候夢賞，梁 鋮，展 江，秦加敏，鄧尚靠，宗德琴，李志國

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101；2.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福建 福州 350002）

球囊菌是一種蜜蜂真菌性病害，會導(dǎo)致意大利蜜蜂幼蟲患白堊病，球囊菌通過孢子侵染意大利蜜蜂幼蟲，進(jìn)入幼蟲腸道后，迅速萌發(fā)生長，分泌胞外蛋白酶，破壞幼蟲腸道壁與圍食膜，侵染后期，球囊菌孢子進(jìn)入幼蟲后腸，菌絲生長穿透體壁，幼蟲縮水形成子實(shí)體，導(dǎo)致蜂群幼蟲大量死亡，嚴(yán)重影響蜂群正常生存[1]。白堊病自首次在歐洲蜂群發(fā)現(xiàn)后[2]，迅速傳播到美洲、亞洲等地蜂群中，直至在全世界的意大利蜜蜂養(yǎng)殖區(qū)都有白堊病的存在[3]。

蜜蜂作為一種社會性昆蟲，細(xì)胞免疫和體液免疫是其抵御外來致病因子的主要免疫體系，而蜜蜂抗菌肽的分泌更是抵抗致病菌的重要免疫應(yīng)答模式[4]。研究表明，將1×105個球囊菌孢子接種意大利蜜蜂幼蟲后，幼蟲腸道抗菌肽基因abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin均顯著上調(diào)表達(dá)[5]；接種球囊菌后，意大利蜜蜂幼蟲在化蛹期死亡率高達(dá)76%[6]，未接種球囊菌幼蟲組無死亡，球囊菌侵染后對幼蟲致死率較高。蜜蜂腸道中有5 種核心菌群，包括革蘭氏陽性的乳桿菌屬LactobacillusFirm-4 與LactobacillusFirm-5，革蘭氏陰性菌的Snodgrassella alvi與Gilliamella apicola，及雙歧桿菌的Bifidobacteriumspp[7]。近年來，大量研究表明，腸道菌群對蜜蜂具有重要的生理功能，蜜蜂腸道中存在大量共生菌，與宿主形成互利共生的關(guān)系，腸道菌群可以幫助蜜蜂消化代謝花粉，調(diào)節(jié)腸道生理環(huán)境，維護(hù)蜜蜂正常發(fā)育，參與宿主的免疫調(diào)控等[8-10]。

關(guān)于球囊菌侵染對意大利蜜蜂的影響研究已有較多報(bào)道，如免疫應(yīng)答[11]、侵染過程[12]、轉(zhuǎn)錄組學(xué)測定[13]、抗白堊病如SNP 篩選等方向[14]。但這些研究多為球囊菌侵染蜜蜂幼蟲的研究，而關(guān)于球囊菌侵染對意大利蜜蜂成年工蜂的影響報(bào)道較少。而球囊菌孢子是通過意大利蜜蜂成年工蜂傳播到幼蟲體內(nèi)的，所以蜂群中意大利蜜蜂成年工蜂體內(nèi)也含有一定量的球囊菌孢子，意大利蜜蜂成年工蜂作為球囊菌的攜帶者和傳播者。球囊菌侵染對意大利蜜蜂成年工蜂無明顯的致病性，但是對意大利蜜蜂個體免疫、腸道菌群及存活率的影響報(bào)道尚少。為此，通過球囊菌侵染意大利蜜蜂成年工蜂后，探究意大利蜜蜂成年工蜂個體免疫、發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，腸道菌群及存活率的變化，以期尋找意大利蜜蜂成年工蜂抵御球囊菌侵染的機(jī)制，為白堊病的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用意大利蜜蜂取自福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院）實(shí)驗(yàn)蜂場，試驗(yàn)蜂群經(jīng)箱外觀察及PCR檢測無白堊病發(fā)生。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：TaKaRa 公司的PrimeScript ?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒與SYBR?Premix ExTaq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）試劑盒；Ambion 公司的RNA Trizol；國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司的異丙醇、氯仿與無水乙醇等。主要儀器：Thermo Scientific 公司的NanoDrop 2000 型分光光度計(jì)；Applied Biosystems 公司的低溫高速離心機(jī)與梯度PCR 儀；BIORAD 公司的熒光定量PCR儀；上海一恒科學(xué)儀器有限公司的恒溫恒濕培養(yǎng)箱；上海培清科技有限公司的全自動凝膠成像分析儀JS-690D型。

1.3 純化球囊菌孢子接種意大利蜜蜂成年工蜂

從患白堊病的蜂群中收集白堊病蟲尸，參考關(guān)于球囊菌的純化培養(yǎng)方法[15]，使用次氯酸鈉溶液清洗表面的雜菌，蟲尸切塊置于MY-20 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)出雪花狀的球囊菌菌絲（圖1），2 次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)獲得黑色的球囊菌孢子，收集球囊菌孢子，使用研磨儀充分研磨破壁，獲得球囊菌孢子懸浮液，血球計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)孢子液濃度。

圖1 球囊菌菌絲Fig.1 The mycelium of Ascosphaera apis

在3 個健康蜂群中取3 張成熟意大利蜜蜂子脾，放入恒溫培養(yǎng)箱中，標(biāo)記每天剛出房的1日齡意大利蜜蜂，放入蜂群中飼養(yǎng)至6 日齡，收取12 盒意大利蜜蜂，每盒40 頭，在恒溫培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。處理組飼喂含球囊菌4×106個/mL的30%蔗糖溶液，對照組飼喂30%蔗糖溶液，供蜜蜂自由取食。處理組意大利蜜蜂連續(xù)飼喂3 d 含球囊菌孢子的蔗糖溶液，第4 天起處理組與對照組飼喂同樣的不含球囊菌孢子的30%蔗糖溶液。分別收集飼養(yǎng)4 d 與8 d 的意大利蜜蜂中腸與后腸，-80 ℃冰箱保存用以后續(xù)試驗(yàn)。

另外收取6 日齡意大利蜜蜂4 盒，對照組與處理組各3盒，處理組意大利蜜蜂連續(xù)飼喂3 d含球囊菌孢子4×106個/mL 的30%蔗糖溶液，第4 天以后飼喂30%蔗糖溶液，對照組一直飼喂30%蔗糖溶液，每天更換新鮮蔗糖溶液，記錄每天意大利蜜蜂的死亡數(shù)量，統(tǒng)計(jì)分析球囊菌侵染對成年意大利蜜蜂工蜂存活率的影響。

1.4 RNA提取與熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測

通過TRIzol 法提取意大利蜜蜂腸道的RNA，測定RNA 濃度后保存于-80 ℃冰箱中。使用TaKaRa公司的PrimeScript ?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，在PCR 管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，總RNA 1.0 μL，無核酸酶ddH2O 6.0 μL。在PCR 儀中42 ℃反應(yīng)2 min。反應(yīng)結(jié)束后，向反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中分別加入PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4 μL，無核酸酶ddH2O 4 μL，共20 μL 體系，反應(yīng)程序：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃保存。

使用TaKaRa 公司的SYBR?Premix ExTaq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。在冰盒上配制反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）5 μL，PCR 上游引物、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，DNA 模板1 μL，無核酸酶ddH2O 3.2 μL，共10 μL 反應(yīng)體系。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個循環(huán)；4 ℃保存。

1.5 意大利蜜蜂工蜂中腸與后腸球囊菌含量測定

取1.3 中收集的意大利蜜蜂中腸與后腸，分別提取意大利蜜蜂中腸與后腸的DNA，使用熒光定量PCR 檢測意大利蜜蜂中腸與后腸的球囊菌含量。使用TaKaRa 公司的SYBR?Premix ExTaq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）試劑盒進(jìn)行球囊菌含量測定，上游引物序列：5′-TCTGGCGGCCGGTTAAAGGCTTC-3′，下游引物序列：5′-GTTTCAAGACGGGCCACAAAC-3′，反應(yīng)體系與反應(yīng)條件參考試驗(yàn)方法1.4。

1.6 球囊菌侵染對意大利蜜蜂成年工蜂中腸免疫發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響測定

取1.3 中收集的意大利蜜蜂中腸樣本，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR 檢測球囊菌侵染對意大利蜜蜂中腸免疫發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響，引物序列如表1 所示，反應(yīng)體系與反應(yīng)條件參考試驗(yàn)方法1.4。

表1 意大利蜜蜂成年工蜂中腸免疫與發(fā)育相關(guān)基因引物Tab.1 Gene primers related to midgut immune and development in adult workers of Apis mellifera ligustica

1.7 球囊菌侵染對意大利蜜蜂成年工蜂腸道菌群含量的影響測定

取1.3 中收集的意大利蜜蜂后腸樣本，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR 檢測球囊菌侵染對意大利蜜蜂腸道菌群含量的影響，引物序列如表2所示，反應(yīng)體系與反應(yīng)條件參考試驗(yàn)方法1.4。

表2 意大利蜜蜂成年工蜂腸道菌群相關(guān)基因引物Tab.2 Gene primers related to intestinal flora in adult workers of Apis mellifera ligustica

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21.0 軟件的Kaplan-Meier 生存函數(shù)對球囊菌侵染意大利蜜蜂成年工蜂的生存數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制意大利蜜蜂成年工蜂的生存曲線圖。以Actin為內(nèi)參基因，利用Ct 值法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量（2-△△Ct），并通過T檢驗(yàn)進(jìn)行基因差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 球囊菌侵染對意大利蜜蜂成年工蜂存活率的影響

對意大利蜜蜂成年工蜂的生存數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，連續(xù)3 d 接種球囊菌孢子對意大利蜜蜂成年工蜂存活率無顯著影響（χ2=0.133，P=0.715）。但從生存曲線可以看出，籠養(yǎng)后18～30 d，接種球囊菌組意大利蜜蜂成年工蜂的生存率與對照組相比有下降趨勢（圖2）。

圖2 球囊菌侵染后意大利蜜蜂成年工蜂存活率Fig.2 Survival rate of worker bees in Apis mellifera ligustica after infection by Ascosphaera apis

2.2 球囊菌侵染對意大利蜜蜂成年工蜂中腸與后腸球囊菌含量的影響

通過qRT-PCR 測定球囊菌侵染后意大利蜜蜂成年工蜂中腸與后腸球囊菌含量，結(jié)果如圖3所示。接種球囊菌孢子4 d 后，意大利蜜蜂成年工蜂后腸球囊菌孢子含量顯著高于中腸球囊菌孢子含量（P＜0.05）；接種球囊菌孢子8 d后，意大利蜜蜂工蜂后腸球囊菌孢子含量顯著高于中腸球囊菌孢子含量（P＜0.01）；接種球囊菌孢子4 d后，意大利蜜蜂工蜂中腸與后腸球囊菌孢子含量分別顯著高于接種球囊菌孢子8 d 意大利蜜蜂工蜂中腸與后腸（P＜0.05）。對照組意大利蜜蜂中腸與后腸均未檢測到球囊菌存在。

圖3 球囊菌侵染對意大利蜜蜂成年工蜂腸道球囊菌含量的影響Fig.3 Effect of Ascosphaera apis infection on intestinal Ascosphaera apis content in adult workers of Apis mellifera ligustica

2.3 球囊菌侵染對意大利蜜蜂成年工蜂免疫發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖4 所示，接種球囊菌孢子4 d 后，與對照組相比，處理組意大利蜜蜂成年工蜂免疫相關(guān)基因abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin、GNBP-1和IMD均顯著上調(diào)表達(dá)（P＜0.05），PGRP-S1、PGRP-S2、PGRP-S3、PGRP-LC、GNBP-2、PPOact、relish表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05），catus表達(dá)有下調(diào)趨勢但并不顯著（P＞0.05）；發(fā)育相關(guān)基因VGMC、usp、kr-h1、AMHex10869相對表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05）。接種球囊菌孢子8 d 后，與對照組相比，處理組意大利蜜蜂成年工蜂免疫相關(guān)基因abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin、GNBP-1、IMD、PGRP-S1、PGRP-S2、PGRP-S3、PGRP-LC、GNBP-2、PPOact和relish的相對表達(dá)量均無顯著差異（P＞0.05）；發(fā)育相關(guān)基因VGMC、usp、kr-h1、AMHex10869相對表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05）。

圖4 球囊菌侵染對意大利蜜蜂成年工蜂免疫與發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Ascosphaera apis infection on the expression of immune and development genes in the workers of Apis mellifera ligustica

2.4 球囊菌侵染對意大利蜜蜂成年工蜂腸道菌群的影響

如圖5 所示，意大利蜜蜂成年工蜂接種球囊菌孢子4 d后，與對照組相比，腸道菌Snodgrassella alvi與Bifidobacteriumspp的含量有下降趨勢，Gilliamella apicola、LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5 與腸道總菌量U16S rRNA 的含量有上升趨勢，其中LactobacillusFirm-4 與U16S rRNA 的含量顯著上升（P＜0.05）；意大利蜜蜂成年工蜂接種球囊菌孢子8 d后，與對照組相比，Snodgrassella alvi與腸道菌總量U16S rRNA 的含量有下降趨勢，其中U16S rRNA 的含量顯著下降（P＜0.05），Gilliamella apicola、LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5 與Bifidobacteriumspp 的含量有上升趨勢，其中LactobacillusFirm-5的含量顯著上升（P＜0.05）。

圖5 球囊菌侵染對意大利蜜蜂成年工蜂腸道菌群的影響Fig.5 Effect of Ascosphaera apis infection on intestinal flora in the workers of Apis mellifera ligustica

3 結(jié)論與討論

本研究中將4×106個/mL 的球囊菌孢子連續(xù)3 d接種6 日齡意大利蜜蜂成年工蜂，對意大利蜜蜂成年工蜂的存活率無顯著影響，對意大利蜜蜂成年工蜂無明顯致病性，與前人研究具有相似結(jié)果[28]。球囊菌對成年蜜蜂無明顯致病性，不會導(dǎo)致成年蜜蜂患白堊病，也不會顯著影響成年蜜蜂的存活率，成年蜜蜂只是球囊菌在蜂群傳播的載體，球囊菌通過成年蜜蜂給小幼蟲飼喂食物侵染幼蟲，導(dǎo)致幼蟲患白堊病，球囊菌經(jīng)口進(jìn)入意大利蜜蜂腸道，球囊菌在蜜蜂幼蟲腸道內(nèi)萌發(fā)生長，首先破壞蜜蜂腸道，影響蜜蜂的個體免疫系統(tǒng)，其次蜜蜂中腸是蜜蜂個體免疫、分泌抗菌肽的重要器官，蜜蜂腸道核心菌群主要存在于成年蜜蜂的后腸中。因此，本研究選用意大利蜜蜂成年工蜂的中腸進(jìn)行免疫、發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)測定，選用意大利蜜蜂成年工蜂的后腸做腸道菌群豐度檢測。

將球囊菌接種意大利蜜蜂成年工蜂后，qRTPCR 檢測結(jié)果表明，接種4 d 后，蜜蜂后腸球囊菌含量顯著高于中腸球囊菌含量；接種8 d 后，蜜蜂中腸球囊菌含量接近于0，蜜蜂后腸球囊菌含量顯著高于中腸球囊菌含量；接種4 d 后的蜜蜂后腸球囊菌含量顯著高于接種8 d 的后腸球囊菌含量。以上研究結(jié)果表明，球囊菌進(jìn)入意大利蜜蜂成年工蜂腸道后，并不能破壞蜜蜂中腸，不能在中腸內(nèi)生長繁殖，被迅速排到蜜蜂后腸中，經(jīng)過時(shí)間的推移，蜜蜂后腸的球囊菌含量也會降低，蜜蜂可能通過排泄方式排出一部分球囊菌孢子，且球囊菌孢子不能在蜜蜂后腸快速生長繁殖，球囊菌在蜜蜂腸道中何時(shí)無明顯檢測信號，仍需后續(xù)研究證實(shí)。球囊菌侵染意大利蜜蜂幼蟲后，球囊菌孢子會迅速在幼蟲中腸內(nèi)萌發(fā)生長，在幼蟲化蛹時(shí)，菌絲從后腸穿透幼蟲體壁，導(dǎo)致幼蟲死亡。而球囊菌不能在意大利蜜蜂成年工蜂腸道內(nèi)迅速生長繁殖可能是腸道內(nèi)環(huán)境不同及蛹變過程導(dǎo)致的，球囊菌孢子的萌發(fā)需要厭氧環(huán)境，菌絲的生長又需要有氧環(huán)境[29-30]，而意大利蜜蜂幼蟲的腸道滿足球囊菌孢子萌發(fā)生長的環(huán)境，但是意大利蜜蜂成年工蜂的腸道與幼蟲期不同，導(dǎo)致球囊菌孢子不能萌發(fā)生長；幼蟲在化蛹時(shí)期，體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)豐富，脂肪體細(xì)胞降解為更易吸收小顆粒物質(zhì)，轉(zhuǎn)化期的幼蟲免疫系統(tǒng)、腸道、體壁等的防御系統(tǒng)大大降低[12]，導(dǎo)致這個時(shí)期的幼蟲對球囊菌防御力大大降低，而意大利蜜蜂成年工蜂沒有這個時(shí)期，更減弱了球囊菌對成年蜜蜂的危害。

球囊菌侵染意大利蜜蜂成年工蜂前期會引起成年工蜂的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致IMD 通路上調(diào)，蜜蜂中腸免疫相關(guān)基因abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin、GNBP-1等均顯著上調(diào)表達(dá)；侵染后期意大利蜜蜂成年工蜂中腸內(nèi)球囊菌含量接近于0，蜜蜂中腸免疫相關(guān)基因abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin、GNBP-1等與未侵染組無顯著差異，機(jī)體恢復(fù)到正常水平；球囊菌侵染前期與后期，意大利蜜蜂成年工蜂發(fā)育相關(guān)基因VGMC、usp、kr-h1、AMHex10869與未侵染組相比無顯著差異，球囊菌侵染不會影響意大利蜜蜂成年工蜂的發(fā)育。蜜蜂抗菌肽是蜜蜂機(jī)體抵御致病因子重要的免疫效應(yīng)分子，對病原微生物具有廣譜的活性，能有效抑制細(xì)菌、真菌等病原微生物的生長繁殖[31-33]，抗菌肽分子還可以與沒有特異性受體的細(xì)胞膜結(jié)合，使病原微生物不容易產(chǎn)生抗藥性[34]，農(nóng)藥[35]、細(xì)菌[36]、真菌[37]、病毒[38]等脅迫蜜蜂個體后，均會使抗菌肽基因高表達(dá)，免疫通路IMD 等上調(diào)表達(dá)，抗菌肽分子大量產(chǎn)生以應(yīng)對病原微生物的脅迫。

意大利蜜蜂幼蟲腸道內(nèi)尚未形成腸道菌群，直到意大利蜜蜂成年工蜂6日齡才能形成完整的腸道菌群[27,39]。本研究將球囊菌孢子接種6 日齡意大利蜜蜂成年工蜂，接種4 d 后，蜜蜂腸道菌Snodgrassella alvi與Bifidobacteriumspp 的含量有下降趨勢，Gilliamella apicola、LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5 與腸道菌總量U16S rRNA 的含量有上升趨勢；接種8 d 后，與對照組相比，Snodgrassella alvi與腸道菌總量U16S rRNA 的含量有下降趨勢，Gilliamella apicola、LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5 與Bifidobacteriumspp 的含量有上升趨勢。前人研究表明，以色列蜜蜂麻痹病毒（IAPV）侵染意大利蜜蜂成年工蜂后會影響腸道菌Snodgrassella alvi的含量，IAPV 病毒與腸道菌Snodgrassella alvi含量呈顯著負(fù)相關(guān)[40]；蜂螨侵染15日齡意大利蜜蜂工蜂后，蜜蜂腸道中的Lactobacillus菌群含量明顯升高[41]；蜜蜂微孢子蟲侵染也會導(dǎo)致蜜蜂腸道內(nèi)的Bifidobacteriumspp 菌群含量顯著降低[42]。以上研究結(jié)果均表明，真菌、病毒、寄生蟲等外源性致病因子會影響蜜蜂腸道菌群含量，外源性致病因子侵染蜜蜂后，可能與寄主腸道菌群競爭能量和營養(yǎng)物質(zhì)，影響腸道菌群的穩(wěn)定，另外蜜蜂腸道菌群可以與蜜蜂的免疫系統(tǒng)協(xié)同作用抵御致病因子的入侵，在LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5、Snodgrassella alvi與Gilliamella apicola菌群的免疫應(yīng)激下，蜜蜂機(jī)體會產(chǎn)生免疫反應(yīng)產(chǎn)物抗菌肽abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin[43-44]，蜜蜂腸道內(nèi)的Bifidobacteriumspp 菌群的活性與病原因子活性呈顯著負(fù)相關(guān)，Bifidobacteriumspp 菌群可能也參與蜜蜂個體的免疫調(diào)節(jié)[45]。

綜上，球囊菌孢子接種意大利蜜蜂成年工蜂后，對意大利蜜蜂成年工蜂的存活率無顯著影響；球囊菌孢子在成年工蜂中腸內(nèi)不能快速萌發(fā)生長，會經(jīng)過蜜蜂后腸排出體外；球囊菌侵染前期會導(dǎo)致意大利蜜蜂成年工蜂免疫基因上調(diào)，抗菌肽基因高表達(dá)，侵染后期對意大利蜜蜂成年工蜂無顯著影響，對發(fā)育相關(guān)基因無顯著影響；球囊菌侵染會影響意大利蜜蜂成年工蜂腸道菌群的穩(wěn)定及腸道核心菌群的含量。