劉娟,韋華,魏榮平,魏明,殷濤,鄧濤

中國大熊貓保護研究中心，大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學(xué)國家林業(yè)和草原局重點實驗室，邛崍山瀕危野生動植物保護生物學(xué)國家長期科研基地，四川 都江堰 611830

大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)作為我國野生動物保護領(lǐng)域的旗艦物種，因其數(shù)量稀少曾一度瀕臨滅絕，多年來一直受到眾多野生動物保護工作者的關(guān)注。近年來得益于大熊貓遷地保護政策的實行，曾經(jīng)的“三難”問題被逐一攻克，圈養(yǎng)大熊貓的繁殖成功率大幅提升，種群數(shù)量有了顯著增加。由于對大熊貓內(nèi)在生殖機理缺乏深入清晰的認識，在大熊貓的發(fā)情和妊娠過程中仍存在一些現(xiàn)象缺乏科學(xué)合理的解釋，為實行圈養(yǎng)大熊貓優(yōu)生優(yōu)育帶來了一定的阻礙，不利于提高種群質(zhì)量。

亞成體大熊貓“暖暖”2015 年8 月日出生于馬來西亞國家動物園，2017 年11 月返回中國大熊貓保護研究中心都江堰青城山基地，在2018 年和2019 年連續(xù)兩年出現(xiàn)明顯的如：外陰開口外翻、水腫，同時出現(xiàn)減食、活動量增大、蹭陰、咩叫等大熊貓發(fā)情期的典型行為。本文通過行為觀察記錄和收集到的一些尿液進行激素監(jiān)測，從遺傳基因、個體狀況、環(huán)境條件等方面探討導(dǎo)致雌性大熊貓?zhí)嵩绨l(fā)情的潛在原因，旨在為探索大熊貓的生殖生理提供有用信息，有助于大熊貓飼養(yǎng)管理和繁育工作的開展。

1 觀察對象與方法

1.1 研究地點

中國大熊貓保護研究中心青城山基地(103°34′06"—103°34′37" E，30°51′36"—30°51′56" N)位于四川省都江堰市青城山鎮(zhèn)，面積約50.7 hm2，屬中亞熱帶濕潤氣候區(qū)，館舍周邊是次生的常綠、落葉闊葉混交林。

1.2 觀察對象

大熊貓“暖暖”，系譜號977。

1.3 研究方法

采用外部觀察法進行行為觀察記錄，將活動量、戲水、蹭陰等與發(fā)情密切相關(guān)的行為依據(jù)活動強度分為5 個等級，由飼養(yǎng)師每日記錄。在出現(xiàn)明顯發(fā)情行為后，收集尿液進行激素監(jiān)測(2018 年未收集到尿液)。

2 結(jié)果

2.1 行為表現(xiàn)

“暖暖”在2018 年4 月首次出現(xiàn)了活動量增加，戲水等行為，期間精神狀態(tài)良好，食欲未見明顯變化。2019 年3 月再次出現(xiàn)了上述情況，其后有所恢復(fù),在4 月開始出現(xiàn)采食量明顯下降并伴有戲水、蹭陰、咩叫等典型的發(fā)情行為（具體行為見表1）。

表1 發(fā)情期行為比較Tab.1 Comparison of estrus behavior

2.2 生殖器與激素變化

在兩次行為異常時期，“暖暖”的外陰均有變化。2018 年有輕度開口，未見明顯腫脹。2019 年則變化極為明顯，外陰由前期出現(xiàn)開口；后逐漸外翻，水腫，呈粉紅色或潮紅色，偶有乳白色液體流出；后期腫脹逐漸消退并向內(nèi)收縮，顏色變粉變淡。在出現(xiàn)明顯的發(fā)情行為后收集檢測“暖暖”尿液中的雌激素含量，顯示有較大幅度的變化，因此認為亞成體大熊貓“暖暖”處于發(fā)情狀態(tài)。

3 分析與討論

動物的初次發(fā)情是生長發(fā)育過程中的重要階段，這意味著個體生殖系統(tǒng)發(fā)育成熟開始具有繁殖能力。初情期的內(nèi)在機制十分復(fù)雜，是動物個體在遺傳基因調(diào)控的基礎(chǔ)上與外界環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，除遺傳因素外，營養(yǎng)和個體發(fā)育狀況、環(huán)境與氣候的變化均會導(dǎo)致初情期的提前或推遲。

3.1 遺傳和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)

動物的生殖性能主要受生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控，而在內(nèi)分泌激素發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的過程中又會受到遺傳基因表達的影響。下丘腦促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone,GnRH ）是啟動動物初情期的關(guān)鍵物質(zhì)，作用于垂體使其分泌釋放促性激素，促進卵泡發(fā)育和精子產(chǎn)生，并產(chǎn)生性激素。在初情期以前的下丘腦GnRH 神經(jīng)元對性激素的負反饋作用而一直處于抑制狀態(tài)分泌量較少，在初情期啟動時與之密切相關(guān)的KISS-1 等相關(guān)基因表達急劇升高，直接刺激釋放大量GnRH，促使FSH和LH 的釋放，進而促進初情期的產(chǎn)生。KISS-1 基因自身的突變或缺失亦會導(dǎo)致性早熟或無法啟動初情期[1，2]。DNA 甲基化作為表觀遺傳修飾方法的方式之一，可以通過影響基因的表達從而對動物的生殖狀態(tài)產(chǎn)生調(diào)控作用。哺乳動物中DNA 甲基化主要發(fā)生在CpG 部位，通常位于啟動子區(qū)域，也可擴展到基因的內(nèi)含子和外顯子區(qū)域。對大鼠注射一種DNA 甲基化抑制劑后，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)DNA 甲基化水平降低，大鼠陰門開啟的時間有明顯推遲，且性腺發(fā)育遲緩，其初次發(fā)情過程明顯被延遲[[3]。進入青春期和成年期的恒河猴與幼年時期相比較，下丘腦內(nèi)側(cè)GnRH 基因表達有顯著升高的趨勢，同時5’端CpG島甲基化水平顯著降低，由此可以認為GnRH 神經(jīng)元體外成熟過程中肽釋放的增加可能是GnRH 中CGI 的DNA 去甲基化的結(jié)果[[4-5]。在山羊的初情期前后發(fā)現(xiàn)，下丘腦全基因組甲基化總體水平保持不變，而不同基因中CpG 位點上甲基化的狀態(tài)有較明顯差異，相較而言，單個基因的甲基化狀態(tài)比整體甲基化水平對發(fā)情啟動的影響更大[6]。因此，在動物初次發(fā)情的過程中神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)并不是唯一途徑，以DNA 甲基化代表的遺傳基因調(diào)控機制也發(fā)揮著不可忽視的重要作用，雖然目前還未出現(xiàn)與大熊貓有關(guān)的報道，但可作為后期研究關(guān)注的新方向。

3.2 營養(yǎng)與發(fā)育

營養(yǎng)水平與動物繁殖機能存在直接聯(lián)系，是影響動物發(fā)情或不發(fā)情的主要外在因素之一。營養(yǎng)不足可導(dǎo)致代謝機能減弱，影響生殖激素分泌，大多數(shù)營養(yǎng)不良的動物都會出現(xiàn)初情期推遲甚至不發(fā)情；營養(yǎng)過高則會導(dǎo)致肥胖和初情期提前。在部分地區(qū)有關(guān)少年兒童性成熟調(diào)查的報道中發(fā)現(xiàn)，肥胖和體重超標的兒童發(fā)育較為提前，出現(xiàn)性早熟的幾率顯著高于正常體重的兒童，高熱量飲食習(xí)慣導(dǎo)致的營養(yǎng)過剩是誘發(fā)這一現(xiàn)象的主要因素[7-9]。在動物實驗中也發(fā)現(xiàn)以高熱量飼料飼喂的肥胖大鼠較正常體重的大鼠體內(nèi)的雌激素水平更高，性發(fā)育有明顯的提前傾向[[10]。在家畜牛、羊等反芻動中營養(yǎng)水平與體重對初情期的出現(xiàn)影響更大[11]。與野外相比較，圈養(yǎng)條件下沒有復(fù)雜多變的外在威脅且有穩(wěn)定豐富的食物供給，人工飼養(yǎng)的大熊貓各方面的生長發(fā)育明顯優(yōu)于野生大熊貓，其中以體重這一項尤為明顯。1.5 歲的雌性大熊貓平均體重可達47.7±5.4 kg，3 歲為84±3 kg[12]，而本文研究對象大熊貓“暖暖”兩歲半時體重已達98 kg。此前也曾有過亞成體大熊貓?zhí)嵩绨l(fā)情的報道[[13]，同樣存在體重超重的現(xiàn)象，它們的體重超出同齡大熊貓，接近甚至達到成年大熊貓的體重（表2）。由此可見，營養(yǎng)過剩導(dǎo)致體重超重是影響大熊貓初情期的一個重要因素。

表2 過早發(fā)情大熊貓的比較Tab.2 Comparison of premature estrus in giant pandas

圖1 2019 年發(fā)情期外生殖器的變化Fig.1 Changes of vulva during oestrus in 2019

圖2 2019 年尿中雌激素的變化Fig.2 Changes of estrogen in urine in 2019

3.3 氣候與環(huán)境

大熊貓分布具有一定的地域?qū)傩?，它們的生活?xí)性受環(huán)境氣候影響較大。曾有圈養(yǎng)大熊貓因科研和文化合作交流的需要前往其他國家和地區(qū)，由于當?shù)嘏c原分布區(qū)和飼養(yǎng)地迥然不同的氣候?qū)е麓笮茇埑霈F(xiàn)了一定的應(yīng)激反應(yīng)，性周期紊亂，出現(xiàn)不發(fā)情或者異常發(fā)情的情況，在采取人為調(diào)整光周期和溫濕度等改善措施后，逐漸恢復(fù)正常[14-17]。暖暖出生于馬來西亞吉隆坡，并在當?shù)厣顑赡甓嘀蠡氐剿拇ǘ冀?。馬來西亞屬熱帶國家，光照強度較強，氣候炎熱，常年氣溫在25℃～30℃，都江堰處于亞熱帶區(qū)域，年平均氣溫處于10℃～22℃之間，四季分明氣候涼爽。兩地之間較大的氣候和環(huán)境差異對“暖暖”產(chǎn)生了一定的刺激，促使其過早發(fā)情。

關(guān)于大熊貓的性成熟年齡目前已有廣泛的研究，各飼養(yǎng)單位和研究機構(gòu)對大熊貓性成熟年齡的看法各不一致，但普遍認為雄性大熊貓性成熟在5 歲以后，雌性大熊貓稍早一些，多在4 歲以后[17-20]。像“暖暖”這樣處于低齡就連年出現(xiàn)明顯發(fā)情行為的情況仍屬罕見。大部分動物的性成熟滯后于體成熟，在初情期后還需要經(jīng)歷性成熟期才可進行交配繁育后代。因此，雖然亞成體階段大熊貓身體機能已基本發(fā)育成熟，但并不意味著其具有正常交配，繁育后代的能力。這提示我們在大熊貓飼養(yǎng)管理中，應(yīng)根據(jù)不同年齡階段大熊貓的生長特征來制定飼養(yǎng)管理措施，使其在不同的生長階段保持適宜的生長速度，合理控制好日常供應(yīng)尤其是精飼料等高熱量食物的進食量，科學(xué)調(diào)整超重個體的飲食，如此方能減少或避免出現(xiàn)過早發(fā)情狀況。