蔣文明，張琳，彭程，劉朔，尹馨，李金平，侯廣宇，劉華雷*

(1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物安全風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警及防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南方)，山東 青島 266032；3. 烏蘭察布職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000)

1966年，在北美威斯康辛州的火雞體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)并分離出H9N2亞型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)[1]。隨后，H9N2亞型AIV傳播到世界各地，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，成為全球主要流行的AIV亞型之一。我國(guó)于1992年在廣東地區(qū)首次分離出H9N2亞型AIV[2]。隨后，該亞型禽流感病毒快速傳播到主要養(yǎng)禽地區(qū)，在我國(guó)呈地方性流行、持續(xù)存在。病毒在進(jìn)化過(guò)程中，抗原漂移、基因重組現(xiàn)象十分普遍，甚至在同一個(gè)省份有多種H9N2亞型禽流感病毒流行。H9N2亞型禽流感一年四季均有發(fā)生，秋冬季最為嚴(yán)重，各日齡雞群均易感。H9N2亞型AIV除了引起典型的呼吸系統(tǒng)癥狀，導(dǎo)致較高的發(fā)病率外，還會(huì)成免疫抑制，如新城疫免疫失敗，產(chǎn)蛋率下降，繼發(fā)感染等，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

H9N2病毒除了危害養(yǎng)禽業(yè)，本身還可感染人類造成發(fā)病[3]，此外還為其他亞型流感病毒重組提供基因供體，危害人類的生命健康。2013年出現(xiàn)的H7N9病毒[4]和H10N8病毒[5]、2021年出現(xiàn)的H10N3病毒[6]、2022年出現(xiàn)的H3N8病毒[7]，這些病毒的內(nèi)部基因都來(lái)自H9N2病毒，重組后造成了人發(fā)病或死亡，嚴(yán)重威脅人類的健康。

為控制H9N2亞型AIV的傳播，中國(guó)大陸廣泛實(shí)施H9N2亞型AIV疫苗免疫計(jì)劃[8-9]，有效地減少了H9N2亞型AIV造成的經(jīng)濟(jì)損失，在H9N2亞型禽流感防控中發(fā)揮了重要作用。當(dāng)前，疫苗免疫仍是防控H9N2亞型AIV的主要手段，截至目前，我國(guó)批準(zhǔn)和使用的H9N2亞型禽流感疫苗毒種超過(guò)20種。然而隨著疫苗的高強(qiáng)度、高頻次使用，病毒的進(jìn)化和抗原變異也隨之加速[10]，加上病毒傳播能力強(qiáng)和傳播途徑多樣等因素導(dǎo)致了防控該病變得愈發(fā)困難，雖然疫苗免疫覆蓋率較高，但近年來(lái)H9N2亞型AIV在中國(guó)大部分地區(qū)仍然一直呈流行態(tài)勢(shì)。

密切關(guān)注該病毒的流行與變異，篩選候選疫苗株，對(duì)H9N2亞型禽流感防控及公共衛(wèi)生安全具有重要意義。本研究選取2019—2020年在全國(guó)分離獲得的9株H9N2亞型AIV，對(duì)其進(jìn)行了基因特性分析。進(jìn)一步利用血清學(xué)技術(shù)對(duì)這些毒株進(jìn)行了抗原性分析，并根據(jù)抗原性分析結(jié)果選擇合適的病毒株作為候選疫苗株進(jìn)行免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)，評(píng)價(jià)疫苗免疫效力。

1 材料與方法

1.1 病毒株

9株H9N2亞型禽流感病毒(A/chicken/Sichuan/C2300/2019、A/chicken/Guangdong/G2225/2019、A/chicken/Hubei/H2049/2019、A/goose/Jilin/N2029/2019、A/chicken/Jiangxi/X2210/2019、A/chicken/Jiangxi/X2326/2019、A/duck/Yunnan/Y2432/2020、A/chicken/Jiangsu/J1443/2020、A/duck/Shandong/BHXH/2020)由本室分離鑒定保存。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒QIAamp Viral RNA mini Kit，購(gòu)自凱杰生物技術(shù)(上海)有限公司；RT-PCR試劑盒Hiscript One Step RT-PCR Kit，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；SPF雞胚自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司；SPF雞購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 病毒RNA提取與血凝素(HA)基因擴(kuò)增分析

根據(jù)QIAamp Viral RNA mini Kit說(shuō)明書提取病毒RNA，參考文獻(xiàn)[11]對(duì)提取病毒RNA進(jìn)行HA基因擴(kuò)增，產(chǎn)物送青島睿博生物科技有限公司測(cè)序。對(duì)序列進(jìn)行同源性、受體結(jié)合位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)等生物特性分析。

1.4 單因子血清制備

對(duì)病毒進(jìn)行10倍倍比稀釋，以10-4稀釋度接種9～11日齡雞胚，每胚接種0.1 mL，37 ℃孵化培養(yǎng)72 h，測(cè)定血凝價(jià)后無(wú)菌收集尿囊液，加入甲醛溶液至終濃度0.2%，4 ℃滅活48 h。滅活后的病毒通過(guò)皮下途徑免疫4～5周齡SPF雞，首次免疫14 d后加強(qiáng)免疫1次，二免后每7 d采集1次血液分離血清，測(cè)定血凝抑制(HI)效價(jià)，如果大于1∶256，則剖殺雞只，收集所有血清，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 交叉HI試驗(yàn)

1.6 雞胚半數(shù)感染量(EID50)測(cè)定

將病毒進(jìn)行10倍倍比稀釋，接種(10-6、10-7、10-8、10-9)9～11日齡SPF雞胚，37 ℃孵育3 d，測(cè)定雞胚尿囊液的血凝效價(jià)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒的EID50。

1.7 交叉中和試驗(yàn)

1.8 抗原譜繪制

使用AntigenMap軟件對(duì)交叉HI試驗(yàn)和中和試驗(yàn)進(jìn)行分析，繪制抗原圖譜。

1.9 攻毒試驗(yàn)

選擇抗原譜較廣的Y2432作為種毒制備油乳劑滅活疫苗。將3周齡SPF雞45只分成6組，3組試驗(yàn)組，每組10只；3組對(duì)照組，每組5只。試驗(yàn)組每只雞頸部皮下注射疫苗0.3 mL。接種3周后，試驗(yàn)組和對(duì)照組采用靜脈注射途徑分別用親本毒Y2432、抗原性差異較大的毒株H2049以及臨床發(fā)病毒株LH240攻毒，0.2 mL/只(含2 × 106.0EID50)。攻毒后分別于第3和5天采集每只雞的咽拭子和泄殖腔拭子，進(jìn)行病毒分離。對(duì)病毒分離陰性的樣品，盲傳1次。

1.10 免疫持續(xù)期試驗(yàn)

以Y2432毒株制備油乳劑滅活疫苗，免疫5只3周齡SPF雞，每周分離血清測(cè)定HI效價(jià)，試驗(yàn)持續(xù)到140 d結(jié)束。

2 結(jié)果

2.1 HA基因擴(kuò)增與序列分析

HA基因經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增測(cè)序，發(fā)現(xiàn)除X2326毒株外，其余8株病毒HA編碼區(qū)基因全長(zhǎng)均為1 683 bp，編碼561個(gè)氨基酸；而X2326毒株在nt42之后插入6個(gè)堿基，編碼563個(gè)氨基酸。9株病毒HA基因核苷酸同源性為91.2%～98.9%(表1)，遺傳進(jìn)化樹顯示2019—2020年我國(guó)H9N2亞型禽流感毒株之間HA基因分化明顯，部分毒株之間差異較大(圖1)。9株病毒HA蛋白裂解位點(diǎn)序列均為RSSR，符合低致病性禽流感分子特征[13]。所有9株病毒HA均含有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分別位于29、82、141、298、305、313、492位。對(duì)9株病毒HA關(guān)鍵受體結(jié)合位點(diǎn)分析，234位氨基酸由谷氨酰胺(Q)變?yōu)榱涟彼?L)，提示這些毒株具有結(jié)合α2，6-Sialidase受體的能力[14]。

表1 9株H9N2亞型AIV生物學(xué)特征

●為本研究毒株

2.2 EID50

如表1，各毒株的EID50為10-7.38～10-9.17/0.1 mL。

2.3 交叉HI試驗(yàn)

如表2顯示，各毒株之間出現(xiàn)了0～64倍的抗原性差異。根據(jù)抗原相關(guān)系數(shù)(表3)，Y2432、BHXH、C2300 3個(gè)毒株與所有毒株HI反應(yīng)性較好，抗原性無(wú)明顯差異。H2049與G2225、N2029、X2210、X2326毒株抗原性出現(xiàn)小的差異，N2029與J1443之間、J1443與X2210之間抗原性出現(xiàn)小的差異。結(jié)果顯示，即使同一時(shí)期分離的毒株，HI抗原性也出現(xiàn)差異。

表2 毒株之間交叉血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果(血凝抑制效價(jià))

表3 交叉血凝抑制試驗(yàn)抗原相關(guān)系數(shù)

2.4 交叉中和試驗(yàn)

如表4顯示，各毒株之間出現(xiàn)了0～1 024倍的抗原性差異。H2049和J1443 2個(gè)毒株只對(duì)自身和互相之間反應(yīng)性較好，對(duì)其他毒株的交叉反應(yīng)性差，而X2326、Y2432、BHXH除了對(duì)H2049和J1443 2個(gè)毒株的交叉反應(yīng)性較差以外，對(duì)其他毒株的交叉反應(yīng)性都很好，結(jié)果提示可能至少存在2種不同抗原類型。根據(jù)計(jì)算的抗原相關(guān)性系數(shù)，H2049和J1443毒株與其他毒株間的抗原性存在明顯差異(表5)。

表4 各毒株之間交叉中和試驗(yàn)結(jié)果(中和效價(jià))

表5 交叉中和試驗(yàn)抗原相關(guān)系數(shù)

2.5 抗原圖譜繪制

根據(jù)中和試驗(yàn)結(jié)果，利用AntigenMap制作抗原圖譜(圖2)。若交叉中和試驗(yàn)抗體效價(jià)存在2倍差異，則用一個(gè)網(wǎng)格進(jìn)行表示。根據(jù)抗原圖譜中不同抗原群的分布，可以看出存在2個(gè)主要抗原群。

圖2 9株H9N2病毒抗原圖譜分析

2.6 免疫攻毒試驗(yàn)

滅活疫苗Y2432免疫雞群后21 d，針對(duì)同源毒株平均HI效價(jià)達(dá)到13.6 log2，選擇疫苗同源毒株和抗原群明顯不同的H2049毒株以及實(shí)驗(yàn)室2021年分離自臨床發(fā)病雞群的毒株A/chicken/Shandong/LH240/2021(LH240)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。攻毒后第3、5天分別采集雞群的咽肛拭子接種接胚，免疫組病毒分離結(jié)果全部為陰性，而對(duì)照組全部排毒，說(shuō)明疫苗針對(duì)同源和異源毒株的保護(hù)率均為100%(表6)。

表6 Y2432滅活疫苗免疫效果評(píng)估(免疫后21 d)

2.7 抗體消長(zhǎng)規(guī)律

滅活疫苗Y2432免疫5只SPF雞，每周測(cè)定抗體效價(jià)，連續(xù)監(jiān)測(cè)20周，觀察抗體的消長(zhǎng)變化。如圖3所示，抗體在0～21 d呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，到42 d達(dá)到高峰，平均效價(jià)達(dá)到14.4 log2，之后抗體保持一段時(shí)間的平臺(tái)期。第11周后抗體滴度開始下降，到監(jiān)測(cè)的最后一周HI滴度下降至8.8 log2。

3 討論

H9N2亞型AIV雖然屬于低致病性AIV，但是病毒可以侵害家禽的多個(gè)系統(tǒng)，如呼吸、系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等。單一感染后家禽往往不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，有時(shí)只表現(xiàn)輕微的呼吸道癥狀，如咳嗽、噴嚏。但病毒對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用，使其容易與其他病毒混合感染，或者繼發(fā)細(xì)菌感染，從而導(dǎo)致家禽發(fā)病加重，出現(xiàn)較為嚴(yán)重的諸如呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋率和孵化率下降、蛋品質(zhì)下降，肉禽出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩、料肉比上升以及后期死亡率升高、死淘率增加，對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大[15]。

值得一提的是，H9N2亞型AIV的內(nèi)部基因可以作為供體為其他亞型的AIV提供內(nèi)部基因，例如2013年我國(guó)出現(xiàn)的H7N9亞型流感病毒的6個(gè)內(nèi)部基因都是來(lái)自H9N2亞型AIV，最終造成了1 568人感染和615人死亡[16]。該病毒的多年持續(xù)流行已經(jīng)對(duì)我國(guó)家禽養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全形成了巨大隱患[17-18]。

目前疫苗接種仍然是防控H9N2亞型禽流感的重要措施。但是隨著病毒的不斷變異，家禽經(jīng)過(guò)免疫后，H9N2亞型禽流感仍時(shí)有發(fā)生。研發(fā)抗原譜更廣、抗原性更強(qiáng)的疫苗對(duì)于控制H9N2亞型AIV的傳播顯得更為重要。HA蛋白是AIV最主要的保護(hù)性抗原，其在病毒吸附以及穿膜過(guò)程中起關(guān)鍵作用，并可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，從而抵抗病毒感染[19]。此外，HA是AIV變異率最高的蛋白，是病毒發(fā)生抗原變異的主要原因。本研究的9株病毒HA同源性最大的差異已經(jīng)達(dá)到8.2%，說(shuō)明部分毒株間HA蛋白變異明顯。而HI交叉中和試驗(yàn)中毒株間抗原性最大相差64倍，血清中和試驗(yàn)中毒株間抗原性最大相差1 024倍，這與基因序列分析結(jié)果相符。

HA蛋白的糖基化與病毒的感染和入侵、宿主細(xì)胞受體結(jié)合、病毒免疫逃逸以及抗原性密切相關(guān)[20]。本研究中的9株病毒糖基化位點(diǎn)相同，說(shuō)明其抗原性的差異可能與糖基化無(wú)關(guān)[21]，可能受抗原表位差異的影響所導(dǎo)致[22]。

本研究選取了9株2019—2020年實(shí)驗(yàn)室分離的H9N2亞型AIV，利用血清學(xué)技術(shù)對(duì)這些毒株進(jìn)行抗原性分析。同時(shí)，根據(jù)抗原性分析結(jié)果選擇病毒株作為疫苗候選株進(jìn)行攻毒免疫保護(hù)試驗(yàn)，評(píng)估疫苗免疫效力。血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示，9個(gè)毒株免疫SPF雞后，針對(duì)同源毒株抗體水平都較高，具有良好的免疫原性；中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，毒株H2049和J1443 2個(gè)毒株只對(duì)自身和互相產(chǎn)生較高的保護(hù)力，而對(duì)其他毒株沒(méi)有較高的保護(hù)力，而其他的6個(gè)毒株的交叉保護(hù)力相差不大，結(jié)果提示可能存在2種不同抗原類型?？乖嚓P(guān)系數(shù)分析表明，H2049、J1443毒株與其他毒株間的R值都較小，表示抗原之間抗原性差異大。綜合交叉血凝抑制試驗(yàn)和中和試驗(yàn)的結(jié)果，分析存在明顯不同的2個(gè)抗原群。根據(jù)交叉血凝抑制試驗(yàn)和中和試驗(yàn)的結(jié)果，選擇抗原性好、抗原譜廣的Y2432毒株作為疫苗候選株，免疫雞群后用2個(gè)抗原群的病毒攻毒，都能夠完全保護(hù)。免疫持續(xù)期結(jié)果顯示，Y2432滅活疫苗免疫雞群后，14 d即可產(chǎn)生高水平抗體，最高可達(dá)到14.4 log2，且抗體可維持140 d以上，疫苗免疫原性和免疫保護(hù)效果較好，能達(dá)到臨床使用要求。該疫苗為預(yù)防H9N2亞型禽流感的流行提供了重要技術(shù)儲(chǔ)備。