 6-姜烯酚對CNE2細(xì)胞的IC50

2.2 6-姜烯酚對鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響與空白組比較，對照組OD 值均無明顯差異；與對照組比較，CNE2-6-姜烯酚和HNE2-6-姜烯酚處理組24 h、36 h 和48 h 的OD 值均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 CCK-8分析6-姜烯酚對鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響

2.3 6-姜烯酚對鼻咽癌細(xì)胞遷移的影響6-姜烯酚處理CNE2和HNE2細(xì)胞后48 h后，CNE2空白組、CNE2 對照組、HNE2 空白組和HNE2 對照組中的劃痕面積縮小，但CNE2-6-姜烯酚處理組和HNE2-6-姜烯酚處理組劃痕面積仍較大。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，空白組和對照組中細(xì)胞遷移率均達(dá)90%以上，而6-姜烯酚后細(xì)胞遷移率約為75%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 6-姜烯酚對鼻咽癌細(xì)胞遷移的影響

2.4 6-姜烯酚對鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響CNE2空白組細(xì)胞凋亡率為5.01%，CNE2 對照組細(xì)胞凋亡率為6.15%，兩組間無明顯差異；但CNE2-6-姜烯酚處理組細(xì)胞凋亡率為9.23%，明顯高于對照組。HNE2 空白組細(xì)胞凋亡率為3.33%，CNE2 對照組細(xì)胞凋亡率為5.73%，兩組間無明顯差異；但CNE2-6-姜烯酚處理組細(xì)胞凋亡率為10.91%，明顯高于對照組（圖4）。

2.5 6-姜烯酚對鼻咽癌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，CNE2-6-姜烯酚處理組細(xì)胞Caspase-3表達(dá)明顯增加，PCNA 蛋白表達(dá)明顯減少，Vimentin蛋白表達(dá)明顯減少，而Occludin和E-cadherin的表達(dá)量顯著增加（圖5）。

圖5 6-姜烯酚對CNE2細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

鼻咽癌是我國常見的頭頸部惡性腫瘤，早期多采用放療為主的方法治療。但由于鼻咽腔位置隱蔽和臨床癥狀表現(xiàn)多樣，約75%的患者確診即處于中晚期，必須采用放療、化療和分子靶向治療的綜合治療策略［9］。經(jīng)綜合治療后，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性鼻咽癌（R/M NPC）的預(yù)后仍非常差，中位總生存期（OS）約為20 個月［10］。中藥有效成分抗腫瘤的開發(fā)與應(yīng)用已成為研究熱點。生姜是我國常用的藥食兩用植物，廣泛用于治療感冒、風(fēng)濕、關(guān)節(jié)炎、高血壓和消化系統(tǒng)等疾?。?1-12］。生姜中主要的活性成分是姜酚及姜辣素，遇熱后姜酚可通過脫水反應(yīng)生成6-姜烯酚［13-14］。有研究［15-20】表明，6-姜烯酚具有防治心血管疾病、老年癡呆、胃潰瘍，抗肝炎病毒、恢復(fù)因脊髓損傷所致的運動功能障礙等多種生物學(xué)活性。除此之外，6-姜烯酚對多種不同腫瘤細(xì)胞的增殖具有明顯的體外抑制作用，并通過抑制侵襲遷移、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期誘導(dǎo)凋亡、調(diào)控相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)等多種機制發(fā)揮抗腫瘤或逆轉(zhuǎn)耐藥的效用［21］。在本研究中，我們通過CCK-8 法檢測到6-姜烯酚處理組CNE2 和HNE2 細(xì)胞增殖率都明顯下降，Western blot 也檢測到6-姜烯酚處理組PCNA 蛋白表達(dá)量明顯減少。因此，6-姜烯酚可以有效抑制CNE2 和HNE2細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的最常見方式［22］。因此，調(diào)控凋亡相關(guān)基因或其產(chǎn)物，提高腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡是腫瘤治療取得成功的關(guān)鍵之一。RAY A 等［23］發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚對乳腺癌細(xì)胞可造成不可逆的G2/M期周期阻滯，通過激活細(xì)胞的自噬作用、降低蛋白Hes1 和Cyclin D1 的表達(dá)等，有效誘導(dǎo)其凋亡，并對非腫瘤細(xì)胞無抑制作用。SAHA A 等［24］發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚通過提高Caspase-7 的表達(dá)以及促進(jìn)PARP 失活等機制誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞凋亡。PAN M H 等［25］發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚可活化Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9，調(diào)高GADD153 表達(dá)誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。由此可見，6-姜烯酚能通過調(diào)控多條信號通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，6-姜烯酚處理后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到CNE2和HNE2細(xì)胞凋亡率明顯提高，且經(jīng)Western blot 檢測細(xì)胞中Caspase-3 蛋白表達(dá)也有明顯增加。提示6-姜烯酚也可促進(jìn)鼻咽癌CNE2和HNE2細(xì)胞的凋亡。

鼻咽癌細(xì)胞極易發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲是鼻咽癌預(yù)后不良的重要因素［26］。多項研究［27-30］表明，6-姜烯酚可以顯著抑制肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究用6-姜烯酚處理鼻咽癌CNE2和HNE2細(xì)胞后，通過細(xì)胞劃痕實驗分析發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚能明顯抑制鼻咽癌CNE2 和HNE2 細(xì)胞的遷移，且Western blot結(jié)果表明細(xì)胞間質(zhì)相關(guān)蛋白Vimentin表達(dá)下降，同時細(xì)胞上皮相關(guān)蛋白Occludin和E-cadherin蛋白表達(dá)顯著增加。提示6-姜烯酚能逆轉(zhuǎn)人鼻咽癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制其遷移。

由這些結(jié)果可推測6-姜烯酚通過逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制其增殖和遷移并誘導(dǎo)其凋亡。因此，我們認(rèn)為6-姜烯酚是潛在治療鼻咽癌的中藥有效成分，或可成為鼻咽癌治療的研究新方向，但其具體的分子機制和應(yīng)用仍需進(jìn)一步研究。