王楚文，李玉林，石盼盼，左蕾，閆生輝，王云龍，*

(1. 鄭州大學生命科學學院，河南 鄭州 450000；2. 河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450000；3. 鄭州職業(yè)技術(shù)學院生命健康學院，河南 鄭州 450000)

非洲豬瘟對豬的致病性以病程短、高熱和出血性病變?yōu)橹饕卣?，具有極強的傳染性和較高的病死率。自2018年傳入我國以來，給養(yǎng)豬業(yè)帶來沉重打擊，是重點防范的一類動物疾病[1]。針對該疾病目前已開展多種疫苗研究，其中，亞單位疫苗具有比傳統(tǒng)疫苗安全性高、可操作性強、能夠規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢，成為非瘟疫苗研制的主要方向之一[2]。然而，優(yōu)選的抗原片段因缺乏致病成分，難以激活天然免疫，因此需要使用佐劑協(xié)同疫苗誘導強烈、持久的免疫反應[3]。靈芝多糖是靈芝中含量最豐富的成分之一，具有多種生物活性，可促進巨噬細胞增殖，以及T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞和其他免疫細胞的活化，促進脾細胞增殖并產(chǎn)生細胞因子和抗體[4]。因此，可利用靈芝多糖提高疫苗免疫效果。本研究采用納米技術(shù)制備靈芝多糖納米乳佐劑并對其進行初步應用和品質(zhì)評價，旨在開發(fā)一種安全有效的佐劑提高疫苗質(zhì)量，并為研發(fā)安全、高效且易于使用的疫苗佐劑提供參考和方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

非洲豬瘟病毒重組抗原P72溶液由河南省生物技術(shù)研究中心提供；醫(yī)用白油52號購自美國?？松梨诨ど虅沼邢薰荆籗pan-80、Tween-80、PEG-400購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；靈芝多糖購自楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司；ISA201 VG、ISA61 VG、ISA15 VG購自賽彼科(上海)特殊化學品有限公司。剪切乳化機購自弗魯克流體機械制造有限公司；馬爾文激光粒度儀購自英國馬爾文公司；超聲細胞破碎儀(超聲探頭16#)購自寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平購自奧豪斯儀器有限公司；高速離心機購自湖南湘儀儀器有限公司。

1.2 組方篩選

1.2.1 納米乳組分的確定

綜合考慮組分原料的安全性等因素，選擇進口醫(yī)用白油Marcol-52為制備納米乳的油相，常用的非離子表面活性劑Span-80、Tween-80為制備納米乳的表面活性劑，PEG-400為助表面活性劑。

1.2.2 表面活性劑復配比例篩選

采用復合表面活性劑，以進口醫(yī)用白油Marcol-52為油相，PEG-400為助表面活性劑，固定Km=2∶1，繪制偽三元相圖，篩選出Span-80、Tween-80最佳復配比例。

1.2.3 Km值篩選

將表面活性劑與助表面活性劑按照質(zhì)量比3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3混合均勻，繪制偽三元相圖，篩選出最佳Km值。

1.2.4 水滴定法繪制偽三元相圖[5]

將油相與復配后的表面活性劑按質(zhì)量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1準確稱量并置于平底玻璃燒杯中。在室溫條件下，邊攪拌邊緩慢滴加水相至溶液澄清，然后根據(jù)最終加入的水相質(zhì)量，計算乳液體系各組分在臨界點的質(zhì)量百分比，使用Origin 2021軟件繪制納米乳相應的偽三元相圖。

1.2.5 水包油型靈芝多糖納米乳組方確定及制備

選取偽三元相圖納米乳區(qū)的中央附近點作為納米乳處方。從“1.2.3”篩選的偽三元相圖中央選取5個點作為乳液候選配方，檢測各組乳液體系粒徑、聚合物分散指數(shù)(PDI)、黏度和離心穩(wěn)定性。

1.3 乳化方法篩選

1.3.1 免疫制劑制備

將ASFV-P72抗原溶液與佐劑ISA201 VG、ISA61 VG、ISA15 VG混合，按照說明書制備疫苗候選物備用。

將200 g靈芝多糖溶于抗原緩沖液中配制20%的靈芝多糖溶液，與ASFV-P72抗原原液混合制備含1%、2%、4%、8%、10%靈芝多糖的抗原溶液，分別與“1.2.5”中制備的GLP-NE佐劑混合，用于乳化方法探究。

1.3.2 不同乳化方法GLP-P72疫苗候選物的制備

將稀釋后的非洲豬瘟病毒P72抗原溶液分別在剪切攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為300、500、1 000、1 500、2 000 r/min及超聲功率為100、200、300、400、500 W(超聲/停止時間為3 s/3 s)條件下緩緩加入到GLP-NE佐劑中至完全乳化。

1.3.3 不同乳化時間GLP-P72疫苗候選物的制備

將稀釋后的非洲豬瘟病毒P72抗原溶液在步驟1.3.2篩選的乳化設(shè)備參數(shù)條件下緩緩加入到GLP-NE佐劑中乳化，分別在不同時間取樣檢測。

1.3.4 離心穩(wěn)定性

吸取樣品10 mL裝入15 mL透明離心管中，放入離心機中，10 000 r/min，(4±2)℃、(23±2)℃離心20 min，觀察免疫制劑是否出現(xiàn)分層、破乳、渾濁及沉淀析出等現(xiàn)象。

1.3.5 貯藏穩(wěn)定性

吸取樣品10 mL密封于西林瓶中，分別貯藏于(4±2)℃、(37±2)℃條件下，每隔7 d觀察免疫制劑是否出現(xiàn)分層、破乳、渾濁及沉淀析出等現(xiàn)象。

1.4 GLP-P72納米乳疫苗候選物檢驗

1.4.1 GLP-P72納米乳疫苗候選物結(jié)構(gòu)鑒定

使用紅色油溶性染料蘇丹紅Ⅲ和藍色水溶性染料亞甲基蘭在納米乳中擴散快慢來判斷，如果藍色的擴散速度大于紅色，則納米乳為水包油(O/W)型，反之為油包水(W/O)型。

1.4.2 GLP-P72納米乳疫苗候選物微觀形態(tài)及粒徑分布

取GLP-P72納米乳蒸餾水稀釋100倍，透射電鏡下觀察納米乳的微觀形態(tài)；使用激光粒度儀檢測納米乳液滴粒徑分布，通過圖像分析系統(tǒng)顯示出粒徑分布圖。

1.4.3 黏度檢測

納米乳取樣后用口徑1.2 mm的1 mL吸管吸取油乳劑1 mL，室溫下以垂直自然流出0.4 mL所需時間表示油乳劑的黏度。

1.4.4 組織病理學檢查

為了進一步研究GLP-NE佐劑的生物安全性，通過HE染色對小鼠的重要器官(心、肝、脾、肺、腎)進行病理學檢查。

1.4.5 動物免疫及檢測

將制備免疫制劑以肌肉注射方式免疫6～8周的雌性昆明鼠，空白組為100 μL PBS，每組5只，每只每次注射100 μL(抗原含量50 μg)，免疫2次間隔14 d，分別在初次免疫后第0、7、14、21、28、35、42、49天尾靜脈取血，間接ELISA法檢測血清抗體效價。

1.5 數(shù)據(jù)分析及圖形繪制

使用Graphpad Prism 8.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析和曲線圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 組方篩選

2.1.1 表面活性劑復配比例篩選

由圖1可知，固定Km為2∶1，Tween-80與Span-80質(zhì)量比為3∶1所制備的納米乳液乳區(qū)面積最大。

a. Tween-80∶Span-80=2∶1；b. Tween-80∶Span-80=3∶1；c. Tween-80∶Span-80=4∶1；d. Tween-80∶Span-80=5∶1。

2.1.2 Km值篩選

由圖2可知，微乳區(qū)大小順序為：Km(2∶1)>Km(3∶1)>Km(1∶1)>Km(1∶2)>Km(1∶3)，因此，確定Km值為2∶1。

2.1.3 組方確定

從形成納米乳區(qū)域最大的Km=2∶1(Tween-80∶Span-80=3∶1)的偽三元相圖(圖2b)中央選取5個點(NE1～NE5)的各組分比例作為乳液候選配方(表1)，檢測各組納米乳液的混合表面活性劑(Smix)含量、油相(O)含量、水相(W)含量、粒徑、PDI值、黏度和離心穩(wěn)定性。根據(jù)最佳黏度、粒徑、PDI值和離心穩(wěn)定性最終確定靈芝多糖納米乳的組方：混合表面活性劑(Tween-80、Span-80、PEG-400質(zhì)量比3∶1∶2)32%、油(Marcol-52)12%、水相(PBS)53%～55%、靈芝多糖1%～3%(均為質(zhì)量分數(shù))。

a. Km=3∶1；b. Km=2∶1；c. Km=1∶1；d. Km=1∶2；e. Km=1∶3。

表1 各組乳液配方參數(shù)

2.2 GLP-NE佐劑乳化方法探究

2.2.1 不同乳化方法對乳液粒徑和PDI值的影響

完全乳化后的納米乳在不同乳化方法下的參數(shù)變化，如圖3。納米乳液粒徑在1 500 r/min以內(nèi)隨著剪切攪拌轉(zhuǎn)數(shù)(圖3a)的增加而降低，當轉(zhuǎn)數(shù)達到1 500 r/min時PDI值最低，此時乳液粒徑為(173.3±0.33)nm。超聲功率(圖3b)在400 W時納米乳粒徑為(75.86±0.85)nm，PDI值為0.392；功率在300 W時PDI值為0.282，粒徑(96.21±0.54)nm。因此，以均一程度為判定標準，分別確定該佐劑在2種乳化方法下的最佳剪切轉(zhuǎn)速和超聲功率為1 500 r/min和300 W。

a. 不同剪切攪拌轉(zhuǎn)速對樣品參數(shù)的影響(內(nèi)插圖為不同攪拌轉(zhuǎn)速下乳液粒徑大小)；b. 不同超聲功率對樣品參數(shù)的影響(內(nèi)插圖為不同超聲功率下乳液粒徑大小)。

2.2.2 不同乳化時間對乳液粒徑、黏度和PDI值的影響

2種乳化方法下不同乳化時間的納米粒徑、黏度及PDI值見圖4。剪切攪拌乳化20 min時粒徑和PDI值在達到最低，分別為(169.4±0.28)nm和0.251后趨于穩(wěn)定(圖4a)。超聲乳化30 min時粒徑和PDI值均達到最低分別為(96.11±0.46)nm和0.274(圖4b)。超聲乳化法較剪切攪拌乳化法降低疫苗粒徑更為顯著，但還需要結(jié)合穩(wěn)定性試驗來驗證乳液參數(shù)的可靠性。

2.2.3 不同乳化方法對納米乳離心穩(wěn)定性的影響

分別以1 500 r/min、20 min和300 W、30 min制備的樣品在低溫、常溫條件下4 000 r/min離心20 min后均未出現(xiàn)破乳分層現(xiàn)象，見表2。剪切組疫苗在2種離心試驗后的黏度、粒徑和PDI參數(shù)數(shù)值均變化不大，超聲組疫苗常溫離心后參數(shù)變化波動，剪切攪拌法制備的納米乳穩(wěn)定性在離心試驗中優(yōu)于超聲乳化法。

表2 不同乳化方法疫苗離心穩(wěn)定性試驗

2.2.4 不同乳化方法對納米乳貯藏穩(wěn)定性的影響

不同方法制備的納米乳貯藏穩(wěn)定性如圖5所示。在(4±2)℃環(huán)境下靜置時，剪切組粒徑、PDI無顯著變化；超聲組在第42天檢測時出現(xiàn)分層、破乳現(xiàn)象，且粒徑、PDI值在儲存期間變化顯著。在(37±2)℃環(huán)境下靜置時，剪切組在第14天后出現(xiàn)分層，而超聲組在7 d后出現(xiàn)分層現(xiàn)象。在離心和靜置試驗中，剪切乳化法制備納米乳穩(wěn)定性優(yōu)于超聲組。因此，結(jié)合納米乳液均一度、離心穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性，確定GLP-NE佐劑乳化方法為1 500 r/min剪切攪拌20 min。

a. (4±2)℃條件下靜置對2組樣品參數(shù)的影響；b. (37±2)℃條件下靜置對2組樣品參數(shù)的影響。

2.2.5 不同佐劑疫苗樣品穩(wěn)定性比較

以剪切攪拌方法制備的不同濃度GLP-P72納米乳液與ISA201 VG、ISA61 VG、ISA15 VG穩(wěn)定性比較觀察免疫制劑樣品分層情況，見表3。從表中可知，在各組穩(wěn)定性試驗結(jié)果中，空白NE佐劑穩(wěn)定性與ISA61 VG佐劑相當，可在(4±2)℃環(huán)境下貯藏42 d以上。

表3 不同油乳佐劑疫苗樣品穩(wěn)定性試驗

2.3 GLP-P72納米乳疫苗候選物檢驗

2.3.1 GLP-P72納米乳疫苗候選物物理性狀檢驗

如圖6所示，藍色染料(亞甲基藍)在乳液中擴散程度高于紅色染料(蘇丹紅)，說明該佐劑為水包油(O/W)型佐劑(圖6a)。經(jīng)檢測后GLP-P72納米乳液滴粒徑為(167.4±0.1)nm，PDI值為0.253(圖6b)。GLP-P72納米乳液滴呈球形，大小較為均勻(圖6c)。0.4 mL的GLP-P72納米乳流出時間為4.2 s，黏度為4.2 s/0.4 mL。

a.納米乳結(jié)構(gòu)鑒別；b. 納米乳微觀形態(tài)；c. 納米乳液粒徑分布。

2.3.2 組織病理學檢查

通過HE染色對小鼠的重要器官(心、肝、脾、肺、腎)進行病理學觀察，結(jié)果如圖7所示，各組組織器官中均沒有發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化。

2.3.3 動物免疫及檢測

由于ISA201 VG和ISA15 VG佐劑制備的候選疫苗在14 d內(nèi)破乳分層，因此這2種佐劑不滿足兩次免疫使用條件。經(jīng)免疫后，小鼠產(chǎn)生IgG特異性抗體的水平如圖8所示，靈芝多糖濃度為1%～3%的GLP-NE佐劑組小鼠血清的P72特異性IgG抗體效價在第35天達到頂峰，抗體效價約為1∶128 000，顯著高于ISA61 VG佐劑組和無佐劑組。

ns表示P> 0.05；***P<0.001。

3 討論

疫苗佐劑研發(fā)過程中，多數(shù)研究者以油乳液為載體，引入不同活性成分提高佐劑效應，從而增強疫苗的免疫效果[6]。本研究選用Marcol-52，利用表面活性劑(Tween-80和Span-80)與助表面活性劑(PEG-400)復配制備納米乳液，該方法可最大限度地降低界面張力，增加界面膜的流動性和柔韌性，阻止油滴的聚集，有利于形成粒徑和PDI值更小、界面膜更穩(wěn)定的納米乳[7]。為深入研究納米乳液參數(shù)與穩(wěn)定性之間的關(guān)系，本研究還探究了超聲乳化法和剪切攪拌乳化法對納米乳液穩(wěn)定性的影響，超聲乳化法對降低納米乳中分散相尺寸的效果較剪切攪拌乳化法更為顯著，這是由于超聲對分散相的直接作用力大于剪切攪拌。然而，超聲乳化的作用力均勻程度低于剪切攪拌[9]，使得分散相液滴均一程度低于后者，導致穩(wěn)定性差，其參數(shù)變化表現(xiàn)為PDI值隨著超聲時間先下降后上升。動物試驗結(jié)果表明，GLP-NE組小鼠的抗原特異性IgG滴度顯著高于NE組，說明GLPs具有較強的體液免疫佐劑活性。Liu等[8]使用大豆磷脂、吐溫-80和膽固醇將靈芝多糖包封于脂質(zhì)體載體中，從而增強藥物對脾淋巴細胞增殖活性的刺激作用，與本研究結(jié)果相符，說明靈芝多糖可作為免疫調(diào)節(jié)劑引入納米乳載體中制備復合型佐劑。本研究采用納米乳佐劑作為載體，以靈芝多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑，制備了水包油型靈芝多糖納米乳佐劑，具有較好的穩(wěn)定性和免疫效果，后續(xù)還需采用其他病毒抗原進一步驗證佐劑效果，為研發(fā)安全、高效且易于使用的疫苗佐劑提供數(shù)據(jù)支撐。