謝羽恬，張新業(yè)，2，3，蘇彥蘋，3，吳 雙，張澤銀，褚卓棟，3，馮 雪，3，孫艷香，3

（1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北 廊坊 065000；2.河北省動(dòng)物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 廊坊 065000；3.廊坊市資源植物與應(yīng)用生物技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 廊坊 065000）

多胺（PA）是一類含有2 個(gè)或以上氨基的低分子質(zhì)量脂肪族胺類化合物，廣泛分布于生物體內(nèi)[1]，其能夠參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，且與逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)[2]。根據(jù)氨基數(shù)目的不同，可將PA分為二元胺[如腐胺（Put）]、三元胺[如亞精胺（Spd）]、四元胺[如精胺（Spm）]等[3]。

植物細(xì)胞內(nèi)的PA 濃度可以通過(guò)生物合成、降解代謝及跨膜運(yùn)輸?shù)韧緩竭M(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，對(duì)于維持植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[4-5]。PA 主要通過(guò)二胺氧化酶（DAO，EC 1.4.3.6）及多胺氧化酶（PAO，EC 1.5.3.11）進(jìn)行氧化分解[6]。DAO 內(nèi)含有Cu2+，又稱銅胺氧化酶（CuAO），能夠催化Put降解產(chǎn)生4-氨基丁醛、H2O2和氨，其在擬南芥中亦可催化Spd的降解代謝[7]。PAO以FAD作為輔因子[1]，一方面能夠通過(guò)末端分解代謝催化Spd、Spm 生成1，3-二氨基丙烷（DAP）、H2O2及4-氨基丁醛或N-（3-氨基丙基）-4-氨基丁醛，另一方面又可通過(guò)反向轉(zhuǎn)化途徑將Spm、Spd 分別轉(zhuǎn)化為Spd、Put，并生成3-氨基丙醛和H2O2[8-9]。

PAO 編碼基因通常以基因家族的形式存在于植物基因組中。到目前，擬南芥（Arabidopsis thaliana）[10]、水稻（Oryza sativa）[11]、甜橙（Citrus sinensis）[12]、番茄（Solanum lycopersicum）[13]、蘋果（Malus pumila）[14]、茶樹(shù)（Camellia sinensis）[15]、小麥（Triticum aestivum）[9]、桃（Prunus persica）[16]、荔枝（Litchi chinensis）[17]、玉米（Zea mays）[18]、辣椒（Capsicum annuum）[19]等物種內(nèi)的PAO 基因家族已被鑒定，成員數(shù)目多為4～10 個(gè)，但不同物種間個(gè)數(shù)存在差異。如桃、擬南芥、水稻、荔枝中PAO 基因的數(shù)目分別為4、5、7、10 個(gè)，而小麥中則鑒定到30 個(gè)PAO 基因。研究表明，PAO 通過(guò)參與PA 的末端分解代謝或反向轉(zhuǎn)化途徑來(lái)調(diào)節(jié)植物生命活動(dòng)[17]。棉花GhPAO 能將Spm 轉(zhuǎn)化為Spd，在擬南芥中過(guò)表達(dá)GhPAO能夠提高H2O2、水楊酸、植保素含量及黃萎病抗性，而沉默GhPAO可降低棉花黃萎病抗性[20]。擬南芥AtPAO5 催化PA 的反向轉(zhuǎn)化，其功能缺失后，可以提高擬南芥抗鹽性[21]，在水稻中則存在相反的機(jī)制，過(guò)表達(dá)OsPAO3能夠增加水稻胚芽鞘中的PA 含量，降低H2O2的過(guò)度積累及Na+濃度，從而提高水稻萌發(fā)期的抗鹽性[22]。甜橙CsPAO4 能夠催化Spd、Spm 降解產(chǎn)生DAP 及H2O2，并促進(jìn)鹽脅迫條件下煙草種子萌發(fā)[23]。在桃果實(shí)成熟過(guò)程中，PpePAO1表達(dá)水平顯著升高，過(guò)表達(dá)該基因可使煙草的Spd、Spm 含量顯著降低，推測(cè)其可能參與PA的末端分解代謝[16]。

獼猴桃隸屬獼猴桃科獼猴桃屬，是多年生雌雄異株落葉藤本植物，其果實(shí)富含維生素、礦物質(zhì)及其他營(yíng)養(yǎng)成分，因此有“水果之王”的美譽(yù)。獼猴桃果實(shí)皮薄多汁，采后具有典型的呼吸躍變，因此在貯藏期間易軟化，不耐儲(chǔ)存，嚴(yán)重影響其貯藏、貨架壽命及商品價(jià)值。研究表明，內(nèi)源較高的PA 含量或外施PA 有利于延長(zhǎng)獼猴桃的采后保鮮期[24]。PAO 是PA 降解代謝的關(guān)鍵酶，對(duì)維持植物內(nèi)源PA平衡具有重要作用。因此，挖掘、鑒定PAO 家族成員對(duì)于獼猴桃鮮果的采后貯藏、保鮮及運(yùn)輸具有重要意義。截至目前，中華獼猴桃（Actinidia chinensis）Hongyang[25]、Red5[26]及毛花獼猴桃（Actinidia erianth）White[27]的基因組數(shù)據(jù)已經(jīng)公布，為PAO家族成員的鑒定工作奠定了基礎(chǔ)。本研究擬利用已公布的獼猴桃基因組序列及廊坊師范學(xué)院資源植物與應(yīng)用生物技術(shù)研發(fā)團(tuán)隊(duì)前期獲得的軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)獼猴桃PAO 家族成員進(jìn)行鑒定、分析，并探究它們?cè)讷J猴桃果實(shí)發(fā)育及采后貯藏過(guò)程中的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得

從廊坊師范學(xué)院軟棗獼猴桃種質(zhì)資源圃內(nèi)選擇生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)相似、無(wú)病蟲害的軟棗獼猴桃龍成2 號(hào)植株，于花后135 d 摘取大小均勻、無(wú)機(jī)械損傷及病蟲害的果實(shí)，并在采收當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，室溫下分別放置0、3、6、9 d，果實(shí)去皮，將果肉切成小塊，液氮速凍后，埋于足量干冰內(nèi)寄送至北京諾禾致源科技股份有限公司，將各樣本的RNA 混合后基于Pacbio平臺(tái)進(jìn)行三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 獼猴桃PAO家族成員的鑒定及特征分析

中華獼猴桃、毛花獼猴桃蛋白質(zhì)序列下載自獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//kiwifruitgenome.org/home）[28]。以AtPAO[10]及OsPAO[11]蛋白質(zhì)序列作為查詢序列，分別對(duì)中華獼猴桃、毛花獼猴桃蛋白質(zhì)序列及軟棗獼猴桃全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)（E-value：1×10-5），比對(duì)結(jié)果去除冗余，并利用SMART 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//smart.embl.de/）及CD-Search工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行分析，剔除結(jié)構(gòu)不完整的序列，從而獲得中華獼猴桃、毛花獼猴桃、軟棗獼猴桃PAO 家族成員。利用在線工具Compute pI/Mw（https：//web.expasy.org/compute_pi/）分析獼猴桃PAO 蛋白的分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)。從獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中提取中華獼猴桃及毛花獼猴桃PAO 的基因及CDS 序列，利用在線工具GSDS 2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）繪制基因結(jié)構(gòu)圖。分別利用SignalP-4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1）[29]和TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）[30]預(yù)測(cè)信號(hào)肽和跨膜區(qū)。利用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）對(duì)獼猴桃PAO蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3 獼猴桃PAO家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 6 軟件[31]中內(nèi)置的ClustalW 程序?qū)?lái)自獼猴桃、擬南芥[10]、水稻[11]、甜橙[12]、棉花[20]、玉米[32]、大麥（Hordeum vulgare）[33]的PAO 進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，使用TBtools[34]軟件中的Simple MSA Trimmer 程序修剪比對(duì)結(jié)果，最后基于Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap重復(fù)1 000次。

1.4 獼猴桃PAO家族成員結(jié)構(gòu)分析

利用在線程序MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行保守基序分析，并將鑒定到的保守基序在Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）中注釋，利用在線程序CD-Search 獲取蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域信息，利用TBtools基于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)對(duì)保守基序、保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行可視化。

1.5 獼猴桃PAO基因共線性分析

利用TBtools軟件中的One Step MCScanX 程序，基于中華獼猴桃、毛花獼猴桃的基因組及gff3 注釋文件，對(duì)獼猴桃PAO 基因進(jìn)行共線性分析。利用TBtools 軟件中的Simple Ka/Ks Calculator 程序計(jì)算共線性基因?qū)Φ耐x替換率（Synonymous substitutions rates，Ks）、非同義替換率（Nonsynonymous substitution rates，Ka）以及Ka/Ks 值，并以此分析獼猴桃PAO基因進(jìn)化過(guò)程中的選擇壓力[35-36]。

1.6 獼猴桃PAO基因表達(dá)分析

從獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站獲取中華獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析AcPAO基因在授粉后20、120、127 d 和盛花后147、168、175、224、231 d 果實(shí)中的表達(dá)情況及其對(duì)不同儲(chǔ)藏溫度的響應(yīng)情況[37-39]。

利用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（天根公司）提取龍成2 號(hào)莖、葉及不同儲(chǔ)藏時(shí)間（采摘后室溫放置0、3、6、9 d）果實(shí)的總RNA，經(jīng)濃度及純度測(cè)定后，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以軟棗獼猴桃Actin基因[40]（表1）作為內(nèi)參，利用熒光定量PCR 技術(shù)分析軟棗獼猴桃AaPAO基因（表1）的組織表達(dá)模式及其在不同儲(chǔ)藏時(shí)間的表達(dá)情況。反應(yīng)體系為20.0 μL，包含cDNA 模板1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×SYBR Green qPCR Mix（艾德萊公司）10.0 μL，ddH2O 8.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃2 min；95 ℃15 s，63 ℃20 s，72 ℃25 s，40 個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，利用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃PAO家族成員的鑒定及特征分析

利用BLAST 檢索，從中華獼猴桃、毛花獼猴桃及軟棗獼猴桃中各鑒定到4、4、5 個(gè)PAO 基因，分別命名為AcPAO1—4、AePAO1—4、AaPAO1—5（表2）。AcPAO1—4分別位于中華獼猴桃0、5、11、19 號(hào)染色體上，基因長(zhǎng)度分別為7 985、7 418、7 766、9 837 bp。AePAO1—4分別位于毛花獼猴桃12、15、20、21 號(hào)染色體上，基因長(zhǎng)度分別為7 562、8 088、1 722、7 448 bp。除AePAO3只含有1 個(gè)內(nèi)含子外，其余的AcPAO及AePAO成員均含有9 個(gè)內(nèi)含子（圖1）。AcPAO、AePAO、AaPAO分別編碼490～496、420～496、475～496個(gè)氨基酸。AcPAO、AePAO、AaPAO 的分子質(zhì)量分別為54.33～55.85、45.74～55.92、52.67～55.92 ku，等電點(diǎn)（pI）分別為5.34～5.74、5.39～5.77、5.29～5.79。SignalP-4.1、TMHMM-2.0 預(yù)測(cè)結(jié)果表明，AcPAO、AePAO、AaPAO 序列中均不含有信號(hào)肽和跨膜區(qū)。WoLF PSORT 預(yù)測(cè)結(jié)果表明，AcPAO、AaPAO 主要定位在過(guò)氧化物酶體，而AePAO 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡、細(xì)胞質(zhì)、過(guò)氧化物酶體中均有分布。

圖1 AcPAO、AePAO基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structures of AcPAO and AePAO

表2 獼猴桃PAO基因家族成員基本信息Tab.2 The information of PAO gene family in kiwifruit

2.2 獼猴桃PAO家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了解獼猴桃PAO 家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 6 構(gòu)建了來(lái)自擬南芥（AtPAO1—5）、水稻（OsPAO1—7）、玉米（MPAO）、大麥（BPAO1—2）、甜橙（CsPAO4）、棉花（GhPAO）及獼猴桃9個(gè)物種共30個(gè)PAO 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。如圖2 所示，AePAO3 與CsPAO4、AcPAO2 與AePAO1、AaPAO2與 AaPAO3、AcPAO4 與 AaPAO1、AcPAO3 與AaPAO4、AcPAO1 與AePAO2 親緣關(guān)系最近，首先聚為一支；30 個(gè)PAO 蛋白可以劃分為3 個(gè)類群，類群Ⅰ內(nèi)成員數(shù)目最少，包含OsPAO1、AtPAO5、AePAO3、CsPAO4，類群Ⅱ內(nèi)成員數(shù)目最多，包括3個(gè)AcPAO、2個(gè)AePAO、4個(gè)AaPAO、3個(gè)AtPAO、3個(gè)OsPAO，類群Ⅲ包含AcPAO1、AePAO2、AaPAO5、GhPAO、AtPAO1、MPAO及3個(gè)OsPAO、2個(gè)BPAO。

圖2 獼猴桃及其他物種PAO蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 The phylogenetic tree of PAO proteins derived from kiwifruit and other species

2.3 獼猴桃PAO家族成員結(jié)構(gòu)分析

為了進(jìn)一步闡明獼猴桃PAO 家族成員的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用TBtools 基于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)獼猴桃PAO 蛋白的保守基序及結(jié)構(gòu)域進(jìn)行可視化。如圖3所示，利用MEME 程序在獼猴桃PAO 蛋白中檢測(cè)到6種保守基序（motif1—6）；除AePAO3 只含有motif1、4、6 三種保守基序外，其余成員則含有全部的6 個(gè)motif；利用CD-Search 程序在獼猴桃PAO 蛋白中鑒定到3 種保守結(jié)構(gòu)域（PLN02568、PLN02268、PLN02676），三者均被注釋為多胺氧化酶。如圖4 所示，基于獼猴桃PAO 的多序列比對(duì)結(jié)果，對(duì)家族成員共有的保守基序進(jìn)行了展示，motif1長(zhǎng)度為50 aa，motif4 長(zhǎng)度為41 aa，motif6 長(zhǎng)度為38 aa，motif1、4 在Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)中均被注釋為含黃素的胺氧化還原酶；此外，AcPAO2—4、AePAO4、AaPAO1—4 的C 端均含有過(guò)氧化物酶體引導(dǎo)信號(hào)（PTS）保守基序（S/A/C）（K/R/H）（L/M）[12]，與其亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果相一致（表2）。

圖3 獼猴桃PAO蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化（A）、保守基序（B）、保守結(jié)構(gòu)域（C）分析Fig.3 Phylogenetic tree（A），motifs（B）and conserved domains（C）analysis of kiwifruit PAO proteins

圖4 獼猴桃PAO蛋白多序列比對(duì)Fig.4 Multiple sequence alignment of kiwifruit PAO proteins

2.4 獼猴桃PAO基因共線性分析

在AcPAO、AePAO間共檢測(cè)到4 對(duì)共線性基因，分別是AcPAO1/AePAO2、AcPAO2/AePAO1、AcPAO3/AePAO4、AcPAO4/AePAO1，且AcPAO2、AcPAO4與AePAO1均存在共線性關(guān)系。為了闡明選擇壓力在獼猴桃PAO 基因家族進(jìn)化過(guò)程中的作用，對(duì)共線性基因?qū)Φ腒a、Ks及Ka/Ks值進(jìn)行計(jì)算，4對(duì)共線性基因間的Ka/Ks值均小于1，表明它們?cè)谶M(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了較強(qiáng)的純化選擇（表3）。

表3 獼猴桃PAO共線性基因間Ka/Ks分析Tab.3 Ka/Ks values of collinearity gene pairs in kiwifruint PAO gene family

2.5 獼猴桃PAO基因表達(dá)分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)AcPAO進(jìn)行表達(dá)分析。圖5A所示的是中華獼猴桃品種Hongyang 果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中AcPAO的表達(dá)變化情況。AcPAO1在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)基本無(wú)表達(dá)，AcPAO2在授粉后20 d 的表達(dá)量最高，分別是授粉后120、127 d 表達(dá)量的7.77、6.24倍，AcPAO4與AcPAO2表達(dá)趨勢(shì)相似，而AcPAO3的表達(dá)量隨發(fā)育進(jìn)程呈先降低后升高的趨勢(shì)。圖5B所示的是AcPAO在中華獼猴桃品種Hort16A 果實(shí)不同成熟期的表達(dá)變化情況。AcPAO1在5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)基本無(wú)表達(dá)，AcPAO2表達(dá)量變化不明顯，AcPAO3的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，AcPAO4在盛花后147、168、175 d 的表達(dá)量較高，在224、231 d 表達(dá)量較低。圖5C 所示的是Hort16A 果實(shí)在0、3、8、10、12、14、16 ℃及室溫（RT）下儲(chǔ)藏2 d 后AcPAO的表達(dá)情況。AcPAO1基本無(wú)表達(dá)，AcPAO2、AcPAO4在不同溫度下的表達(dá)量差異較小，AcPAO3在0、3、8 ℃條件下表達(dá)量較高，在12、14、16 ℃及室溫條件下表達(dá)量較低，呈先升高后降低趨勢(shì)，說(shuō)明AcPAO3對(duì)儲(chǔ)藏溫度的變化有一定響應(yīng)。

圖5 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的AcPAO表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of AcPAO based on transcriptome data

利用熒光定量PCR 技術(shù)分析了AaPAO在軟棗獼猴桃不同組織及儲(chǔ)藏階段的表達(dá)情況。AaPAO1、AaPAO3、AaPAO4、AaPAO5在莖、葉、果實(shí)中均有表達(dá)，AaPAO1、AaPAO4、AaPAO5在莖中表達(dá)量最高，果實(shí)中表達(dá)量最低，AaPAO3則在葉中表達(dá)量最高（圖6A）。AaPAO1、AaPAO3、AaPAO5的表達(dá)量在儲(chǔ)藏過(guò)程中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，AaPAO4的表達(dá)量則逐漸降低（圖6B）。

圖6 AaPAO在不同組織（A）及不同儲(chǔ)藏時(shí)間（B）的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of AaPAO across different tissues（A）and storage time（B）

3 結(jié)論與討論

植物體內(nèi)PA 的動(dòng)態(tài)平衡主要依賴合成及分解代謝來(lái)維持，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中具有重要作用[1]，PAO 能夠催化PA 的末端分解代謝及反向轉(zhuǎn)化途徑[19]，PAO 通常由成員數(shù)目較少的小基因家族編碼[12]。到目前為止，越來(lái)越多的植物PAO 基因被克隆、鑒定，但未見(jiàn)關(guān)于獼猴桃PAO 基因全基因組鑒定、結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)分析的系統(tǒng)報(bào)道。本研究從基因組水平鑒定了獼猴桃PAO 基因，分析其編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其在獼猴桃果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育、儲(chǔ)藏過(guò)程中的表達(dá)情況。

經(jīng)鑒定，中華獼猴桃、毛花獼猴桃、軟棗獼猴桃中分別存在4、4、5 個(gè)PAO 基因，與擬南芥[10]、水稻[11]、桃[16]中PAO 基因數(shù)目相近，表明獼猴桃PAO亦為小基因家族。系統(tǒng)進(jìn)化分析將來(lái)自擬南芥、水稻、玉米、大麥、甜橙、棉花及獼猴桃的30 個(gè)PAO 蛋白劃分為3 個(gè)類群，13 個(gè)獼猴桃PAO 蛋白在3 個(gè)類群內(nèi)均有分布，AePAO3 屬于類群Ⅰ，AcPAO2—4、AaPAO1—4、AePAO1、AePAO4 屬于類群Ⅱ，AcPAO1、AePAO2、AaPAO5 歸屬于類群Ⅲ，同一類群內(nèi)多數(shù)成員的亞細(xì)胞定位、motif及保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果亦具有相似的規(guī)律特征，如AcPAO2—4、AaPAO1—4 及AePAO4 均定位于過(guò)氧化物酶體，都含有保守結(jié)構(gòu)域PLN02268 及motif1—6；AcPAO1、AePAO2、AaPAO5 定位于液泡，含有保守結(jié)構(gòu)域PLN02676 及6 種motif，這與在番茄[41]、蘋果[14]、荔枝[17]中的研究結(jié)果一致。共線性分析表明，AcPAO、AePAO間存在4對(duì)共線性基因，且Ka/Ks值均小于1，說(shuō)明在進(jìn)化過(guò)程中受到了純化選擇，且高度保守，具有相似的功能[42-44]。

李會(huì)等[41]和GHOLIZADEH 等[9]根據(jù)多物種間系統(tǒng)進(jìn)化分析，分別對(duì)番茄SlPAO、小麥TaPAO 蛋白的功能進(jìn)行推測(cè)，指出SlPAO1 及TaPAO7、10、11 作用于PA的末端分解代謝，SlPAO2—8及TaPAO2—5、8、9 則可能催化PA 的反向轉(zhuǎn)化途徑。前人研究結(jié)果表明，AtPAO2、3[10]、OsPAO3—5[11，45]能夠催化PA的反向轉(zhuǎn)化途徑。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，AcPAO2—4、AaPAO1—4、AePAO1、AePAO4 與它們屬于同一類群。因此，它們之間可能具有相似的功能。甜橙CsPAO4[12，23]雖然催化PA 的末端分解，卻與催化反向轉(zhuǎn)化的AtPAO5[46]、OsPAO1[47]歸于一類，與本研究結(jié)果一致。此外，類群Ⅲ中的AtPAO1[5]、GhPAO[20]及OsPAO7[48]也是分別催化反向轉(zhuǎn)化和末端分解代謝。因此，本研究后續(xù)的重要任務(wù)是對(duì)獼猴桃PAO蛋白開(kāi)展功能研究，并探究其作用機(jī)制。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，PA 在肉質(zhì)果成熟、衰老及品質(zhì)調(diào)節(jié)方面具有重要作用[49]。收獲前及采后施用PA 能夠有效延遲芒果（Mangifera indica）、桃、歐洲李（Prunus domestica）、蘋果果實(shí)的成熟并延長(zhǎng)貨架期[50]。草莓FaPAO5能夠催化Spm、Spd 降解，并負(fù)向調(diào)控果實(shí)成熟[51]。桃PpePAO1基因被沉默后，Spd 含量顯著升高，延緩果實(shí)軟化，而其在番茄中過(guò)表達(dá)后，Spd、Spm含量降低，促進(jìn)果實(shí)軟化[52]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及熒光定量PCR技術(shù)對(duì)獼猴桃果實(shí)發(fā)育及儲(chǔ)藏過(guò)程中PAO 基因的表達(dá)變化進(jìn)行了分析。AcPAO1在中華獼猴桃果實(shí)中基本無(wú)表達(dá)，可能在果實(shí)發(fā)育、成熟、儲(chǔ)藏過(guò)程中作用不大。AcPAO2、AcPAO4在授粉后20 d 的表達(dá)量最高，隨后降低，與桃PpPAO4的表達(dá)變化趨勢(shì)一致，而AcPAO3則與PpPAO2、PpPAO3[53]的情況相似，表達(dá)量隨生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程呈先降低后升高的趨勢(shì)，但在果實(shí)成熟、軟化過(guò)程中，AcPAO3的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，并對(duì)不同儲(chǔ)藏溫度存在一定響應(yīng)。AaPAO基因在被測(cè)組織中均有表達(dá)，但在不同組織間的表達(dá)量存在差異，除AaPAO4表達(dá)量隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低外，其余3 個(gè)成員的表達(dá)量在儲(chǔ)藏過(guò)程中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。

本研究首次從3 個(gè)獼猴桃物種的基因組/轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中對(duì)PAO 基因家族進(jìn)行了鑒定，初步確定了13個(gè)獼猴桃PAO基因。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上較為保守，均含有PAO 蛋白保守結(jié)構(gòu)域。表達(dá)分析結(jié)果表明，它們當(dāng)中的某些成員在獼猴桃果實(shí)成熟及儲(chǔ)藏軟化過(guò)程中具有一定作用。這些試驗(yàn)結(jié)果可為后續(xù)獼猴桃PAO基因的功能研究提供參考。