楊翠鳳，滕 崢，韋 春，劉正魯

（百色學院農(nóng)業(yè)與食品工程學院/廣西芒果生物學重點實驗室/亞熱帶特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)學院，廣西 百色 533000）

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是連接植物新陳代謝中初生代謝和次生代謝的橋梁，在植物木質(zhì)素、類黃酮、香豆酸酯類等次生代謝物的形成過程以及植物的抗逆調(diào)控中發(fā)揮重要作用[1]。PAL 屬于氨基裂解酶，由組氨酸裂解酶（HAL）家族突變進化而來，PAL與HAL 的催化活性位點含有1 個共同的輔因子4-甲基二烯-咪唑-5-酮（MIO），通過內(nèi)部三肽區(qū)段Ala-Ser-Gly，經(jīng)過自環(huán)化脫水形成[2]。植物的PAL基因CDS 長度通常2 100 bp 左右，包含1 個內(nèi)含子和2 個外顯子（裸子植物除外），編碼約700 個氨基酸，分子質(zhì)量大小在220～330 ku[3]。目前，研究人員已 成 功 從 木 薯（AF383152.1）、麻 瘋 樹（DQ883805.1）、蓖 麻（KF311063.1）及 甜 菜（AJ810175.1）等植物中克隆獲得該基因cDNA 序列全長。研究發(fā)現(xiàn)，該基因在不同植物中的氨基酸組成和分子質(zhì)量大小存在差異，如宋慕波等[4]克隆了荸薺的PAL基因，其cDNA 全長2 485 bp，開放閱讀框（ORF）為2 142 bp，編碼713個氨基酸；潘文等[5]克隆獲得尾葉桉PAL基因全長4 507 bp，氨基酸編碼序列為2 172 bp，內(nèi)含子為1 759 bp。PAL基因在植物不同器官中的時空表達具有組織特異性，也受生長發(fā)育過程的調(diào)控。朱海生等[6]研究表明，絲瓜LcPAL基因編碼的蛋白質(zhì)包含了PAL-HAL、PLN02457、phe_aml_yase 保守結(jié)構(gòu)域和1 段酶活性中心序列，為典型的Lyase_I_Like 超家族，該基因在絲瓜果實、花、莖、葉和根中均有表達。張文香等[7]研究表明，TcPAL基因在百蕊草葉和莖中表達量較高，根中表達量較少。喬楓等[8]在研究枸杞中PAL基因的表達特性時發(fā)現(xiàn)，枸杞PAL基因在葉片中表達量最高，其次是花，且隨枸杞生長表達量增加。而對云錦杜鵑PAL 活性進行時空表達分析時發(fā)現(xiàn)，在花苞中的PAL活性最高[9]。SHANG 等[10]的研究也證明了PAL 活性在黃瓜雌花和雄花中高于果等部位。隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)不同光因子調(diào)控[11-12]、機械損傷[13]、低溫[14]、干旱[15]、毒素處理[16]、病原菌感染[17-18]等脅迫均可誘導植物體內(nèi)PAL基因的表達。董春娟等[19]以黃瓜幼苗為研究對象，在低溫條件下，葉片中PAL基因的表達量顯著升高，其產(chǎn)物活性也有所提高。程春振等[20]利用少量紫外線對梁平柚果皮進行照射處理，可誘導PAL 活性的增強。戢強強等[21]通過對6 個青蒿PAL 基因家族成員進行順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，青蒿苯PAL 基因成員的啟動子區(qū)域含有較多參與光響應、逆境脅迫響應、激素響應和生長發(fā)育相關的作用元件?？梢?，PAL 在植物的抗逆及生長發(fā)育中具有重要的作用，其在組織的含量水平、酶活性及基因表達量可作為衡量植物抗逆能力的指標[22-23]。

花青素是植物各組織器官內(nèi)糖基化的多酚類化合物，是普遍存在于植物葉、花和果中的水溶性天然色素，具有類黃酮物質(zhì)所特有的“C6-C3-C6 三環(huán)”碳骨架結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)為3，5，7-甲基-2-苯基苯并吡喃，能使植物呈現(xiàn)不同顏色[24]?；ㄇ嗨氐暮铣傻孜锸?-氨基苯丙酸（Phenylalanine），又稱苯丙氨酸，其在2-氨基苯丙酸解氨酶的催化作用下生成β-苯丙烯酸（肉桂酸），因此，PAL 是花青素合成的起始酶?；ㄇ嗨卦谥参锏钟婢硶r同樣發(fā)揮著重要作用，既可抵抗病原菌侵染、蟲害侵染等生物因素脅迫，也可以抵抗紫外線輻射、低溫、旱災等非生物因素脅迫[25-27]。

百香果（Passiflora edulisSims）屬攀緣型木質(zhì)藤本植物，果實多汁，富含多種水果香氣，營養(yǎng)價值高，經(jīng)濟效益顯著。當前各地種植的栽培種按果色可分為黃金果、紫果或為兩者的雜交后代[28]。目前，關于百香果PAL基因的研究較少，未見在分子方面進行百香果PAL基因全長克隆及其在不同品種不同組織中表達特異性研究的報道。鑒于此，擬利用RACE 技術克隆獲取PePAL基因cDNA 全長，分析PePAL基因序列特征，然后利用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）測定其在不同品種不同組織中的表達量，為進一步研究PePAL基因參與百香果花青素生物合成途徑以及百香果的分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

采集健康生長的臺農(nóng)1號百香果嫩葉用于基因全長克??；采集健康生長的臺農(nóng)1 號百香果（紫果）和大黃金、小黃金百香果（黃果）3 級蔓同一結(jié)果枝上的莖、葉、花瓣、果皮組織用于后續(xù)基因熒光定量PCR 試驗。樣品采集后立即用液氮速凍，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及cDNA合成

采 用 試 劑 盒 RNAprep Pure Plant Kit（TIANGEN，北京）抽提純化百香果各組織樣品總RNA，并用試劑盒PrimeScript TM RT Master Mix（TaKaRa，大連）進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于后續(xù)基因克隆及基因表達分析。

1.3 PePAL基因的克隆

根據(jù)百色學院百香果病害研究團隊前期獲得的候選基因unigene 序列，設計引物，以反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板，開展候選基因片段的PCR 擴增和測序驗證；按照SMARTer RACE 5′3′ Kit Protocol-At-A-Glance（TaKaRa，大連）操作指南進行5′-RACE和3′-RACE 巢式PCR 擴增，并將PCR 產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序、拼接；設計ORF 擴增引物，完成ORF的擴增和測序驗證。利用Vector NTI 11.0設計引物如下：PePAL-Unigene-F：5′-ATGGACCAGGGCGGCAATGGT-3′，PePAL-Unigene-R：5′-TCAGCTGATGGGAAGAGGAGC-3′，PePAL-3OUTER-F：5′-CTGTGGTTGGTTTACGCTCCTATATTTCCGAAGGTGCAGTTAT-3′，PePAL-3OUTER-R：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，PePAL-3INNER-F：5′-CACTTGGAAGAGAACCTGAAGCACGCGGTGAAGAACA-3′，PePAL-3INNERR：5′-CGGCGAGAACGAGAGCAACT-3′ ，PePAL-5OUTER-F：5′-GCATGGCGTCACATTGTGGTTCAGGAGCTTGGTTA-3′，PePAL-5OUTER-R：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，PePAL-5INNER-F：5′-TCAATCATCCGCTTCACCTCTTCC-3′ ，PePAL-5INNER-R：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′。將5′RACE 和3′RACE 測序結(jié)果用Vector NTI 11.0軟件進行拼接獲得百香果PePAL基因cDNA 全長。設計擴增完整編碼框引物：PAL-ORF-F：5′-ATGGACCAGGGCGGCAATGGT-3′ 和 PAL-ORFR：5′-TCAGCTGATGGGAAGAGGAGC-3′。

1.4 生物信息學分析

利用BioXM 2.6 預測基因氨基酸序列；利用NCBI-protein blast 在線分析百香果PePAL與其他物種的同源性；利用ProtParam 預測PePAL 蛋白理化性質(zhì)；利用ProtScale 在線分析PePAL 蛋白疏水性；利用SignalP 4.1 Server 預測信號肽；利用TMHMM Server 2.0 預測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域；利用PSORT WWW Server 進行PePAL 亞細胞定位分析；利用NetPhos 3.1 Server 分析PePAL 蛋白磷酸化位點；利用Motif Search 工具對推導的氨基酸序列預測膜內(nèi)在蛋白（MIP）結(jié)構(gòu)域；用SOPMA 軟件預測PePAL 蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL 對PePAL 三級結(jié)構(gòu)進行同源建模；用Mega 5.05軟件構(gòu)建PePAL編碼氨基酸序列進化樹。

1.5 實時熒光定量PCR分析

以臺農(nóng)1 號、大黃金和小黃金百香果3 級蔓同一結(jié)果枝上的莖、葉、花瓣和果皮的cDNA 為模板進行分析。根據(jù)百香果PePAL基因序列設計熒光定量PCR引物Y-PePAL-F：5′-GGCGAGAACGAGAGCAACT-3′，Y-PePAL-R：5′-CTAGCACTGTCTACCTCCTTGG-3′；以百香果Histone H3為內(nèi)參基因，設計內(nèi)參引物Y-His-F：5′-AGAGCCATGCAGTGTTGGCA-3′，Y-His-R：5′-CTTGGCGTGGATGGCACAGA-3′。PCR 反應混合液配制：2×Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，F(xiàn)-primer（10 μmol/L）0.4 μL，Rprimer（10 μmol/L）0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 補足至20 μL。PCR 循環(huán)條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共進行40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。加好樣后放在德國AnalytikJena qTOWERE3 熒光定量PCR 儀中進行反應。利用2-ΔΔCt法計算PePAL基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PePAL全長cDNA克隆

經(jīng)5′-RACE 及3′-RACE 巢式PCR 擴增、測序拼接及其ORF 測序驗證（圖1），獲得百香果PePAL全長cDNA序列。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對，該基因與其他植物PAL基因有較高同源性。PePAL基因cDNA 全長2 499 bp，含有一個185 bp 的5′-端非翻譯區(qū)（5′-UTR）、一個190 bp 的3′-端非翻譯區(qū)（3′-UTR）和一個2 124 bp 的完整ORF。PePAL基因186—188 位為起始密碼子ATG，下游存在同框終止密碼子TGA和poly A尾。

圖1 百香果PePAL 5′RACE、3′RACE和編碼框的克隆產(chǎn)物Fig.1 The cloning products of 5′RACE，3′RACE and ORF of PePAL gene

2.2 PePAL基因編碼序列分析

用BioXM 2.6 對PePAL基因進行分析，翻譯得到其編碼的蛋白質(zhì)序列。PePAL完整ORF 長度為2 124 bp，編碼707 個氨基酸，分子質(zhì)量為173.43 ku。無帶電荷氨基酸，無酸性和堿性氨基酸。非極性氨基酸1 145 個，占54.0%，親水性氨基酸1 543個，占72.7%。含量最多的氨基酸是丙氨酸（Ala），達27.4%，含量最少的氨基酸是半胱氨酸（Cys），占比22.2%（表1）。PePAL蛋白等電點為4.92，原子總數(shù)為22 051，分子式簡寫為C6315H10508N2124-O2632S472，無負電殘基（Asp+Glu）和正電殘基（Arg+Lys）。脂肪族系數(shù)為27.35，不穩(wěn)定指數(shù)為44.96，總平均親水性為0.775。

表1 PePAL編碼的總氨基酸成分分析Tab.1 Analysis of total amino acid components encoded by PePAL

2.3 PePAL蛋白親疏水性分析及信號肽預測

利用在線軟件Proscale（http：//web.expasy.org/proscale）分析百香果PAL 蛋白的親疏水性，如圖2所示，正值代表疏水性，負值代表親水性。在氨基酸第510 位時，其疏水性達到高峰，最大值為2.411；在氨基酸第114 位時，親水性達到高峰，最大值為-2.733；按照親水性越高則負值越大，反之相反的標準，可以預測出PePAL 蛋白為親水性蛋白。利用在線軟件SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）預測PePAL 蛋白的信號肽，結(jié)果如圖3 所示，C-max 位點為24，C-score=0.145；Ymax 位點為24，Y-score=0.125；S-max 位點為4，Sscore=0.154；D=0.116，SP=‘NO’，說明百香果PAL蛋白沒有信號肽，不是分泌性蛋白。

圖2 PePAL蛋白親疏水性分析Fig.2 Hydrophilicity analysis of PePAL protein

圖3 PePAL蛋白信號肽預測Fig.3 Prediction of PePAL protein signal peptide

2.4 PePAL蛋白亞細胞定位及磷酸化位點預測

經(jīng)PSORT WWW Server 預測分析，PePAL 蛋白亞細胞定位于細胞核的可能性最高，達35%，其次為葉綠體，可能性為30%，位于細胞質(zhì)和細胞膜的可能性均為20%，而位于線粒體、液泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的可能性僅為10%。利用NetPhos 3.1 Server在線預測PePAL 蛋白磷酸化位點，已知閾值大于0.5，證明該位點磷酸化，如圖4 所示，絲氨酸（S）磷酸化位點有30個，蘇氨酸（T）磷酸化位點有21個，絡氨酸（Y）磷酸化位點有7個。

圖4 PePAL蛋白磷酸化位點預測Fig.4 Prediction of phosphorylation site of PePAL protein

2.5 PePAL蛋白的Motif分析

利用Motif Search 工具（http：//www.genome.jp/tools/motif/）對推導的PePAL 氨基酸序列進行生物學意義的位點分析，在54—530 位點預測到了一個Lyase_aromatic 結(jié)構(gòu)域，在189—205 位點含有標志性的GTITASGDLVPLSYIAG 酶活性中心序列，ASG是典型的保守區(qū)域（圖5）。

圖5 PePAL蛋白的Motif分析Fig.5 Motif analysis of PePAL protein

2.6 PePAL蛋白二級與三級結(jié)構(gòu)預測

利用SOPMA 在線預測PePAL 蛋白二級結(jié)構(gòu)，如圖6 所示，PePAL 蛋白二級結(jié)構(gòu)由55.45%氨基酸殘基組成α 螺旋，8.63%氨基酸殘基組成延伸鏈，6.22%氨基酸殘基組成β轉(zhuǎn)角以及29.70%氨基酸殘基組成無規(guī)則卷曲，其中無規(guī)則卷曲將前三者連接起來。利用在線分析軟件SWISS-MODEL 對PePAL蛋白進行三級結(jié)構(gòu)同源建模（圖7）。

圖6 PePAL蛋白二級結(jié)構(gòu)各組成位置及空間構(gòu)型預測Fig.6 Prediction of positions and spatial configuration of secondary structure of PePAL protein

圖7 PePAL蛋白三級結(jié)構(gòu)預測模型Fig.7 Prediction model of tertiary structure of PePAL protein

2.7 PePAL基因進化樹分析

為研究PePAL與其他植物PAL基因的進化關系，用Clastal W 將PePAL所編碼的氨基酸序列與其他植物PAL基因編碼的氨基酸序列進行同源比對，采用MEGA 5.05 的相鄰法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖8所示，百香果PePAL與毛白楊（Populus tomentosa）、毛果楊（Populus trichocarpa）、川楊（Populus szechuanica）、胡楊（Populus euphratica）的PAL基因聚為一類，表明百香果PePAL與楊屬（Populus）植物的PAL基因親緣關系較近。

圖8 PePAL基因進化樹分析Fig.8 Analysis of PePAL gene evolutionary tree

2.8 PePAL在不同品種及不同組織中的相對表達量分析

利用實時熒光定量PCR 技術，以百香果Histone H3為內(nèi)參基因，分析了PePAL在臺農(nóng)1 號百香果（TN）、大黃金百香果（DHJ）、小黃金百香果（XHJ）中3 級蔓同一結(jié)果枝葉、花瓣、果皮、莖的表達情況。從圖9 可以看出，PePAL在不同品種百香果的同一結(jié)果枝上葉、花瓣、果皮、莖中均有表達，表達量均呈現(xiàn)出花瓣＞莖＞果皮＞葉的變化趨勢，但不同品種之間的不同組織表達量存在明顯差異，小黃金百香果中花瓣的表達量是葉的7 倍，臺農(nóng)一號百香果中花瓣的表達量是葉的149 倍，而大黃金百香果中花瓣的表達量是葉的798倍。

圖9 PePAL基因表達量分析Fig.9 Analysis of PePAL gene expression

3 結(jié)論與討論

植物PAL 一般都包含保守的PLN02457、phe_am_lyase、Lyase_aromatic 和PAL-HAL 結(jié)構(gòu)域，且大都含有GTITASGDLVPLSYIAG 酶活性中心序列，其中ASG 是植物PAL 最典型的保守區(qū)域[29]。對百香果PePAL 蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析，預測到其在54—530 位點存在一個Lyase_aromatic 結(jié)構(gòu)域，在189—205 位 點 含 有 標 志 性 的GTITASGDLVPLSYIAG 酶活性中心序列，表明百香果PAL 是典型的苯丙氨酸解氨酶，屬PAL 蛋白質(zhì)家族的一員。NJ 系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示，百香果PePAL編碼的氨基酸序列與楊屬中的毛白楊、毛果楊、川楊等PAL基因具有較高的同源性，表明PAL作為苯丙烷代謝途徑的第1個關鍵酶在進化過程中保持了足夠的遺傳穩(wěn)定性和演化趨同性，這與前人的研究結(jié)果一致[30-31]。

PAL 作為胞內(nèi)酶，在細胞水平上，其主要分布在植物微管組織細胞以及表皮下的細胞中[32]；此外，研究還發(fā)現(xiàn)，PAL 可在植物高爾基體囊泡和次生壁加厚層中定位到[33]。BARROS 等[34]利用13C 同位素標記發(fā)現(xiàn)，二穗短柄草PAL 通過其TAL 活性參與了近50%的木質(zhì)素合成，表明PAL 在木質(zhì)素合成途徑和細胞壁代謝過程中發(fā)揮著重要作用。在亞細胞水平上，植物PAL 主要分布于細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及葉綠體等細胞結(jié)構(gòu)中[35-37]。本研究中百香果PePAL蛋白亞細胞定位于細胞核、葉綠體、細胞質(zhì)、細胞膜等細胞器中。研究發(fā)現(xiàn)，不同的PAL 異構(gòu)酶亞細胞定位分析也會呈現(xiàn)出不同的結(jié)果，如煙草NtPAL1主要定位于細胞內(nèi)膜，負責調(diào)節(jié)肉桂酸的累積；而NtPAL2則主要定位于細胞質(zhì)，負責將積累的肉桂酸擴散到細胞質(zhì)中[38]。

大多數(shù)植物PAL基因在成熟的花和根部表達量較高，莖表達水平中等，而在成熟的葉片中幾乎不表達，表明植物PAL基因的表達具有組織器官特異性。百香果PAL基因與前人研究的黃芪[39]、夏枯草[40]、甘蔗[41]等植物PAL基因表達模式相同，在花中的表達量最高，其次是莖和果皮，在成熟的葉片表達量最低。推測可能是本研究克隆的百香果PAL更多地參與了花青素和木質(zhì)素的合成過程。通常植物的PAL 是由一個基因家族控制，不同的組織器官含有多種同工酶[42]，不同PAL 家族成員之間參與的代謝途徑不同，因此表達模式也會有所不同，如何瀟等[43]研究半夏PtPAL的表達量時發(fā)現(xiàn)，其在葉中表達量最高，其次是塊莖和根，花中表達量最低。

綜上，本研究利用RACE 技術克隆獲得的百香果PePAL基因cDNA 全長2 499 bp，含有一個185 bp的5′-端非翻譯區(qū)和一個190 bp 的3′-端非翻譯區(qū)，完整開放閱讀框架為2 124 bp，編碼的氨基酸序列與楊屬中毛白楊、毛果楊、川楊、胡楊PAL基因編碼的氨基酸序列具有較高的同源性。PePAL 亞細胞定位在細胞核、葉綠體、細胞質(zhì)、細胞膜等細胞結(jié)構(gòu)中。PePAL在百香果同一結(jié)果枝上的葉、花瓣、果皮、莖中均有表達，基因表達量依次為花瓣＞莖＞果皮＞葉，表明該基因更多地參與了花青素和木質(zhì)素的合成過程。在百香果中是否存在PAL 家族基因，仍需進一步研究。此外，今后可進一步分析百香果果色或香氣合成途徑中關鍵基因的表達模式，為探明百香果PAL基因調(diào)控花青素、木質(zhì)素、香豆酸酯、苯甲酸甲酯等生物合成途徑提供生物學證據(jù)。