趙文影，黃柏成，謝莉敏，衛(wèi)璐璐，楊倩，張云靜，高曉靜，田克恭

(國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471003)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的高度接觸性、傳染性腸道疾病，主要臨床表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、厭食和脫水等[1]。1976年P(guān)ensaert等[1]在英國和比利時豬場首次發(fā)現(xiàn)PEDV，19世紀(jì)80年代中國首次出現(xiàn)，在豬群中一直呈地方性流行，1994年Sun等[2]研制的CV777株滅活疫苗對豬群有很好的保護效果。直至2010年底，中國豬群中暴發(fā)大面積PED疫情，繼而自2013年開始美國、加拿大、日本和哥倫比亞等地相繼有高毒力PEDV變異株[3-4]引發(fā)疫情的報道?，F(xiàn)有疫苗不能對豬群提供完全免疫保護。

PEDV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于α冠狀病毒屬。PEDV基因組全長約28 kb，從5′至3′依次為5′UTR-ORF1a-ORF1b-S-ORF3-E-M-N-3′UTR-PloyA[5]。PEDV S蛋白是糖基化蛋白，由受體結(jié)合亞基S1和膜融合亞基S2組成。S1結(jié)構(gòu)域?qū)τ谧R別和結(jié)合細(xì)胞受體很重要[6-7]，而S2結(jié)構(gòu)域?qū)Σ《镜慕M織趨向性和細(xì)胞感染能力具有一定的影響[8]。S蛋白可以激活宿主產(chǎn)生中和抗體，目前公認(rèn)的中和抗體表位分別是COE(499～638aa)、SS2(748～755aa)、SS6(764～771aa)、2C10(1 368～1 374aa)[9]。此外，S基因容易發(fā)生突變，常以S基因作為分子流行病學(xué)研究對象，在一定程度上反映PEDV全基因變異情況。根據(jù)S基因的變異情況可以將PEDV毒株劃分為6個亞群，分別是GⅠa亞群、GⅠb亞群、S INDEL亞群、GⅡa亞群、GⅡb亞群和重組亞群[10]。

本試驗利用RT-PCR方法對732份腹瀉樣品進行PEDV核酸檢測，選擇PEDV陽性樣品進行S基因擴增、測序，應(yīng)用MEGA6.0和MegAlign軟件對測序毒株S基因進行遺傳變異分析，并運用軟件對其編碼的S蛋白進行氨基酸序列分析，為監(jiān)測國內(nèi)PEDV毒株遺傳變異情況及研發(fā)有效疫苗提供技術(shù)儲備和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

2×TransTaq?-T PCR Super Mix (+dye)和EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京全式金生物公司；Viral Nucleic Acid Extraction Kit II 核酸提取試劑盒購自臺灣旭基生物公司，溴化乙錠溶液(EB)和50×TAE電泳緩沖液購自上海生工生物公司，DNA Marker和瓊脂糖購自TaKaRa生物公司。

1.1.2 樣品采集

2020—2021年從全國16個省市(自治區(qū))采集腹瀉病料732份，其中包含腹瀉仔豬小腸組織和糞便拭子。樣品采集時間、地點和數(shù)量詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 病料處理

選取有病變的小腸腸道組織，擠出腸內(nèi)容物，并用載玻片反復(fù)刮取腸壁，取300 μL腸內(nèi)容物加入含500 μL滅菌PBS的EP管內(nèi)，顛倒混勻后，4 ℃離心5 min(12 000 r/min)，之后取200 μL的上清液保存?zhèn)溆?。向采集的糞便拭子中加入1 mL滅菌的PBS，震蕩混勻后，4 ℃離心5 min(12 000 r/min)，之后取200 μL的上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計

PEDV鑒定引物按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 34757—2017《豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測方法》設(shè)計合成，上游引物：5′-TATGGCTTGCATCACTCTTA-3′，下游引物：5′-TTGACTGAACGACCAACACG-3′，目的片段大小為315 bp；PEDV S基因測序引物設(shè)計：通過比對GenBank中所有毒株的全基因組序列，設(shè)計3對測序引物用于S基因的擴增。引物設(shè)計示意圖見圖1，序列及擴增片段大小見表2。引物由蘇州金唯智生物公司合成。

圖1 PEDV S全基因測序引物示意圖

表2 PEDV S全基因測序的引物信息

1.2.3 RNA模板提取

取處理后的病料，按照Viral Nucleic Acid Extraction Kit II試劑盒說明書進行RNA的提取。

1.2.4 cDNA合成

取抽提后的RNA，按照EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。

1.2.5 PCR擴增

取1.2.4中合成的cDNA作為模板進行PCR的擴增，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與2×TransTaq?-T PCR Super Mix (+dye)試劑說明書基本保持一致，鑒定引物和測序引物的退火溫度均為55 ℃，72 ℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 測序與分析

將3對引物擴增獲得的PCR產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物公司測序。運用SeqMan軟件對產(chǎn)物序列進行分析、拼接、剪切，獲得各毒株完整的S基因序列。選擇GenBank中代表性PEDV毒株S基因，毒株及序列號見表3。應(yīng)用MEGA 6.0軟件與測序毒株S基因序列進行比較分析并建立遺傳進化樹。用MegAlign軟件對S基因進行核苷酸序列一致性分析(Clustal W法)，同時推導(dǎo)S基因編碼蛋白的氨基酸序列，分析比較PEDV不同毒株的遺傳變異性。

表3 PEDV參考毒株序列信息

2 結(jié)果

2.1 臨床病料PEDV特異性RT-PCR檢測

對732份腹瀉樣本進行PEDV特異性RT-PCR擴增，結(jié)果489份樣本出現(xiàn)315 bp的DNA條帶，與預(yù)期條帶一致，判定為PEDV陽性，陽性率為66.80%。不同省份PEDV陽性率見表4。

表4 不同省份臨床樣品PEDV陽性率

2.2 PEDV S基因RT-PCR擴增

對于489份PEDV陽性樣本，根據(jù)采樣時間、批次、地域的不同選擇樣本，同一地域同一時間采集的同一批次樣本選取1份樣本，共選擇76份樣本進行S基因擴增。應(yīng)用3對引物分別獲得長度約為1 770、1 610、1 556 bp的DNA條帶，與預(yù)期條帶一致(見圖2)。

M. DL2000 DNA Marker；1～3. 代表引物對ORF1b-F+SR1、引物對SF2+SR2和引物對SF3+ORF3-R的RT-PCR產(chǎn)物。

2.3 PEDV S基因序列分析

將獲得的上述PCR產(chǎn)物測序，并運用SeqMan軟件對擴增的3段基因片段進行拼接與剪切，共獲得76株完整PEDV毒株的S基因序列(詳見表5)。其中，49株S基因序列全長為4 161 bp；20株全長為4 158 bp；5株(BJ20-2021株、JSYC23-2020株、ZJQZ15-2021株、FJFZA-2020株、SCLS3-2021株)全長為4 149 bp。推導(dǎo)出S基因分別編碼1 386、1 385和1 382個氨基酸。此外，有2株S基因全長為4 170 bp(GXNN14-2021株)和4 155 bp(FJFZD-2020株)，不同于其他毒株序列。不同毒株之間的S基因核苷酸序列一致性為93.9%～100%，S基因編碼氨基酸序列一致性為93.7%～100%。

表5 PEDV測序毒株S基因序列信息

2.4 PEDV S基因遺傳進化分析

參考GenBank收錄的毒株序列的S基因，對獲得的76個毒株序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和分析。結(jié)果顯示(圖3)，與國內(nèi)外參考毒株相比，有5個測序毒株(BJ20-2021株、JSYC23-2020株、ZJQZ15-2021株、FJFZA-2020株、SCLS3-2021株)與S-INDEL型毒株序列處同一進化分支，屬于S-INDEL型，其余71個測序毒株與GⅡb型毒株序列處同一大的進化分支，屬于GⅡb型。這些毒株序列與2010年以后的流行株核苷酸一致性為96.8%～99.4%，親緣關(guān)系較近，與早期分離的GⅠ型毒株核苷酸一致性為92.1%～95.0%，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

注：藍(lán)色標(biāo)記代表2020年獲得的毒株序列；紅色標(biāo)記代表2021年獲得的毒株序列。

整體來看，全國各地PEDV毒株流行趨勢呈散在流行，其主要流行毒株為GⅡb型，其次是S-INDEL型。從同一地區(qū)、不同時間采集的樣本來看，同一省份內(nèi)的流行毒株S基因序列存在不同程度的變異情況。如貴州省銅仁市，從2020—2021年間共獲得5株毒株序列，其中2020年的2株核苷酸序列(GZTR8-2020和GZTR22-2020)處不同的進化分支，其核苷酸序列一致性為98.4%；2021年3株核苷酸序列(GZTR9-2021、GZTR21-2021和GZTR28-2021)處同一進化分支，核苷酸序列一致性為100%。2020年的一株(GZTR22-2020)核苷酸序列與2021年貴州安順市的毒株序列處同一進化分支，其核苷酸一致性為99.8%，而另一株(GZTR8-2020株)的核苷酸序列與2021年貴州銅仁市的3個毒株序列遺傳距離較近，其核苷酸一致性為99.9%。另外，江蘇省鹽城市，在2020年獲得2株核苷酸序列，2021年獲得2株核苷酸序列，其中2020年獲得的一株毒株(JSYC23-2020株)的核苷酸序列與S-INDEL型處同一進化分支，與S-INDEL型中的OH581株的核苷酸一致性為97.6%；另外3株(JSYC4-2020、JSYC2-2021和JSYC01-2021)核苷酸序列處于不同小分支，其核苷酸序列一致性為在98.5%～99.2%。詳見圖4。

2.5 PEDV S蛋白中和表位分析

根據(jù)S基因序列，通過軟件推導(dǎo)76株P(guān)EDV S基因編碼的氨基酸序列，并與CV777株進行比較進行。PEDV S蛋白中和表位COE(499～638aa)、SS2(748～755aa)、SS6(764～771aa)和2C10(1 368～1 374aa)。結(jié)果表明(見表6和圖5)，76株P(guān)EDV S蛋白的SS2(748～755aa)中和表位氨基酸序列非常保守；75株P(guān)EDV S蛋白的2C10(1 368～1 374aa)中和表位氨基酸序列保守，而另1株(FJND07-2021株)在該中和表位1 373位氨基酸存在突變(Y1373C)；75株P(guān)EDV S蛋白的SS6(aa 764-771)中和表位氨基酸序列由SQYGQVKI突變?yōu)镾QSGQVKI，1株(FJFZA-2020)由SQYGQVKI突變?yōu)镾QSGQVKV；76株P(guān)EDV S蛋白中和表位COE(499～638aa)區(qū)域有8個氨基酸位點的一致性突變(A517S、V527I、S523G、T549S、G594S、A605E、L612F、T635V)，而在521aa位點存在5種突變形式，67條氨基酸序列由L突變H，3條氨基酸序列由L突變Y，3條氨基酸序列由L突變P，2條氨基酸序列由L突變Q，1條氨基酸序列由L突變R。

表6 PEDV S蛋白中和表位COE主要氨基酸位點突變

此外，將76株測序毒株與LW-L株(GⅡ型疫苗代表株)進行中和表位區(qū)域氨基酸序列的比較分析，結(jié)果顯示：76株P(guān)EDV S蛋白中和表位SS6和SS2區(qū)域氨基酸序列非常保守；75株中和表位2C10區(qū)域非常保守，1株(FJND07-2021株)在該中和表位1373位氨基酸存在突變(Y1373C)；76株P(guān)EDV S蛋白中和表位COE(499～638aa)中有1個氨基酸位點的一致性突變A517S，521aa位點存在4種突變形式，67條氨基酸序列保持一致，3條氨基酸序列由H突變Y，3條氨基酸序列由H突變P，2條氨基酸序列由H突變Q，1條氨基酸序列由H突變R。而523aa、527aa、549aa、594aa、605aa、612aa和635aa位點均未發(fā)生突變。

2.6 PEDV S蛋白氨基酸位點分析

對76株P(guān)EDV毒株S基因編碼的氨基酸序列分析(圖6)，結(jié)果顯示，與CV777株相比，71株在59～60位氨基酸之間存在4個氨基酸(QGVN)插入，在139～140位氨基酸之間存在1個氨基酸(N)的插入，在154～157位氨基酸處存在2個氨基酸的缺失；5株與S INDEL型以及CV777株表現(xiàn)出幾處相同的遺傳標(biāo)記且在139位氨基酸處存在1個氨基酸的缺失；此外，F(xiàn)JFZD-2020株與LW-L株具有相同的遺傳標(biāo)記，在55～58位氨基酸之間存在2個氨基酸的缺失；GXNN14-2021株在375～376位氨基酸之間存在3個氨基酸(GGE)的插入；ZJLS10-2021株在1 264～1 265位氨基酸之間存在一個氨基酸(Ⅰ)的插入。GⅡ型流行毒株間比較發(fā)現(xiàn)，有20株GⅡ型田間株(S基因全長為4 158 bp，代表株為FJND07-2021)在1 193～1 194位氨基酸之間存在1個氨基酸的缺失。

注：“-”表示氨基酸缺失；“.”表示氨基酸相同；紅色方框表示測序毒株與PEDV不同基因型代表株的差異。

與GⅡ型疫苗株AJ1102株、LW-L株相比，全長大小為4 149 bp的5株毒株氨基酸序列，在137～140位氨基酸之間存在2個氨基酸的缺失。

3 討論

近年來，PEDV的持續(xù)流行對中國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失?，F(xiàn)有的措施如疫苗接種、生物安全，均無法有效阻止PEDV的傳播。Zhang等[11]2016—2017年對國內(nèi)6個省市的116份樣品進行PEDV、豬冠狀病毒(PDCoV)、豬傳染性胃腸類病毒(TGEV)、豬柯布病毒(PKV)核酸檢測，結(jié)果顯示幾種腹瀉類病原的陽性率依次為52.6%、0.00%、0.00%、19.8%，PEDV陽性率最高。Su等[12]2015—2017年在國內(nèi)22個省市開展PED流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，PEDV陽性率最高。本試驗對2020—2021年采集的732份腹瀉樣品進行PEDV測定，也同時進行了豬輪狀病毒(PRoV)、PDCoV、TGEV和豬急性腹瀉綜合征病毒(SADS-CoV)核酸檢測，結(jié)果顯示PEDV核酸陽性率最高，說明PEDV是影響豬群腹瀉的主要病原，其次是PRoV和PDCoV。此外，本試驗結(jié)果也從另一個方面提示PEDV毒株仍在高度變異，且PEDV商品化腹瀉疫苗不能提供完全免疫保護。

PEDV S基因是主要的抗原變異基因，負(fù)責(zé)誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體、與受體結(jié)合和細(xì)胞融合。S基因高度的遺傳變異性，特別是S1結(jié)構(gòu)域的N端區(qū)域，通常被認(rèn)為是S基因遺傳變異的重要分子特征[7，13-15]。S蛋白的缺失、插入或突變可能與病毒的致病性和組織嗜性有關(guān)[16]。對PEDV的S蛋白分析表明，其N端的氨基酸突變、插入和缺失可能導(dǎo)致GⅡ型毒株的毒力增加，也使得GⅠ疫苗株無法保護豬免受PEDV侵害[17-19]。

本研究擴增得到76株S基因序列，這些毒株之間S基因核苷酸序列一致性為93.9%～100%，S基因編碼氨基酸序列一致性為93.7%～100%，其中71株為GⅡb型，5株為S-INDEL型，表明2020—2021年中國流行的PEDV毒株類型為GⅡb型。另外，對同一城市、不同時間流行毒株的S基因序列分析表明，2021年貴州銅仁毒株序列核苷酸一致性為100%，2020年貴州銅仁的2株毒株序列與2021年存在差異，提示這可能與病料的來源、地域、豬群的來源有關(guān)。與CV777株相比，獲得的76個毒株中有71株P(guān)EDV S蛋白氨基酸序列N端存在4個氨基酸的插入和1個氨基酸的插入，以及2個氨基酸的缺失，這與文獻[7-20]報道一致；與S-INDEL型相比，位于S-INDEL型分支的毒株氨基酸序列除與S-INDEL具有相同的遺傳特征外，在S蛋白N端多處存在氨基酸突變且在139～140位氨基酸處有1個氨基酸的缺失，提示中國本土S-INDEL型在選擇壓力下可能發(fā)生變異。對PEDV S蛋白4個中和表位分析發(fā)現(xiàn)COE(499～638aa)區(qū)域易發(fā)生氨基酸突變，這可能是GⅠ型疫苗不能對機體提供免疫保護的原因。

這些氨基酸的變化可能對病毒的抗原性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致免疫逃逸和免疫失敗。除了文獻報道的常見氨基酸缺失和氨基酸插入之外，本試驗發(fā)現(xiàn)ZJLS10-2021株與其他亞群代表株相比，在1 264～1 265位氨基酸之間存在1個氨基酸(I)的插入。目前對于這些氨基酸突變對病毒抗原性和致病性的研究還未知。這些數(shù)據(jù)表明PEDV S基因仍在高度變異，僅針對某一毒株類型的疫苗無法對機體提供高效的免疫保護，目前研發(fā)新型有效疫苗用于豬PED的防控是當(dāng)務(wù)之急。

4 結(jié)論

本研究檢測2020—2021年采集的732份腹瀉病料，PEDV核酸陽性率為66.80%；共獲得76株P(guān)EDV S基因序列，序列分析表明71株屬于GⅡb型，5株屬于S-INDEL型；S蛋白氨基酸序列分析表明，與CV777疫苗株相比，這些毒株N端多處存在氨基酸突變、插入或缺失。本研究結(jié)果為進一步監(jiān)測和分析引起我國豬群腹瀉的原因，追蹤溯源PEDV傳播的途徑和遺傳變異規(guī)律提供了有力的數(shù)據(jù)支持，同時為豬腹瀉病的防控和疫苗研發(fā)提供理論和技術(shù)參考。