張孟楠,顧劍濤,鄧輝洪,宋鵬*

1.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610000；2.四川丹佛信息技術(shù)服務(wù)有限公司，四川 成都 610066；3.開江縣林業(yè)科研所，四川 開江 635250

銀杏（Ginkgo bilobaL.）是中國(guó)特有的珍貴孑遺植物，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。銀杏葉片主要含黃酮類和萜類內(nèi)酯類等藥用成分，對(duì)心血管、神經(jīng)系統(tǒng)均具有較強(qiáng)的藥理活性[1-2]，其中銀杏萜類內(nèi)酯主要包括銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C和白果內(nèi)酯[3]，具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、保護(hù)神經(jīng)等藥理活性[4-9]，其中銀杏內(nèi)酯B是在自然界中迄今為止發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的血小板活化因子拮抗劑[10]。

目前，關(guān)于銀杏黃酮和萜類內(nèi)酯含量在不同品種、不同區(qū)域和不同環(huán)境間的差異性研究較多[11-15]。已有研究表明，黃酮和萜類內(nèi)酯含量受遺傳、立地條件和環(huán)境因子等多方面因素的影響，不同種源間其含量也存在一定差異[13,14]。而這些差異究竟是受遺傳的影響還是環(huán)境因素長(zhǎng)期綜合作用所致，尚不明確。同質(zhì)園試驗(yàn)是近幾年用來(lái)研究遺傳和環(huán)境因素對(duì)植物初生生長(zhǎng)和次生代謝的影響的一種直接有效的方法[16]，而同質(zhì)園條件下銀杏不同種源幼苗生長(zhǎng)及藥用成分含量差異方面的研究未見報(bào)道。因此，以4 個(gè)不同種源地瀘定（LDS）、青川（QCS）、蒼溪（CXS）和開江（MCS）銀杏種子為試驗(yàn)材料，進(jìn)行同質(zhì)園栽培，分析銀杏對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，研究同質(zhì)園條件下銀杏藥用成分含量的差異，探討遺傳和環(huán)境長(zhǎng)期作用對(duì)這些差異性的影響，為高效選育葉片藥用含量高的種源和品種等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

自2017 年以來(lái)，通過對(duì)四川銀杏種資源調(diào)查和葉用銀杏產(chǎn)業(yè)發(fā)展的調(diào)研，在前期對(duì)銀杏葉片黃酮含量的研究基礎(chǔ)上，于2020 年10 月在瀘定、青川、蒼溪和開江四個(gè)區(qū)域（見表1），分別選取15 株長(zhǎng)勢(shì)旺盛，無(wú)明顯病蟲害，結(jié)實(shí)量大的銀杏雌株收集種子混勻，2020 月12 份進(jìn)行同質(zhì)園種植栽培，2021 年8 月對(duì)其一年生苗表型性狀和葉片藥用成分進(jìn)行測(cè)定。

表1 銀杏種子種源收集地概況Tab.1 General situation of Ginkgo biloba seed provenance collection sites

1.2 試驗(yàn)方法

不同種源采用相同的種植技術(shù)，均采用人工點(diǎn)播種植方式，其株行距為30 cm×10 cm。每個(gè)種源種植三個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為6 m×9 m，小區(qū)采用隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)間設(shè)保護(hù)行。

1.3 測(cè)定方法

種子橫徑、縱徑、側(cè)徑采用電子游標(biāo)卡尺測(cè)定，精確到小數(shù)點(diǎn)后2 位，每個(gè)種源各測(cè)定種子數(shù)量50 粒，重復(fù)3 次。百粒重選用電子天平測(cè)定，精確到小數(shù)點(diǎn)后2 位，隨機(jī)選取100 粒種子，重復(fù)3 次。

采取等距抽樣法每個(gè)小區(qū)抽取30 株，每個(gè)種源三個(gè)小區(qū)共計(jì)90 株。分別測(cè)定各樣株的地徑、株高、冠幅、單株葉片數(shù)量，隨機(jī)摘取銀杏苗上、中、下部位不同方向的葉片50 片，測(cè)量其平均質(zhì)量以及計(jì)算出單株葉重。

總黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯含量測(cè)定參照2020 版《中國(guó)藥典》一部銀杏葉含量測(cè)定，高效液相色譜法（通則0512）測(cè)定，計(jì)算公式為：

總黃酮醇苷含量=（槲皮素含量+山柰酚含量+異鼠李素含量）×2.51，

含萜類內(nèi)酯=銀杏內(nèi)酯A 含量+銀杏內(nèi)酯B 含量+銀杏內(nèi)酯C 含量+白果內(nèi)酯含量

其計(jì)算結(jié)果精確到小數(shù)點(diǎn)后2 位，重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析方法

利用Excel 對(duì)銀杏表型性狀、葉片總黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯類含量進(jìn)行整理分析及相關(guān)計(jì)算，采用SPSS 27 軟件進(jìn)行多重比較和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種源間銀杏種子和幼苗生長(zhǎng)差異分析

不同種源銀杏種子表型性狀結(jié)果表明，除側(cè)徑（F側(cè)徑=2.602，P=0.124）外，不同種源間種子表型性狀均存在極顯著差異（F橫徑=70.041，P<0.01；F縱徑=214.937，P<0.01；F百粒重=94.167，P<0.01）（見圖1）。種源間種子百粒重平均值為206.17 g，LDS 最低（148.96 g），顯著低于其他種源，MCS 最高（276.34 g），同時(shí)MCS 種子橫徑和縱徑均顯著高于其他種源，分別為26.34 mm，17.90 mm，QCS種子縱徑顯著低于其他種源（15.34 mm）。

圖1 不同種源銀杏種子表型性狀Fig.1 Phenotypic characters of Ginkgo biloba L.seeds from different provenances

不同種源銀杏幼苗生長(zhǎng)結(jié)果表明，除地徑（F地徑=0.92，P>0.05）外，不同種源間幼苗生長(zhǎng)存在顯著差異（F苗高=12.79，P<0.01；F冠幅=3.73，P=0.02；F單株葉數(shù)=10.401，P<0.01；F單葉重=6.91，P<0.01；F單株葉重=8.084，P=0.01）（見圖2）。MCS 和LDS 的苗高分別為28.45 cm 和 25.56 cm，顯著高于QCS 和CXS；冠幅平均值為15.37 cm，LDS 和MCS顯著高于QCS，CXS 與各種源間差異不顯著；單葉重各種源的平均值為3.99 g、單株葉數(shù)各種源的平均值為9.93 片、單株葉重各種源的平均值為44.58 g，均表現(xiàn)為L(zhǎng)DS 和MCS 顯著高于QCS 和CXS，單葉重LDS 最大4.91 g，單株葉數(shù)和單株葉重MCS 最大為28.45 cm，12.6 片。

圖2 不同種源銀杏苗表型差異Fig.2 Comparison of Ginkgo biloba L.seedings from different provenances

2.2 不同種源間黃酮和萜類內(nèi)酯成分含量差異分析

對(duì)不同種源地的銀杏葉片黃酮和萜類內(nèi)酯成分含量測(cè)定，結(jié)果表明：除銀杏內(nèi)酯C（F銀杏內(nèi)酯C=0.970，P=0.453）外，各種源間黃酮和萜類內(nèi)酯含量存在顯著差異（F黃酮=13.518，P=0.02；F總萜類內(nèi)酯=31.751，P<0.01；F白果內(nèi)酯=23.641，P<0.01；F銀杏內(nèi)酯A=11.190，P=0.03；F銀杏內(nèi)酯B=19.347，P=0.01；）。由圖3 可知，各種源黃酮平均含量為1.89%，最低的QCS 種源為1.57%，顯著低于其他3 個(gè)種源，而其他3 個(gè)種源間并無(wú)顯著差異，最高的CXS 為2.04 %；各種源萜類內(nèi)酯平均含量為1.00%，含量最高LDS 為1.14%，顯著高于其他種源，含量最低的MCS 為0.86%，顯著低于其他種源，QCS 和CXS 間無(wú)顯著差異；

圖3 不同種源黃酮和萜類內(nèi)酯成分含量差異Fig.3 Contents of flavonoids and terpene lactones were different in Ginkgo biloba L.from different provenances

各種源白果內(nèi)酯平均含量為0.32%，最高的LDS 為0.38%，顯著高于其他3 個(gè)種源，其他3 個(gè)種源間無(wú)顯著差異；CXS 和LDS 的銀杏內(nèi)酯A 含量均為0.10%，顯著高于QCS 和MCS，而QCS 和MCS間無(wú)顯著差異；各種源銀杏內(nèi)酯B 平均含量為0.41%，最高的LDS 為0.47%，顯著高于其他種源，最低的MCS 為0.35%，顯著低于其他種源，QCS 和CXS 間無(wú)顯著差異；銀杏內(nèi)酯C 含量各種源間無(wú)明顯差異，各種源含量表現(xiàn)為L(zhǎng)DS>QCS>MCS>CXS。

2.3 不同種源間各性狀相關(guān)性分析

不同種源的種子及幼苗生長(zhǎng)和葉片藥用成分含量與種源地環(huán)境相關(guān)性分析結(jié)果（見圖4）表明：苗高與單株葉重呈極顯著正相關(guān)（0.912）；百粒重與白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯B、萜類內(nèi)酯均顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為（-0.867）、（-0.803）和（-0.849）；萜類內(nèi)酯與白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A 和銀杏內(nèi)酯B 均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為（0.928）、（0.756）和（0.962）；白果內(nèi)酯與銀杏內(nèi)酯A 和銀杏內(nèi)酯B 呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為（0.615）和（0.849）；銀杏內(nèi)酯A 與銀杏內(nèi)酯B 呈顯著正相關(guān)（0.763）。總的來(lái)說(shuō)幼苗生長(zhǎng)特征與葉片藥用成分含量間的相關(guān)性不高。

圖4 銀杏各性狀間相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of various characters of Ginkgo biloba L.

3 結(jié)論與討論

3.1 不同種源間種子及一年生苗和葉藥用成分含量差異性

植物的表型可塑性被認(rèn)為是植物發(fā)生生物進(jìn)化和適應(yīng)環(huán)境的基本條件，在植物適應(yīng)生境中有著重要的作用[18-20]。在本研究中不同種源銀杏種子的表型性狀有顯著的差異，說(shuō)明銀杏種子在不同環(huán)境中表型有較大的可塑性。

有研究表明植物經(jīng)過環(huán)境的長(zhǎng)期干擾后，其生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)子代生長(zhǎng)和次生代謝物的表達(dá)具有強(qiáng)烈的影響[21]。在不同的生長(zhǎng)環(huán)境中銀杏的生長(zhǎng)有明顯的差異，因?yàn)殂y杏具有較強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境變化的能力[22]，而本研究中不同種源銀杏在相同環(huán)境條件下幼苗生長(zhǎng)性狀除冠幅和地徑外其他均呈顯著差異，這些差異可能是親代受種源地環(huán)境的影響導(dǎo)致子代幼苗部分生長(zhǎng)存在遺傳變異。Groot 等的研究表明，子代性狀差異變化依賴于親本生存環(huán)境[23]。雖然各種源銀杏地徑和冠幅相差較多，但各種源間并不存在顯著差異，這可能是不同種源銀杏幼苗地徑和冠幅遺傳變異較小，隨著銀杏苗齡的增長(zhǎng)其地徑和冠幅可能會(huì)逐漸出現(xiàn)顯著差異。

植物為適應(yīng)環(huán)境，經(jīng)過長(zhǎng)期的進(jìn)化與環(huán)境相互作用產(chǎn)生了次生代謝物，植物的次生代謝產(chǎn)物的積累有助于抵御環(huán)境的脅迫[24]，銀杏的次生代謝物中黃酮類和萜類內(nèi)酯類是銀杏葉發(fā)揮獨(dú)特藥理作用的主要化學(xué)成分[25]。有研究表明不同地區(qū)銀杏的黃酮和萜類內(nèi)酯含量與經(jīng)緯度、年均溫、年降水量、無(wú)霜期、年均日照時(shí)數(shù)等氣候因子的相關(guān)性均不顯著，認(rèn)為這種差異極有可能是由單株自身的遺傳特性決定的[13，15]。也有研究表明溫度、水分、光照等環(huán)境條件對(duì)黃酮和萜類內(nèi)酯含量積累有著重要影響[26-28]。在本研究中，不同種源銀杏在相同環(huán)境條件下黃酮和萜類內(nèi)酯含量也呈顯著性差異。這可能與不同銀杏種源地的氣候和土壤環(huán)境有關(guān)，在不同環(huán)境的長(zhǎng)期影響下遺傳物質(zhì)發(fā)生了一定的改變，這與劉芙蓉等對(duì)四川不同種源銀杏葉片黃酮含量的研究結(jié)果相似，銀杏在適宜的環(huán)境條件下遺傳物質(zhì)有利于黃酮類化合物的積累[29]。不同種源銀杏萜類內(nèi)酯中銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B 和白果內(nèi)酯含量均呈顯著差異，只有銀杏內(nèi)酯C 含量差異不顯著，可能控制銀杏內(nèi)酯C 含量的遺傳物質(zhì)在不同地理環(huán)境條件下影響較小。結(jié)果表明，不同種源的銀杏在黃酮和萜類內(nèi)酯類含量差異可能是親代受環(huán)境的影響導(dǎo)致子代黃酮和萜類內(nèi)酯的遺傳物質(zhì)存在變異。由于不清楚黃酮和萜類內(nèi)酯的差異有多大程度上是由遺傳物質(zhì)主導(dǎo)的，有多大程度是因?yàn)榈钟h(huán)境脅迫代謝物積累導(dǎo)致的差異，以及這些差異性在相同環(huán)境條件下能否繼續(xù)保持相關(guān)性狀，需進(jìn)一步觀察研究。

3.2 不同種源間銀杏各性狀相關(guān)性

本研究中通過各性狀間的相關(guān)性比較，發(fā)現(xiàn)幼苗生長(zhǎng)特征與藥用成分含量間的相關(guān)性不高，證明銀杏一年生苗表型性狀不能對(duì)藥用優(yōu)良種源進(jìn)行間接選擇。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯C 含量與其他內(nèi)酯間和總萜類內(nèi)酯無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系，而其他內(nèi)酯間以及與總萜類內(nèi)酯間均顯著正相關(guān)，表明在萜類內(nèi)酯的提取和利用時(shí)，銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B 和白果內(nèi)酯含量在提取過程中可以相互參考。苗高與單株葉產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，說(shuō)明苗高對(duì)葉產(chǎn)量大小具有參考性，但是相關(guān)系數(shù)不能完全說(shuō)明苗高對(duì)葉產(chǎn)量的重要性，因?yàn)槿~產(chǎn)量性狀的表現(xiàn)是由葉大小、單葉重量和數(shù)量等一系列因子共同作用的結(jié)果。

綜上所述，本研究將4 個(gè)不同種源的銀杏種子，經(jīng)同質(zhì)園栽培后，子代幼苗的生長(zhǎng)性狀以及藥用成分含量具有顯著差異。發(fā)現(xiàn)這種差異是銀杏在經(jīng)過環(huán)境的長(zhǎng)期干擾后，其生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)子代生長(zhǎng)特性的表達(dá)產(chǎn)生了影響，并認(rèn)為這些差異可傳遞到子代是因?yàn)椴煌N源地環(huán)境的影響導(dǎo)致遺傳物質(zhì)發(fā)生改變主導(dǎo)的。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)幼苗生長(zhǎng)特征與藥用成分含量間的相關(guān)性不高。而不同種源地環(huán)境因子對(duì)子代的表現(xiàn)性狀有什么樣的相關(guān)性和銀杏的這些差異性在消除不同種源地環(huán)境影響后是否能繼續(xù)保持相關(guān)性狀，有待繼續(xù)觀察研究。