楊梅,石艷,石博文,陳玲,楊樺*

1.南江縣林業(yè)局,四川 南江 635600；2.康定市林業(yè)和草原局,四川 康定 626000；3.四川農(nóng)業(yè)大學林學院,四川 成都 611130

松材線蟲，原產(chǎn)于北美，是國際性的檢疫有害生物。由該線蟲引起的松材線蟲病，是目前全世界最嚴重的林業(yè)病害之一。該病主要靠媒介昆蟲傳播，而松墨天牛是其主要的媒介昆蟲之一。松材線蟲會通過氣孔進入松墨天牛體內(nèi)，松墨天牛羽化后攜帶大量的線蟲，在進行補充營養(yǎng)或產(chǎn)卵時將線蟲傳播到健康的松樹上。因此，防治該媒介昆蟲具有重大的意義。

白僵菌由于其寄主范圍較廣、適應性和致病性較強等特點，逐漸成為農(nóng)林害蟲生物防治中應用最多的蟲生真菌之一[1-3]。白僵菌可寄生包括鱗翅目、鞘翅目、同翅目等15 目的149 科521 屬的700 多種昆蟲。白僵菌屬的球孢白僵菌作為子囊菌中的蟲生真菌廣泛地存在于環(huán)境中。目前已有大量報道證明球孢白僵菌防治松墨天牛是完全可行的。國內(nèi)也在松墨天牛白僵菌資源方面進行了一些研究，篩選出了許多高毒力菌株[4-6]。然而只有來源于松墨天牛的球孢白僵菌在松墨天牛幼蟲上進行繼代移植后其毒力會得到增強，而在自然界中存在著許多來源于非松墨天牛的球孢白僵菌。因此探尋一種提高來源于非松墨天牛的球孢白僵菌對松墨天牛毒力的方法在對松墨天牛的生物防治中具有重要意義。

白僵菌對寄主的入侵是酶和機械壓力共同作用的結果[2]，在孢子萌發(fā)和入侵時都會分泌出一系列胞外水解酶來分解昆蟲表皮，包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和幾丁質(zhì)酶等[7-9]。張旦妮等[10]將球孢白僵菌孢子懸浮液與其蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶液混合后對松墨天牛幼蟲進行毒力測定，發(fā)現(xiàn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶無論是對來自松墨天牛還是來自松毛蟲的白僵菌的毒力均有極顯著的增效作用。因此在球孢白僵菌制劑中加入酶產(chǎn)品作為增效劑以提高其殺蟲效果，這可能為提高來源非松墨天牛的白僵菌對松墨天牛的毒力開辟一種新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲

松墨天牛：于2020 年10 月在四川省富順縣國有林場通過剖開枯死木采集松墨天牛4 齡幼蟲。挑選健康、大小一致的幼蟲放入裝有人工飼料的50 mL的離心管中，每管一頭，并將蓋頭鉆孔，以便通氣，最后放入25℃的人工氣候箱中飼養(yǎng)。

1.1.2 供試菌株

菌株來源：供試球孢白僵菌菌株于2021 年在四川省富順縣國有林場采集，為木芙蓉上的棉大卷葉螟（Sylepta derogata）自然感病球孢白僵菌，在室內(nèi)通過PDA 培養(yǎng)基純化分離獲得。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備

將球孢白僵菌菌株接種到PDA 培養(yǎng)基上，放入25℃、75%濕度條件下的人工氣候箱中培養(yǎng)14d，讓其充分產(chǎn)孢后，用無菌水將孢子粉洗入50 mL 0.1%的吐溫-80 無菌水溶液中，在磁力攪拌器上充分攪拌，等到孢子均勻分散后，即得到孢子懸浮液。在顯微鏡下用血球計數(shù)板計算孢子數(shù)量，得到初始濃度，最后稀釋相應的倍數(shù)配成濃度為1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL 的孢子懸浮液。

1.2.2 球孢白僵菌對松墨天牛幼蟲的毒力測定

采用浸漬法[11]：選取活力高、大小一致的松墨天牛的4 齡幼蟲作為供試幼蟲。用鑷子夾取幼蟲，頭部朝上，將胸部以下部分分別浸入1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL 的孢子懸浮液內(nèi)，接種3s 便挑出，以浸0.1%的吐溫-80 無菌水為對照（CK）。各處理設3 個重復，每一重復接種20 頭。將接種后的松天牛幼蟲放入離心管中培養(yǎng)14 d。每日觀察并記錄天牛幼蟲的發(fā)病過程、死亡情況。

1.2.3 酶液的制備

分別取1 ml 的1×108cfu/mL 的球孢白僵菌孢子懸浮液放入含100 mL 誘導蛋白酶、誘導脂肪酶培養(yǎng)基的錐形瓶中，在25℃、150 r/min 的條件下，在旋轉式搖床上培養(yǎng)5 d，3 層濾紙過濾，所得濾液即為蛋白酶液和脂肪酶液。幾丁質(zhì)酶液則需要在27℃、200 r/min 的條件下，在旋轉式搖床上培養(yǎng)7 d，經(jīng)3 層濾紙過濾后得到。

1.2.4 酶液對球孢白僵菌毒力的影響試驗

將3 種酶液經(jīng)0.22 μm 的濾頭過濾，按1:1 的比例分別與1×108cfu/ml 的球孢白僵菌孢子懸浮液均勻混合，記為Ⅱ液。其中，蛋白酶液、脂肪酶液、幾丁質(zhì)酶液分別記為Ⅱ（蛋）、Ⅱ（脂）、Ⅱ（幾）。同時，將過濾后的酶液，放入滅菌鍋中，以使三種酶液喪失酶活性，同樣按1:1 的比例分別與1×108cfu/ml的孢子懸浮液均勻混合，記為Ⅲ液。將1×108cfu/ml的孢子懸浮液記為Ⅰ液。以0.1%的吐溫-80 無菌水為對照，分別測定Ⅰ液、Ⅱ液、Ⅲ液對松墨天牛幼蟲的毒力，從而篩選出對球孢白僵菌毒力增效最好的酶。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS27.0 和Excel2010 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，計算不同濃度孢子懸浮液對松墨天牛4 齡幼蟲的累計死亡率和僵蟲率，并計算添加了酶液的孢子懸浮液對松墨天牛4 齡幼蟲的校正死亡率、毒力回歸方程、相關系數(shù)、LT50和95%置信限度等，并用LDS 法對進行差異顯著性分析。運用Excel2010 繪制相應的圖表。

2 結果與分析

1.1 材料

2.1.1 不同濃度球孢白僵菌對松墨天牛4 齡幼蟲的累計死亡率

1×105，1×106，1×107和1×108cfu/mL 的孢子懸浮液對松墨天牛4 齡幼蟲的累計死亡率測定結果見圖1。由圖可以看出，從第4 d 開始，不同濃度孢子懸浮液處理的天牛幼蟲開始出現(xiàn)死亡，但累計死亡率差異不大。第5 d 時，1×106，1×107和1×108cfu/mL孢子懸浮液的累計死亡率開始快速增加，而1×105孢子懸浮液的累計死亡率增長速率較小。第10 d 時，1×108cfu/mL 孢子懸浮液的累計死亡率達到100%。第13 d 時，1×107孢子懸浮液的累計死亡率達到100%。當試驗結束時（14 d），1×105，1×106，1×107和1×108cfu/mL 的孢子懸浮液的累計死亡率分別為26.7%、61.7%、100%、100%。所以從天牛幼蟲的致死效果來講，1×107和1×108cfu/ml 濃度要優(yōu)于1×105和1×106cfu/mL。

圖1 不同濃度球孢白僵菌對松墨天牛4 齡幼蟲的累計死亡率Fig.1 Cumulative mortality rate of B.bassiana at different concentrations on the 4th instar larvae of M.alternatus

2.1.2 不同濃度球孢白僵菌對松墨天牛4 齡幼蟲的僵蟲率

由圖2 可知，僵蟲率隨著濃度的降低而減小。1×108cfu/mL 濃度的僵蟲率最高，為88.3%；其次為1×107cfu/mL，為83.3%；僵蟲率最低的是1×105cfu/mL，為18.3%。1×108和1×107cfu/mL 濃度的僵蟲率差異不顯著（P>0.05），1×106和1×105cfu/mL濃度的僵蟲率差異顯著（P<0.05），而1×106和1×105cfu/mL 濃度的僵蟲率顯著低于1×108和1×107cfu/mL（P<0.05）。

圖2 不同濃度球孢白僵菌對松墨天牛4 齡幼蟲的僵蟲率Fig.2 Infection rate of B.bassiana at different concentrations on the 4th instar larvae of M.alternatus

經(jīng)過對4 種濃度球孢白僵菌的孢子懸浮液對松墨天牛4 齡幼蟲的累計死亡率和僵蟲率的比較分析，1×108cfu/ml 為最佳濃度。

2.2 酶液對球孢白僵菌毒力的增效作用

2.2.1 不同酶液對松墨天牛4 齡幼蟲的校正死亡率

1×108cfu/mL 的球孢白僵孢子懸浮液（Ⅰ型）、孢子懸浮液+酶液（Ⅱ型）、孢子懸浮液+滅活的酶液（Ⅲ型）3 種液體對松墨天牛4 齡幼蟲的校正死亡率測定結果見表1。Ⅱ型（幾）溶液處理后的幼蟲第2d 便開始出現(xiàn)死亡，而Ⅱ型（蛋），Ⅱ型（脂）分別在第3d，第4d 開始死亡。第8d 時，Ⅱ型（蛋）的校正死亡率首先達到100%，Ⅱ型（脂）、Ⅱ型（幾）第9d 校正死亡率達到100%，而Ⅰ型第10d 才達到。各溶液的校正死亡率達到100%之前，當處理時間相同時，蛋白酶、脂肪酶和幾丁質(zhì)酶的Ⅱ型溶液的校正死亡率均大于Ⅲ型；蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的Ⅱ型和Ⅲ型溶液的校正死亡率均大于Ⅰ型；而脂肪酶的Ⅱ型溶液，除第4d 和Ⅰ型的校正死亡率相同均為10.0%外，校正死亡率均大于Ⅰ型。脂肪酶的Ⅲ型溶液，除第5d 和Ⅰ型的校正死亡率相同均為15.5%外，校正死亡率均小于Ⅰ型。

表1 不同酶液對松墨天牛4 齡幼蟲的校正死亡率Tab.1 Adjusted mortality of 4th instar larvae of M.alternatus atdifferent enzyme solutions

2.2.2 不同酶液對松墨天牛4 齡幼蟲的半致死時間

由表2 可知，Ⅲ型（脂）的LT50最大，為6.97 d；Ⅱ型（蛋）的LT50最小，為5.50 d。蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的Ⅱ型和Ⅲ型溶液的LT50均小于Ⅰ型溶液，且差異性顯著（P<0.05）。同時，蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的Ⅱ型溶液的LT50也都顯著地小于Ⅲ型溶液的LT50（P<0.05），表明蛋白酶和幾丁質(zhì)酶對球孢白僵菌的毒力都有顯著的增效作用。而脂肪酶的Ⅱ型和Ⅲ型溶液的LT50與Ⅱ型溶液的LT50差異性并不顯著（P>0.05），表明脂肪酶對球孢白僵菌毒力增效作用并不顯著。蛋白酶的Ⅱ型溶液的LT50顯著的小于幾丁質(zhì)酶的Ⅱ型溶液的LT50（P<0.05）。因此，蛋白酶對球孢白僵菌毒力的增效作用強于脂肪酶。

表2 不同酶液對松墨天牛4 齡幼蟲的半致死時間Tab.2 LT50 of different enzyme solutions on the 4th instar larvae of M.alternatus

3 結論與討論

用白僵菌防治松墨天牛是最有前景的松材線蟲病生物防治的方法之一。但是，陶園媛等[12]從松墨天牛幼蟲上分離出2 株白僵菌對川硬皮腫腿蜂（Scleroderma sichuanensis）進行毒力測定，發(fā)現(xiàn)其毒力相差較大，因此同一寄主上分離出的不同菌株的毒力可能有較大的差異。而且同一菌株對不同的寄主的毒力差異也可能較大：經(jīng)多年生產(chǎn)篩選的防治松毛蟲的優(yōu)良菌株對于松墨天牛幼蟲卻屬于低毒力菌株[13]，不同菌株對害蟲寄生具有一定的專一性。因此可以通過在球孢白僵菌制劑中加入酶產(chǎn)品作為增效劑以提高其殺蟲效果。

在本實驗中，通過對比接種不同濃度的球孢白僵菌孢子懸浮液后的松墨天牛幼蟲的累計死亡率和僵蟲率發(fā)現(xiàn)，接種高濃度球孢白僵菌孢子懸浮液的松墨天牛幼蟲的累計死亡率和僵蟲率最高，而低濃度的孢子懸浮液對松墨天牛幼蟲也有一定的侵染性，說明球孢白僵菌孢子懸浮液對松墨天牛幼蟲的毒力受濃度的影響，濃度越高，毒力越強。這與郭涵[14]等研究孢懸液濃度對球孢白僵菌對松墨天牛幼蟲的致病力的影響的結果一致。因此選擇1×108cfu/mL為防治最佳濃度。將3 種酶液和孢子懸浮液混合后對松墨天牛4 齡幼蟲進行毒力測試，可以發(fā)現(xiàn)，蛋白酶液的LT50最小，為5.50 d，對球孢白僵菌毒力的增效作用最好。因此選擇蛋白酶液為最佳增效劑。本實驗所用的球孢白僵菌菌株并非來源于松墨天牛，而是從感病的棉大卷葉螟上分離得到的，其1×108cfu/mL 的孢子懸浮液的LT50為6.76 d，添加了蛋白酶液的孢子懸浮液LT50為5.50 d。林海萍[15]等認為來源于松墨天牛的球孢白僵菌菌株B5為高毒力菌株，LT50為5.63 d。因此，即使是來源于非松墨天牛上的菌株，添加蛋白酶液作為增效劑，其毒力也能達到來源于松墨天牛的高毒力菌株的水平。因此本實驗的結果，為如何增效來源非松墨天牛上的球孢白僵菌對松墨天牛的毒力來防治松墨天牛提供新的思路，為用酶作為增效劑提高球孢白僵菌毒力奠定理論基礎。