孫亞寧，盧清俠，邢云瑞，楊蘇珍，范 璐，喬松林，張改平

（河南省農業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性動物傳染病，死亡率可高達100%[1]。2018 年下半年，ASFV 傳入我國，對我國養(yǎng)豬業(yè)產生了前所未有的威脅[2]，造成了嚴重的經濟損失[3]。目前，ASFV 仍在廣泛傳播，傳染源與污染源并未徹底清除，且出現了ASFV 變異株和經典強毒株共流行的局勢[4]。ASFV 變異株包括基因缺失株[5]、自然變異株、自然弱毒株[6]等，與2018 年傳入的ASFV 毒株相比，該類毒株的基因組序列、致病力等發(fā)生明顯變化，豬感染變異株后排毒滴度低、間隙性排毒，難以早期發(fā)現，讓防控形勢變得更復雜[5]。對于目前ASFV 并沒有疫苗及有效的治療手段，建立敏感、特異、簡便且能實現現場快速檢測的ASFV 檢測方法，實現感染豬的早期發(fā)現、實施“精準剔除”是實現豬場內部ASFV 凈化、控制疫情的有效手段[7]。

ASFV 的檢測技術主要包括檢測抗原的聚合酶鏈式反應（PCR）等核酸檢測方法和檢測抗體的酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）等免疫學檢測方法[8]。PCR已成功應用于豬樣品（血液、器官等）[9]中ASFV 基因組的檢測，是可以代替病毒分離鑒定的一種靈敏、特異、快速的ASFV 檢測技術，在抗原檢測技術中，較免疫學方法和熒光免疫分析法等具有更高的敏感性和特異性。但是PCR 無法應用于現場實時監(jiān)測，且在ASFV 感染康復后及變異毒株感染的情況下，PCR 的漏檢率非常高[10]，無法滿足目前ASFV 復雜感染情況下的檢測需求?；贏SFV 感染后7～9 d 血清抗體轉陽，包括康復后的動物，抗體陽性可持續(xù)終生等特點，在無可用疫苗的大背景下，抗體檢測陽性則表明感染正在或者已經發(fā)生，開展現場實時ASFV 抗體快速檢測可以大大提高檢測效率及準確性，在ASFV精準剔除計劃中意義重大[11]。

膠體金免疫層析技術是近年來迅速發(fā)展的一種體外診斷技術，相比ELISA 方法具有快速、準確、方便，無需任何人員及設備，幾分鐘即可出結果等優(yōu)點，可以實現現場快速檢測。因此，研制能夠靈敏、準確檢測ASFV抗體的試紙對控制ASFV疫情起到積極作用。目前，國內外已經針對ASFV 抗體檢測試紙開展了研究[12-15]，常用的檢測抗原有p30、p54、CD2V 及p72 等。但是ASFV 抗體檢測試紙在使用過程中存在敏感性低、準確性差等問題，成為ASFV 抗體檢測試紙推廣應用的瓶頸。影響抗體檢測試紙敏感性及準確性的主要因素是檢測抗原的質量及免疫層析試紙的產品化工藝。已有的ASFV抗體檢測試紙的檢測抗原多為原核表達，與病毒本身的蛋白結構相差較大，從而造成檢測敏感性及準確性差；再者建立的試紙大多停留在實驗室階段，并未對產品的工藝參數進行細致優(yōu)化。因此，ASFV抗體檢測試紙并未在基層大面積推廣應用。

ASFV 是直徑為200 nm 的大型包膜病毒，病毒基因可編碼200 多種蛋白質，其中包括50 多種結構蛋白質[16-20]，常用的檢測抗原中，p30、p54為ASFV感染早期表達的蛋白質[21-22]，但是其在病毒中含量較少，產生抗體滴度較低。p72蛋白是構成ASFV二十面體結構的主要蛋白質，占病毒蛋白總量的32%[23]，在病毒衣殼上以同源三聚體形式存在[24]。p72 抗原性強，表位非常保守[25]，含有4 個主要抗原表位，可能參與受體的結合和中和性抗體的結合。為了解決目前ASFV 抗體檢測試紙存在的問題，選擇真核表達系統(tǒng)表達共轉染p72基因及其伴侶蛋白基因的方法，獲取正確折疊的p72重組蛋白為檢測抗原，并研究蛋白質不同狀態(tài)對檢測試紙的影響，經條件優(yōu)化，建立ASFV 抗體檢測試紙，以期從原材料上入手提高產品檢測敏感性，再通過優(yōu)化試紙制備過程中的條件，形成較優(yōu)的生產工藝，確保ASFV 抗體檢測試紙的敏感性、特異性、準確性及穩(wěn)定性能滿足商品化需求，為ASFV 抗體檢測在基層的廣泛應用提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 ASFV p72 蛋白三聚體及多聚體（HEK293F 細胞表達）、ASFV p72 單克隆抗體由河南省農業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室制備；43份ASFV抗體陰性血清（2018年以前收集）、22份ASFV抗體陽性血清、豬藍耳病毒（PRRSV）抗體陽性血清、豬細小病毒（PPV）抗體陽性血清由河南省農業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室收集及保存；ASFV抗體標準陽性血清、偽狂犬病毒（PRV）抗體標準陽性血清、豬瘟病毒（CSFV）抗體標準陽性血清、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）抗體標準陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

重組金黃色葡萄球菌A 蛋白（r-SPA）購自杭州紐龍生物科技有限公司；氯金酸、酪蛋白購自美國Sigma公司；無IgG、無蛋白酶的牛血清白蛋白（BSA）購自美國Jackson Immuno Research 公司；Tween 20購自美國默克公司；PVP-10、PEG20 000、Tris 購自美國Solarbio 公司；Triton X-100 購自美國Merck 公司；海藻糖購自日本Wako 公司；硝酸纖維素膜（HF13502S25，30 cm×2 cm）、玻璃纖維墊、吸水紙購自英國Millipore公司；ASFV ELISA 抗體檢測試劑盒購自韓國金諾公司；氫氧化鈉、疊氮鈉等其他試劑為國內市售分析純級。

1.1.2 主要儀器 93-3 定時恒溫雙向磁力攪拌器購自上海亞榮生化儀器廠；電熱鼓風干燥箱購自上海一恒科學儀器有限公司；HGS802 壓殼機購自杭州峰航科技有限公司；900 型薄膜連續(xù)封口機購自廣州華豐包裝設備有限公司；SIGMA4-16K 離心機購自德國Sigma 公司；加熱磁力攪拌器購自德國IKA公司；U-3000 紫外可見分光光度計購自日本島津公司；BioDot-XYZ3060 三維噴點系統(tǒng)、BioDot-CM 4000斬切機購自美國Bio-Dot公司；智能免疫層析定量分析儀由北京中農快檢科技有限公司提供。

1.2 方法

ASFV 抗體檢測試紙選擇間接法原理建立。結構見圖1。試紙由支撐底板、硝酸纖維素膜（NC膜）、結合墊、樣品墊和吸收墊五部分組成。NC 膜上質控線（C 線）位置固定p72 單克隆抗體，檢測線（T 線）位置固定SPA；結合墊上固定膠體金標記的p72 蛋白。當樣品為陰性時，金標p72 蛋白隨著液體流動到T 線位置時不與SPA 反應，流經C 線時與固定的p72 單克隆抗體反應，顯示1 條紅色條帶；當樣品為陽性時，樣品中ASFV p72 抗體與金標p72 結合形成復合物，流經T線時與SPA反應被攔截，多余的金標蛋白被C 線攔截，試紙顯示2 條紅色條帶。該試紙目測即可判定結果，也可借助智能免疫層析定量分析儀掃描T 線灰度值峰面積，根據讀值進行數據分析，T 線顯色強度在一定范圍內與抗體滴度呈正比。

圖1 ASFV抗體檢測試紙結構Fig.1 Structure of the ASFV antibody test strip

1.2.1 膠體金制備及鑒定 以檸檬酸三鈉法制備膠體金。在500 mL 燒杯中加入100 mL 超純水，在加熱磁力攪拌器上邊攪拌邊加熱，煮沸后先加入1 mL 10 g/L 的氯金酸，然后再加入1.6 mL 10 g/L 檸檬酸三鈉，觀察顏色變?yōu)榫萍t色后再繼續(xù)加熱5 min，取下燒杯，自然冷卻后用超純水定容至100 mL，4 ℃保存。肉眼觀測膠體金狀態(tài)，使用紫外可見分光光度計進行光譜掃描，對膠體金質量及粒徑進行鑒定。

1.2.2 不同狀態(tài)p72重組蛋白的對比試驗 在蛋白質純化的過程中，經分子篩分離獲得p72 三聚體蛋白和p72 多聚體蛋白，膠體金分別標記2 種蛋白質，并進行試紙條件優(yōu)化建立檢測方法，通過對比標記過程穩(wěn)定性及試紙檢測性能，對比蛋白質的不同狀態(tài)對檢測產品的影響，選擇較優(yōu)蛋白質狀態(tài)組裝試紙。

1.2.3 膠體金標記p72蛋白條件優(yōu)化 分別對膠體金標記p72蛋白的pH值、標記量進行優(yōu)化。

膠體金標記pH 值優(yōu)化：用0.2 mol/L K2CO3調節(jié)膠體金pH 值，取7 個離心管，每管中加入1 mL 膠體金，再分別加入2、4、6、8、10、12、14 μL K2CO3，按照張改平等[26]所述方法測定各pH 值下最佳蛋白質標記量。按照測定的最佳蛋白質標記量將蛋白質加入不同pH 值的膠體金中，充分混勻，室溫靜置反應70 min，加入100 μL 100 g/L BSA 溶液封閉，反應10 min，12 000 r/min 離心25 min，棄上清，沉淀用金標蛋白保存液重懸。根據經驗確定非優(yōu)化環(huán)節(jié)的參數，組裝試驗用試紙（方法下同）[27]，將不同pH 值條件下標記的金標蛋白，以1 μL/條的量點在金標墊上，檢測ASFV 標準陰性及陽性血清。智能免疫層析定量分析儀掃描，計算陽性血清T線（P）與陰性血清T 線（N）的比值（P/N 值）。根據金標蛋白標記過程中的穩(wěn)定性及試紙檢測結果，確定最佳標記pH 值。最佳pH 值條件下，在蛋白質飽和度附近設定不同的蛋白質加入量，標記膠體金獲得金標蛋白。將不同標記濃度標記的金標蛋白點于金標墊上檢測ASFV 標準陰性及陽性血清，以檢測結果確定蛋白質標記量。

1.2.4 NC 膜噴膜濃度優(yōu)化 檢測線（T 線）最佳噴涂條件確定：用PBS 配制SPA 質量濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL 的溶液，以1 μL/cm 的量噴于NC膜上，42 ℃干燥2 h，然后組裝試驗用試紙，檢測ASFV 標準陰性及陽性血清，智能免疫層析定量分析儀掃描，選擇P/N 值最大，且N 值最小的噴膜濃度為最佳噴膜質量濃度。

質控線（C 線）最佳噴涂條件確定：取抗p72 蛋白單克隆抗體，用PBS 稀釋為2、1、0.5 mg/mL 質量濃度的溶液，以1 μL/cm 的量噴于NC 膜上C 線，同時噴涂T 線（最佳參數），42 ℃干燥2 h，然后組裝試驗用試紙，檢測標準陽性血清效價，選擇C 線清晰，且在檢測強陽性血清時C線仍能顯色的質量濃度為質控線噴涂條件。

1.2.5 樣品墊配方優(yōu)化 參照孫亞寧等[27]的樣品墊配方，設置基礎配方：0.1 mol/L PBS 含10 g/L 酪蛋白鈉，5 g/L Triton X-100，NaN30.3 g/L。在此配方上固定其他參數調整單因素，分別調整緩沖液（如Na2B4O7·10H2O、Tris-HCl、MES 等）、大分子物質及蛋白質（PVP-10、PVP-40、BSA、PEG 等）、表面活性劑S1-S25，最終以試紙流動狀態(tài)、P/N 值及N 值為判斷標準，確定較優(yōu)樣品墊配方。

1.2.6 ASFV 抗體檢測試紙生產 結合墊制備：在攪拌狀態(tài)下將1 400 μL 0.2 mol/L K2CO3加入100 mL膠體金中調節(jié)pH 值，然后攪拌狀態(tài)下逐滴加入16 mL p72 三聚體（用ddH2O 稀釋的0.1 mg/mL 溶液），室溫反應30 min，攪拌狀態(tài)下加入10 mL BSA溶液（質量濃度100 g/L），室溫反應10 min，12 000 r/min離心30 min，棄上清，沉淀用20 mL 金標蛋白保存液重懸。然后用BioDot-XYZ3060 三維噴點系統(tǒng)按7 μL/cm 的量噴涂在預處理的玻璃纖維棉（0.9 cm×30 cm）上，42 ℃干燥1 h，密封保存。

NC 膜制備：用BioDot-XYZ3060 三維噴點系統(tǒng)按1 μL/cm的量噴涂C線及T線，42 ℃干燥2 h，密封保存。

樣品墊制備：將尺寸為1.8 cm×30 cm 玻璃纖維棉浸泡于樣品墊溶液中，靜置5 min，然后均勻平鋪于干燥板上，42 ℃干燥4 h，密封保存。

試紙組裝：按照圖1，將NC 膜、結合墊、樣品墊、吸收墊依次粘貼于支撐底板上，各組分間重合2 mm，切割機切割成規(guī)格為3.0 mm×70 mm 的試紙，將試紙裝入卡殼中，加入干燥劑密封保存。

1.2.7 ASFV 抗體檢測試紙顯色時間優(yōu)化 用試紙檢測ASFV 陽性血清（生理鹽水1∶100稀釋），設3個平行，分別在顯色5、10、15、20、25、30 min 時，用智能免疫層析定量分析儀掃描，確定最佳顯色時間。

1.2.8 ASFV 抗體檢測試紙敏感性鑒定及樣品稀釋倍數選擇 用生理鹽水將ASFV 標準陽性血清樣品倍比稀釋，然后用試紙檢測，每個稀釋倍數平行檢測3 次，顯色10 min 后用智能免疫層析定量分析儀掃描試紙，以T 線P/N ≥2.1 對應的最大稀釋倍數確定為試紙檢測效價，同時用ASFV ELISA 抗體檢測試劑盒檢測陽性血清效價，對比檢測結果，評價試紙敏感性。

同時用試紙檢測弱陽性血清效價，根據弱陽性血清及標準陽性血清機讀結果確定樣品稀釋倍數。

1.2.9 ASFV 抗體檢測試紙檢測方法及結果判定

試紙檢測方法：將試紙取出平放于桌面上；將豬血清樣品用生理鹽水進行1∶100 稀釋；取稀釋好的樣品100 μL加入試紙加樣孔中，靜置反應10 min后目測或機器掃描讀取結果。

目測結果判定：僅在質控線（C）處顯現1條紅色條帶，而檢測線（T）處不顯現紅色條帶時，結果判為陰性；在質控線（C）和檢測線（T）處同時顯現2 條紅色條帶時，結果判為陽性，而且檢測線顏色深度與抗體效價高低在一定范圍內呈正比。

機讀結果判定：當機讀結果為11.18 時判為陰性，當機讀結果大于23.48（P/N＞2.1）時判為陽性，當結果在11.18～23.48時，建議4～7 d后復測。

1.2.10 ASFV 抗體檢測試紙?zhí)禺愋澡b定 用ASFV抗體檢測試紙分別檢測ASFV、PRRSV、PPV、PCV2、PRV、CSFV陽性血清及ASFV陰性血清，顯色10 min后，目測鑒定試紙?zhí)禺愋浴?/p>

1.2.11 ASFV 抗體檢測試紙均一性鑒定 取ASFV抗體檢測試紙10 條，檢測ASFV 標準陽性血清，顯色10 min 后，用智能免疫層析定量分析儀掃描試紙，計算變異系數（CV），評價試紙均一性。

1.2.12 ASFV 抗體檢測試紙準確性鑒定 取ASFV抗體檢測試紙分別檢測43 份ASFV 抗體陰性血清及22 份ASFV 抗體陽性滅活血清，讀取結果，計算假陽性率及假陰性率，評價試紙準確性。

1.2.13 ASFV 抗體檢測試紙穩(wěn)定性鑒定 選擇45 ℃加速試驗評價ASFV 抗體檢測試紙穩(wěn)定性，45 ℃下保存37.5 d 相當于25 ℃下保存1 a，30 ℃下保存6 個月[9]。將包裝好的試紙放入45 ℃鼓風干燥箱中，每隔5 d 取樣檢測ASFV 標準陽性血清效價，評價試紙穩(wěn)定性。

1.2.14 臨床樣品檢測 取ASFV 抗體檢測試紙與ASFV ELISA 抗體檢測試劑盒分別檢測71份田間血清，對比檢測結果，計算2 種檢測方法的符合率，評價建立試紙的臨床使用價值。

2 結果與分析

2.1 ASFV抗體檢測試紙構建

2.1.1 膠體金質量鑒定 膠體金肉眼觀測表明，膠體金呈酒紅色，顏色透亮、無沉淀及漂浮物。紫外可見分光光度計掃描結果見圖2，結果顯示，膠體金的紫外吸收峰峰寬在500～550 nm，峰寬較窄，說明膠體金顆粒比較均勻；最大吸收為527 nm 處，經計算得出膠體金粒徑為29 nm。綜上所述，制備的膠體金顆粒均勻，質量較好，且顆粒大小適合用于免疫層析方法建立。

圖2 膠體金紫外掃描鑒定Fig.2 Identification chart of colloidal gold by ultraviolet scanning

2.1.2 膠體金標記p72 蛋白狀態(tài)選擇及條件確定

同時優(yōu)化p72 三聚體和多聚體的膠體金標記條件，從標記過程中的穩(wěn)定性分析，p72多聚體在標記過程中穩(wěn)定性稍差，金標蛋白顏色稍紫，p72三聚體的穩(wěn)定性較好。2種蛋白質檢測性能見圖3，結果顯示，三聚體蛋白檢測陰性樣品時背景更低，P/N 值更高，結合標記過程中的穩(wěn)定性，選擇p72三聚體為檢測蛋白。

圖3 膠體金標記p72蛋白量優(yōu)化Fig.3 The optimization of gold labeled p72 protein amount

標記條件優(yōu)化：標記pH值結果顯示，當1 mL膠體金中K2CO3加入量小于10 μL 時，膠體金標記的過程不穩(wěn)定，且檢測陰性血清時有假陽性信號存在。當1 mL 膠體金中K2CO3加入量為12 μL 和14 μL 時，標記穩(wěn)定性及陽性值顯色無明顯區(qū)別，為了保證體積放大后生產過程中標記的穩(wěn)定性，選擇1 mL 膠體金中加入14 μL K2CO3的量調節(jié)標記pH值。最佳標記量優(yōu)化結果見圖3，結果顯示，當1 mL膠體金中標記量增加至16 μg 時可以明顯提高顯色強度，且陰性血清背景不增加，當加入量增加至20 μg 時，標記過程中出現金標蛋白掛壁的現象，且顯色強度及背景均增加，P/N 值降低，因此，最佳標記量確定為1 mL 膠體金中加入16 μg p72 三聚體蛋白較合適。

2.1.3 NC膜噴膜質量濃度確定 NC膜噴膜質量濃度分析結果見圖4。圖4顯示，當T線噴膜的質量濃度為0.75 mg/mL 時P/N 值最高，且N 值最低，隨著SPA 質量濃度增加，N 值逐漸增加，為了檢測的準確性，應嚴格控制N 值，因此，選擇0.75 mg/mL 為T 線噴膜質量濃度。當C 線上p72 單克隆抗體噴膜的質量濃度為2 mg/mL 時，顯色清晰，且在檢測強陽性樣品時仍能正常顯色。因此，選擇2 mg/mL 為C 線噴膜條件。

圖4 檢測線上SPA噴膜質量濃度優(yōu)化Fig.4 The optimization of mass concentration of SPA coated on test line

2.1.4 樣品墊配方確定 經過不同因素的調整，最終確定該試紙樣品墊配方為Tris-HCl（pH 值7.4）中加入PVP-10、酪蛋白鈉、S17及NaN3，金標蛋白跑板狀態(tài)正常，N值最低，P/N值較大。

2.1.5 ASFV 抗體檢測試紙顯色時間確定 ASFV抗體檢測試紙顯色時間結果見圖5，當顯色10 min后，T線顏色基本穩(wěn)定，據此確定顯色10 min后可讀取結果。根據觀測檢測過程中膠體金的釋放情況，10 min 左右金標蛋白基本釋放完全，20 min 時膠體金紅色全部被吸收墊吸收，所有反應基本完成。可見，20 min 是最佳觀測時間。隨著反應時間的延長，NC 膜上水分會蒸發(fā)，可能導致樣品墊上金標蛋白復合物回流等多種不良反應，容易造成結果的假陽性。因此，試紙檢測必須在30 min 內判讀結束。綜上所述，試紙可以在10～30 min 內讀取結果，且在此時間內結果穩(wěn)定。比較寬的結果讀取時間范圍可以更好地保證大批量樣品檢測時結果的準確性。

圖5 ASFV抗體檢測試紙顯色時間確定Fig.5 The optimization of coloring time of ASFV antibody test strip

2.2 ASFV抗體檢測試紙鑒定

2.2.1 ASFV 抗體檢測試紙敏感性鑒定及樣品稀釋倍數選擇 ASFV 抗體檢測試紙檢測ASFV 標準陽性血清結果見表1，根據P/N≥2.1 計算，該標準陽性血清的試紙效價為1∶51 200。使用ASFV ELISA 檢測試劑盒檢測ASFV 標準陽性血清效價為1∶6 400（根據說明書，S/P＞0.4為陽性），因此，該試紙的敏感性優(yōu)于ASFV ELISA抗體檢測試劑盒。

表1 ASFV陽性血清試紙效價Tab.1 The titer of ASFV positive serum detected by test strip

表1 中弱陽性血清試紙效價檢測結果顯示，根據P/N≥2.1 判定為陽性血清的標準，血清稀釋倍數高于100 倍時無法判定為陽性；結合標準陽性血清的試紙效價結果，血清稀釋倍數低于100 倍時鉤狀效應明顯。因此，本研究選擇樣品稀釋倍數為100倍，既能保證弱陽性血清檢出，又可以降低強陽性血清的鉤狀效應。

2.2.2 ASFV 抗體檢測試紙?zhí)禺愋澡b定 ASFV 抗體檢測試紙?zhí)禺愋澡b定結果見圖6，結果顯示，試紙不與PRRSV、PPV、PCV2、PRV、CSFV 陽性血清及ASFV 陰性血清反應。因此，研制的ASFV 抗體檢測試紙具有很好的特異性。

圖6 ASFV抗體檢測試紙?zhí)禺愋澡b定Fig.6 Specific evaluation of ASFV antibody test strip

2.2.3 ASFV 抗體檢測試紙均一性鑒定 均一性鑒定結果如表2所示，ASFV抗體檢測試紙的變異系數為7.9%。通常試紙檢測的變異系數小于10%，表明其具有很好的均一性。本研究制備的ASFV 抗體檢測試紙均一性良好。

表2 ASFV抗體檢測試紙均一性鑒定Tab.2 Homogeneity evaluation of ASFV antibody test strip

2.2.4 ASFV 抗體檢測試紙準確性鑒定 用試紙檢測43份ASFV抗體陰性血清及22份ASFV抗體陽性滅活血清，結果見圖7。由圖7 可知，43 份陰性血清檢測結果均為陰性，未見假陽性；22 份陽性血清均為陽性，未見假陰性。說明制備的ASFV 抗體檢測試紙具有很好的準確性。

圖7 ASFV抗體檢測試紙準確性鑒定Fig.7 Accuracy evaluation of ASFV antibody test strip

2.2.5 ASFV 抗體檢測試紙穩(wěn)定性鑒定 將包裝好的ASFV 抗體檢測試紙于45 ℃保存，進行加速穩(wěn)定試驗，結果見表3。試紙在45 ℃保存45 d，試紙的敏感性不變，也未出現假陽性?？梢姡狙芯恐苽涞腁SFV 抗體檢測試紙具有很好的穩(wěn)定性，可以室溫保存1 a以上。

2.2.6 ASFV 抗體檢測試紙臨床樣品檢測結果 用ASFV 抗體檢測試紙與商業(yè)化ASFV ELISA 試劑盒同時檢測71份田間樣品，評價該試紙是否可應用于臨床檢測中，結果見表4。由表4 可以看出，ELISA試劑盒檢測出陽性樣品14 份，試紙均檢測出為陽性，陽性復合率為100%；ELISA 試劑盒檢測出陰性樣品52 份，試紙檢測陰性為51 份，陰性符合率為98.1%；ELISA 試劑盒檢測出5 份可疑樣品，試紙檢測均為陽性。2種檢測方法的總符合率為91.6%。

表4 ASFV抗體檢測試紙臨床樣品檢測結果Tab.4 The detection results of clinical samples by the ASFV antibody test strip

3 結論與討論

目前，基于p72 蛋白的ASFV 抗體檢測方法多是采用的截短或單獨表達的p72蛋白[28-29]，蛋白質狀態(tài)以不均一的聚集物存在。利用pB602L 與p72 蛋白共表達時，可以獲得折疊正確、均勻分布的三聚體狀態(tài)[30]，而本研究選擇與伴侶分子pB602L共表達的p72 重組蛋白，再利用分子篩將p72 的三聚體及多聚體分離，然后分別作為檢測蛋白構建試紙，對比不同形態(tài)的p72蛋白對免疫層析試紙檢測性能的影響，經對比以三聚體形式存在的p72 蛋白具有更好的敏感性、穩(wěn)定性及特異性。本研究結果提示，在蛋白質純化的過程中重組蛋白的不同狀態(tài)對產品性能的影響也非常明顯，在純化及保存的過程中應該充分考慮蛋白質狀態(tài)并對其進行控制，從而保證產品檢測性能的穩(wěn)定。

SPA是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質，能與多種哺乳動物的IgG 及少量的IgM 和IgA特異性結合，對豬、狗、兔、人、猴、鼠及牛等種屬IgG親和力較強；對大白鼠、綿羊等種屬的IgG 親和力稍差；基本不與馬、山羊等哺乳動物IgG 反應，常被用于廣譜二抗使用，且具有多種優(yōu)勢：首先SPA 可以通過表達純化獲得，制備及純化簡單、分子高度均一、性質穩(wěn)定且不受Fc 受體影響；其次SPA 與IgG的親和力比傳統(tǒng)二抗強，可以大大提高檢測敏感性；而且SPA 可以和多種屬的IgG 反應，制備的檢測產品不僅可以檢測豬血清，對野豬、鼠、狗等種屬同樣適用。因此，本研究選擇SPA 為攔截線，可以提高檢測敏感性及適用范圍。WAN 等[28]利用重組的p30 蛋白及截短的p54 蛋白建立了雙重ASFV 抗體檢測試紙，檢測敏感性為1∶256，與商業(yè)化ELISA 試劑盒相當。ZHU 等[29]以酵母表達系統(tǒng)表達的p72 蛋白，建立了ASFV 抗體檢測試紙，檢測敏感性為1∶10 000。本研究制備的ASFV 抗體檢測試紙，檢測敏感性為1∶51 200，有效提高了試紙的檢測敏感性。

間接法免疫層析試紙檢測血清中抗體時會出現鉤狀效應，就是當抗體濃度過高時試紙顯色反而會降低，其原因為樣品中存在大量的抗體，一部分抗體在流經結合墊時與金標蛋白反應形成金標抗原抗體復合物，但是流經攔截線時，樣品中大量的游離抗體封閉了SPA 的攔截位點，從而降低了二抗攔截金標抗原抗體復合物的能力，造成顯色強度降低，甚至會出現假陰性結果，為了避免假陰性結果的出現，通常可以通過增加稀釋倍數的方法解決。但是對于弱陽性血清增加了稀釋倍數就會造成檢測敏感性降低，因此，樣品稀釋倍數的選擇對免疫層析試紙產品檢測準確性非常重要。本研究根據強陽性血清及弱陽性血清的檢測結果綜合分析，確定樣品稀釋倍數為100 倍，既能保證弱陽性血清檢出，也能降低強陽性血清的鉤狀效應，使檢測結果更加準確。

間接法免疫層析試紙的C線為抗檢測蛋白質的抗體，通過攔截金標蛋白顯色，因此當檢測樣品為陽性時，金標蛋白-抗體復合物會被T 線攔截，從而導致C 線顯色信號降低，甚至會出現強陽性血清時C線不顯色的情況，因此，在試紙制備過程中可以適當增加金標蛋白的量及C 線噴膜濃度，改善C 線的顯色?；蛘卟捎锚毩⒌腃 線顯色系統(tǒng)，比如生物素親和素等建立與試紙本身不反應的一組獨立的組分進行標記和C線的噴涂，從而保證C線顯色。

關于臨床樣品檢測符合率的問題，本研究選擇的ELISA 試劑盒設置了0.3＜S/N＜0.4為可疑區(qū)間，本次檢測的臨床樣品中有5 份的可疑樣品，試紙檢測結果為陽性，從而造成了本研究符合率偏低的結果。試紙檢測敏感性試驗結果顯示，該試紙的檢測敏感性要高于ELISA 試劑盒，因此將試劑盒判為可疑的樣品檢測為陽性是試紙敏感性較高的體現，可以更早地診斷出ASFV 感染的存在，從而更好地實現“精準剔除”，控制ASFV疫情。

本研究選擇p72 重組蛋白三聚體為檢測蛋白，以SPA 為攔截線，經膠體金標記條件、NC 膜噴膜條件、樣品墊緩沖體系及成分、顯色時間等因素優(yōu)化，確定ASFV 抗體檢測試紙產品化的具體參數，建立了ASFV 抗體檢測試紙，并對試紙的特異性、均一性、準確性及穩(wěn)定性進行了鑒定，為ASFV 抗體檢測試紙的推廣應用及產業(yè)化奠定基礎。

本研究確定了ASFV 抗體檢測試紙的產品化參數；以p72 重組蛋白三聚體為檢測抗原；1 mL 膠體金中加入14 μL 0.2 mol/L K2CO3、16 μg p72 蛋白三聚體為膠體金標記條件；以0.75 mg/mL SPA 噴涂T線，2 mg/mL p72 單克隆抗體噴涂C 線；以Tris-HCl（pH 值7.4）含PVP-10、酪蛋白鈉、S17 及NaN3為樣品墊處理液；檢測10～30 min 判定結果。對建立的ASFV 抗體檢測試紙的檢測性能進行鑒定，試紙的檢測敏感性為1∶51 200，優(yōu)于商業(yè)化ASFV ELISA檢測試劑盒；試紙不與PRRSV、PPV、PCV2、PRV、CSFV 陽性血清及ASFV 陰性血清反應，具有良好的特異性；變異系數為7.9%，具有良好的均一性；在臨床樣本檢測中未見假陰性及假陽性結果，具有良好的準確性；經加速穩(wěn)定試驗驗證，可以室溫保存1 a以上；與進口商品化試劑盒的總符合率為91.6%。本研究制備的試紙檢測性能良好，可以滿足商業(yè)化需求，為基層ASFV 抗體的快速檢測提供了技術手段。